Summary
Il protocollo descrive un metodo passo-passo per impostare un modello di pelle ferita ovina ex vivo infettata da Staphylococcus aureus. Questo modello ad alto rendimento simula meglio le infezioni in vivo rispetto alle tecniche di microbiologia convenzionali e presenta ai ricercatori una piattaforma fisiologicamente rilevante per testare l'efficacia degli antimicrobici emergenti.
Abstract
Lo sviluppo di antimicrobici è un processo costoso con tassi di successo sempre più bassi, il che rende meno attraenti ulteriori investimenti nella ricerca sulla scoperta di antimicrobici. La scoperta di farmaci antimicrobici e la successiva commercializzazione possono essere rese più redditizie se un approccio fail-fast-and-fail-cheap può essere implementato all'interno delle fasi di ottimizzazione del piombo in cui i ricercatori hanno un maggiore controllo sulla progettazione e la formulazione dei farmaci. In questo articolo, viene descritta la configurazione di un modello di pelle ferita ovina ex vivo infettata da Staphylococcus aureus, che è semplice, economica, ad alta produttività e riproducibile. La fisiologia batterica nel modello imita che durante l'infezione come proliferazione batterica dipende dalla capacità del patogeno di danneggiare il tessuto. L'instaurazione dell'infezione della ferita è verificata da un aumento della conta batterica vitale rispetto all'inoculo. Questo modello può essere utilizzato come piattaforma per testare l'efficacia degli antimicrobici emergenti nella fase di ottimizzazione del piombo. Si può sostenere che la disponibilità di questo modello fornirà ai ricercatori che sviluppano antimicrobici un modello fail-fast-and-fail-cheap, che contribuirà ad aumentare i tassi di successo nelle successive sperimentazioni sugli animali. Il modello faciliterà inoltre la riduzione e il perfezionamento dell'uso animale per la ricerca e, in ultima analisi, consentirà una traduzione più rapida ed economica di nuovi antimicrobici per le infezioni della pelle e dei tessuti molli in clinica.
Introduction
Le infezioni della pelle sono un importante problema globale, con grandi costi economici per gli operatori sanitari di tutto il mondo. Lo sviluppo della resistenza multifarmaco e la formazione di biofilm da parte di agenti patogeni gioca un ruolo chiave nella prevalenza di ferite non cicatrizzanti 1,2,3,4. Di conseguenza, le infezioni della pelle e dei tessuti molli sono uno dei motivi più comuni per il ricovero prolungato e la successiva riammissione5. I ritardi nella guarigione delle ferite sono costosi sia per il paziente che per gli operatori sanitari, con alcune stime che suggeriscono che circa 6,5 milioni di pazienti sono colpiti ogni anno negli Stati Uniti. Nel Regno Unito, le infezioni della pelle e le complicanze associate provocano circa 75.000 decessi all'anno 2,4,6.
Lo Staphylococcus aureus (S. aureus) è un formidabile patogeno della ferita spesso isolato dalle ferite del paziente 2,7. Il tasso di comparsa della resistenza multifarmaco è aumentato drasticamente negli anni 2000. Durante questo periodo, circa il 60% delle infezioni batteriche acute della pelle e della struttura della pelle erano positive alla coltura per S. aureus 1 resistente alla meticillina. Il crescente numero di ceppi multiresistenti tra gli stafilococchi e altri agenti patogeni negli ultimi 2 decenni indica un urgente bisogno di un rapido sviluppo di antibiotici con nuove modalità di azione in grado di superare la resistenza.
Tuttavia, dai primi anni 2000, i programmi di scoperta degli antibiotici sono stati dominati da tempi di sviluppo più lunghi e bassi tassi di successo, con solo il 17% dei nuovi antibiotici che entrano negli studi clinici negli Stati Uniti ottenendo l'approvazione del mercato8. Ciò suggerisce una disparità tra i risultati dei test in vitro sugli antibiotici emergenti e i loro risultati clinici. Si può sostenere che questa disparità è in gran parte dovuta alle differenze nella fisiologia batterica durante le infezioni in vivo e durante i metodi microbiologici convenzionali quando si verifica l'efficacia degli antibiotici nelle fasi precliniche in vitro . Pertanto, sono necessari nuovi metodi di laboratorio che siano più rappresentativi della fisiologia batterica durante l'infezione per migliorare le percentuali di successo nei programmi di scoperta di antibiotici.
I metodi attuali per studiare le infezioni cutanee includono studi su animali vivi (ad esempio, topi), modelli cutanei ex vivo (ad esempio, suini) e modelli cutanei 3D di ingegneria tissutale (ad esempio, umano)9,10,11,12. Gli studi su animali vivi sono strettamente regolamentati e hanno una produttività relativamente bassa. Nei modelli animali, ferite e infezioni causano disagio significativo agli animali e sollevano preoccupazioni etiche. I modelli di pelle umana, ex vivo o di ingegneria tissutale, richiedono l'approvazione etica, la conformità alla legislazione locale e globale (la legge sui tessuti umani, la dichiarazione di Helsinki) e vi è difficoltà nell'acquisizione di tessuti, con alcune richieste che richiedono anni per soddisfare13,14. Entrambi i tipi di modello sono ad alta intensità di manodopera e richiedono competenze significative per garantire il successo sperimentale. Alcuni attuali modelli di infezione cutanea ex vivo richiedono dischi pre-inoculati e additivi per il letto della ferita per consentire l'infezione; Sebbene questi modelli siano incredibilmente utili, ci sono limitazioni nel processo di infezione in quanto gli additivi limitano l'utilizzo del letto della ferita come fonte di nutrienti10,15,16,17. Il modello descritto in questo studio non utilizza additivi per il letto della ferita, il che garantisce che la patologia dell'infezione e la conta delle cellule vitali siano il risultato dell'utilizzo diretto del letto della ferita come unica fonte di nutrienti.
Data la necessità di nuovi metodi di laboratorio, è stato sviluppato un nuovo modello ex vivo di infezioni cutanee ovine, ad alto rendimento, da utilizzare nella valutazione dell'efficacia degli antibiotici emergenti. Gli studi sulle infezioni della pelle affrontano molte sfide: costi elevati, preoccupazioni etiche e modelli che non mostrano un quadro completo20,21. I modelli ex vivo e i modelli di espianto 3D consentono una migliore visualizzazione del processo patologico e dell'impatto che i trattamenti possono avere da un modello clinicamente più rilevante. Qui viene descritta la configurazione di un nuovo modello di pelle ovina, che è semplice, riproducibile e clinicamente rilevante e ha un alto rendimento. La pelle ovina è stata scelta poiché le pecore sono uno dei grandi mammiferi comunemente usati per modellare le risposte alle infezioni in vivo. Inoltre, sono facilmente reperibili dai macelli, garantendo una fornitura costante di pelle per la ricerca, e le loro carcasse non sono scottate, garantendo una buona qualità dei tessuti. Questo studio ha utilizzato S. aureus come patogeno esemplare; Tuttavia, il modello funziona bene con altri microrganismi.
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Protocol
Le teste di agnello del macello R.B Elliott and Son sono state utilizzate come fonte di campioni di pelle in questo progetto. Tutti gli agnelli venivano macellati per il consumo come cibo. Invece di scartare le teste, queste sono state riproposte per la ricerca. L'approvazione etica non era richiesta in quanto il tessuto proveniva da rifiuti scartati dai macelli.
1. Sterilizzazione
- Disinfettare le pinze prima della raccolta delle teste prendendo una pinza pulita ed eseguendo la sterilizzazione a calore secco in un forno a 200 °C per 1 ora. Autoclavare tutti i bicchieri a 121 °C per 15 minuti prima dell'uso.
- Eseguire tutto il lavoro descritto all'interno di un armadio di classe 2 di microbiologia. Preparare tutti i reagenti secondo le istruzioni del produttore.
2. Raccolta dei campioni
- Nel mattatoio, gli agnelli di Swaledale venivano macellati mediante stordimento usando l'elettricità o una pistola prigioniera ed essanguati. Raccogliere le teste di agnello non più di 4 ore dopo la macellazione.
3. Preparazione delle teste
- Disinfettare la sezione frontale dell'agnello versando circa 100 ml di soluzione di biossido di cloro da 200 ppm sull'area del campione. Rasare la sezione frontale della testa con tagliatrici elettriche e lavare l'area con 200 ml di soluzione di biossido di cloro da 200 ppm.
- Pulire l'area con etanolo e rotolo blu e coprire l'area del campione con crema depilatoria per 35 minuti. Raschiare delicatamente la crema depilatoria utilizzando uno strumento raschiante e valutare l'area del campione. Se rimane una quantità significativa di peli, ripetere il processo di depilazione.
- Utilizzare altri 200 ml di soluzione di biossido di cloro per risciacquare l'area, quindi risciacquare con etanolo e pulire con un rotolo blu.
- Utilizzando un punch bioptico sterile da 8 mm, ritagliare campioni di pelle da 8 mm dall'area preparata. Rimuovere i campioni utilizzando una pinza sterile e un bisturi a 15 lame, assicurando che tutto il grasso cutaneo venga rimosso.
- Mettere i campioni in un barattolo sterile da 0,5 L riempito con soluzione salina sterile tamponata con fosfato (PBS), quindi trasferirli in provette sterili da 50 ml con 50 ml di soluzione di biossido di cloro da 200 ppm, capovolgere due volte e lasciare sterilizzare per 30 minuti.
- Rimuovere i campioni dalla soluzione di biossido di cloro e lavarli mettendoli in una provetta da 50 mL riempita con 40 mL di PBS sterile. Una volta lavato, posizionare ogni singolo campione di pelle in un pozzetto separato di una piastra da 24 pozzetti.
- Aggiungere 350 μL di mezzo preriscaldato mantenendo il campione all'interfaccia aria-liquido. La composizione dei terreni è la seguente: terreni MK (Medium 199 con sali di Hanks, L-glutammato e 1,75 mg/mL di bicarbonato di sodio) e F12 di Ham in rapporto 1:1, con aggiunta di FBS (10% v/v), EGF (10 ng/mL), insulina (5 μg/mL), penicillina-streptomicina (100 U/mL) e amfotericina B (2,5 μg/mL).
- Sigillare le piastre a 24 pozzetti con una guarnizione a piastre permeabile ai gas e incubare a 37 °C in un incubatore tissutale umidificato al 5% di CO2 per un massimo di 24 ore.
4. Mantenimento dei campioni di pelle
- Dopo l'incubazione, rimuovere il terreno di coltura e sciacquare i campioni in 500 μL di PBS sterile. Aggiungere terreni privi di antibiotici a ciascun campione e incubare a 37 °C in un incubatore tissutale umidificato al 5% di CO2 per 24 ore per rimuovere gli antibiotici residui nel campione.
- Se la torbidità o l'infezione fungina si sviluppano nei mezzi privi di antibiotici dopo 24 ore, scartare il campione.
5. Preparazione dell'inoculo
- Preparare un tubo da 50 ml con 10 ml di brodo di soia triptico sterile. Prendi un piatto di agar fresco di S. aureus e usa un tampone per trasferire diverse colonie nel brodo. Incubare per 18 h a 37 °C a 150 giri/min.
- Centrifugare a 4.000 x g per 3 min. Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 10 ml di PBS sterile. Ripetere due volte per garantire un adeguato lavaggio delle cellule.
- Regolare l'inoculo a 0,6 OD600 in PBS sterile. Confermare il carico dell'inoculo eseguendo un conteggio manuale delle piastre vitali.
6. Infezione di campioni di pelle
- Preparare una piastra fresca a 24 pozzetti con 400 μL di terreno privo di antibiotici preriscaldato e aggiungere gli inserti a 24 pozzetti usando una pinza sterile.
- Rimuovere il terreno dai campioni di pelle, lavare con 500 μL di PBS sterile e rimuovere il lavaggio. Utilizzare una pinza sterile per tenere delicatamente il campione sul fondo del pozzetto.
- Utilizzare una biopsia di 4 mm per creare un lembo centrale della ferita, perforando fino a una profondità approssimativa di 1-2 mm. Quindi, utilizzare un bisturi a 15 lame e una pinza sterile dentata in tessuto allis per rimuovere lo strato superiore del lembo della ferita. La variabilità delle dimensioni della ferita può influenzare l'esito dell'infezione e le unità formanti colonie endpoint (CFU).
- Una volta che tutti i campioni sono stati feriti, trasferirli negli inserti a 24 pozzetti usando una pinza sterile. Pipettare 15 μL dell'inoculo batterico nel letto della ferita. Quindi, incubare per 24 ore a 37 °C in un incubatore tissutale umidificato al 5% di CO2 .
- Se sono necessari periodi di incubazione più lunghi, rimuovere il terreno e sostituirlo con terreno fresco ogni 24 ore e incubare nelle stesse condizioni.
7. Determinazione della carica batterica
- Rimuovere il supporto dal fondo dei pozzi. Con una pinza sterile, trasferire ciascun campione in una provetta separata da 50 ml riempita con 1 mL di PBS sterile.
- Utilizzare un omogeneizzatore a punta fine per omogeneizzare la superficie del campione. Fare attenzione a garantire che il letto della ferita sia a diretto contatto con la punta dell'omogeneizzatore.
- Omogeneizzare ogni campione per 35 s su medio/alto. L'omogeneizzatore stacca i batteri dalla superficie del letto della ferita per consentire l'enumerazione della carica batterica.
- Una volta elaborati tutti i campioni, eseguire a turno il pipettaggio di ciascun campione, a turno. Questo per garantire che l'omogenato batterico sia miscelato.
- Pipettare 20 μL di omogenato a vortice nel pozzetto corrispondente di una piastra da 96 pozzetti contenente 180 μL di PBS sterile.
- Diluire in serie ciascun omogenato di campione a 1 x 10−7 e pipettare 10 μL di omogenato diluito su una piastra triplice di agar di soia triplice.
- Incubare la piastra di agar per 18 ore a 37 °C. Quindi, contare il numero di colonie per determinare il CFU per ciascun campione.
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Representative Results
L'identificazione di un percorso per sterilizzare la pelle prima di impostare il modello di infezione della ferita è stata impegnativa. La sfida consisteva nel sterilizzare la pelle senza danneggiare i diversi strati cutanei, che possono quindi avere conseguenze indesiderate nell'esito dell'infezione. Per identificare un regime di sterilizzazione appropriato, sono stati provati diversi trattamenti per periodi di tempo variabili, come indicato nella Tabella 1. La contaminazione è stata registrata come lo sviluppo di torbidità dopo 48 ore nel mezzo MK utilizzato per mantenere i campioni di pelle. L'integrità dei tessuti è stata monitorata mediante istologia, seguita da colorazione con ematossilina ed eosina (H&E) immediatamente dopo il trattamento (Figura 1). Un trattamento di 30 minuti con biossido di cloro si è dimostrato il più efficace nel sterilizzare in modo riproducibile il tessuto cutaneo preservando l'integrità del tessuto.
Nella configurazione sperimentale, il tessuto sterile ferito viene posto nella camera apicale di un inserto a 24 pozzetti all'interfaccia aria-liquido (Figura 2A). Sono state tentate due diverse tecniche di ferimento: una tecnica di rimozione del lembo, in cui il tessuto viene ferito da uno strumento di biopsia a punch e lo strato superiore del tessuto ferito viene rimosso utilizzando una combinazione di un bisturi a 15 lame e una pinza sterile dentata in tessuto allis e una tecnica di graffio, in cui il tessuto viene ferito da uno strumento di biopsia a punch da solo. Sebbene il modello scratch ospitasse un numero medio più elevato di CFU dopo 24 ore, i risultati erano variabili. La tecnica di rimozione dei lembo ha prodotto risultati più coerenti (Figura 2C). Dopo 48 ore, circa 100 volte più CFU batteriche sono state recuperate dal tessuto ferito rispetto all'inoculo (Figura 2D). Si è ritenuto che ciò indicasse un'infezione riuscita. Una pellicola bianca nel letto della ferita era evidente sul tessuto 48 ore dopo l'infezione (Figura 2B). Le sezioni istologiche colorate di Gram del tessuto infetto hanno indicato la presenza di cellule di S. aureus nel letto della ferita (Figura 2E, F). Le sezioni istologiche colorate di Gram di tessuto non infetto sono fornite come comparatore (Figura 2G, H).
Dalla testa di un agnello, è possibile accedere realisticamente a una sezione di 100 cm2 (10 cm x 10 cm). Dato che ogni zona di pelle viene perforata dalla fronte utilizzando una biopsia circolare di 8 mm di diametro, è possibile ottenere circa 100 cerotti cutanei dalla fronte di un agnello a settimana. Procurarsi ulteriori teste di agnelli aumenta proporzionalmente il numero di campioni di pelle che possono essere ottenuti a settimana. Pertanto, si afferma che la procedura ha un throughput relativamente elevato. Per questo studio, 24 campioni di pelle sono stati ottenuti di routine a settimana. La pelle delle teste di vari agnelli è stata elaborata come repliche biologiche per tenere conto della potenziale variabilità da donatore a donatore. Durante la preparazione dei cerotti cutanei (fasi 3.1-3.8), il maggior consumo di tempo è l'incubazione di 30 minuti dei campioni di pelle nella soluzione di biossido di cloro e l'attesa di 2 x 35 minuti per il trattamento della crema depilatoria. L'uso della biopsia del punch per generare i 24 cerotti cutanei richiede circa 15 minuti. È questa volta che si scalerebbe linearmente se il numero di macchie cutanee fosse aumentato.
| Disinfettante | 10 minuti | 30 minuti | 60 minuti |
| 1% di disinfettante medico di alto livello per superfici | F | P | P |
| 1% disinfettante multiuso | F | F | P |
| 3% povidone | F | F | F |
| 5% povidone | F | P | P |
| 10% povidone | F | P | P |
| 70% etanolo | F | P | P |
| UV | F | F | F |
| 0,55% ipoclorito | F | P | P |
| 200 ppm di biossido di cloro | F | P | P |
Tabella 1: Sterilizzazione della pelle fresca di agnello. Ogni campione di pelle è stato lasciato nel disinfettante per il tempo specificato. F indica la mancata sterilizzazione del tessuto, con contaminazione batterica presente nei media. P indica passaggio, senza contaminazione batterica presente nei media.
Figura 1: Istologia della pelle ovina non infetta ex vivo trattata con disinfettanti (colorazione H&E) con ingrandimento 100x. (A) Campione di pelle di controllo con 30 minuti di trattamento in PBS. Si può vedere qualche spargimento epidermico, ma l'epidermide non viene interrotta. (B) Pelle ovina trattata con disinfettante medico di superficie all'1% per 30 minuti. Spargimento epidermico (freccia nera) insieme a qualche interruzione dello strato granuloso (freccia blu). (C) Pelle ovina trattata con povidone al 5% per 30 min. Qui si può vedere un danno moderato al tessuto, con spargimento epidermico dello strato corneo (freccia nera). C'è una minima interruzione degli strati epidermici sottostanti. (D) Pelle ovina trattata con povidone al 10% per 30 min. Gli strati superiori dell'epidermide sono stati danneggiati, con evidenza di spargimento (freccia nera) e assottigliamento (freccia verde). (E) Pelle ovina trattata con disinfettante multiuso al 2% per 30 min. Si possono osservare gravi danni al campione, con significativo spargimento epidermico (freccia nera) e completa eradicazione dello strato corneo (freccia rossa). F) Pelle ovina trattata con 200 ppm di biossido di cloro per 30 min. Si può vedere qualche spargimento epidermico, ma l'epidermide è intatta. G) Pelle ovina trattata con ipoclorito allo 0,6% per 30 min. È presente un grave danno all'epidermide, con un alto livello di spargimento epidermico (freccia nera) e l'eradicazione dell'epidermide in alcuni punti (freccia rossa). H) Pelle ovina trattata con etanolo al 70% per 30 minuti. Si possono vedere danni all'epidermide, con significativo spargimento epidermico (freccia nera). La barra della scala è di 200 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: Pelle ovina ex vivo infettata da S. aureus. (A) Schema della configurazione sperimentale. (B) Immagini di pelle ovina ex vivo prima dell'infezione (immagine a sinistra) e dopo 48 ore di infezione (immagine a destra). Si noti il film bianco presente dopo 48 ore di incubazione nel tessuto infetto, che è assente nel tessuto non infetto. (C) Testare l'effetto di diversi metodi di ferimento sulla conta finale dell'unità formante colonia (CFU) dopo l'omogeneizzazione. Rimozione del lembo (n = 6) e graffio (n = 9) infettati da S. aureus per 24 ore. Le barre di errore indicano una deviazione standard. Indica un valore p < 0,0001. (D) Testare l'effetto dei tempi di incubazione sulla conta dei CFU dopo l'omogeneizzazione. 24 ore di incubazione (n = 6) e 48 ore di incubazione (n = 12). Le barre di errore indicano una deviazione standard. Indica un valore p < 0,0001. (E,F) Immagini rappresentative dell'analisi istopatologica della pelle ovina infetta dopo l'infezione di 48 ore con una colorazione di Gram modificata (E) con ingrandimento 100x (barra di scala di 200 μm). La casella indica l'area ingrandita in (F) con un ingrandimento di 1.000x (barra della scala di 50 μm). Le frecce nere indicano i batteri. (G,H) Immagini rappresentative di analisi istopatologica di cute ovina non infetta dopo un periodo di 48 ore (controllo) con una colorazione gGram modificata (G) a ingrandimento 100x (barra di scala di 200 μm). La casella indica l'area ingrandita in (H) con ingrandimento 1.000x (barra della scala di 50 μm). L'analisi statistica è stata effettuata come un ANOVA a senso unico. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
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Discussion
Lo sviluppo di antimicrobici è un'impresa importante ma costosa che si stima costi circa 1 miliardo di dollari e richieda circa 15 anni per essere completata. Oltre il 90% della scoperta di farmaci antimicrobici e degli studi preclinici sull'efficacia dei farmaci antimicrobici sono condotti da ricercatori accademici e piccole e medie imprese con in genere meno di 50 dipendenti22. Questi team sono molto vincolati finanziariamente, il che rende disastroso il fallimento delle molecole guida nelle fasi successive della ricerca traslazionale. L'aumento della resistenza antimicrobica sta superando lo sviluppo di nuovi antimicrobici, il che intensifica ulteriormente la necessità di gestire responsabilmente gli investimenti già limitati nella ricerca antimicrobica23.
La disparità nella fisiologia batterica tra le infezioni in coltura in vivo e in vitro di laboratorio tende a causare una sovrastima dell'efficacia antimicrobica dei riscontri durante la fase di identificazione del piombo. Tale sovrastima contribuisce agli elevati tassi di abbandono osservati durante le fasi successive della traduzione. La disponibilità di piattaforme di test di efficacia antimicrobica in vitro che incorporano batteri con una fisiologia che imita meglio quella riscontrata durante le infezioni in vivo consentirà una stima più accurata dell'efficacia antimicrobica e fornirà ai ricercatori un maggiore controllo dell'ottimizzazione del piombo senza fare affidamento su sperimentazioni animali costose e strettamente regolamentate. Tali modelli ridurranno anche i tassi di abbandono durante le fasi successive della traduzione e potrebbero rendere la scoperta di farmaci antimicrobici più attraente per gli investimenti.
Questo modello di infezione della pelle ovina qui descritto è uno strumento utile che fornirà ai ricercatori un modello in vitro fisiologicamente rilevante di una ferita infetta per testare l'efficacia delle formulazioni antimicrobiche topiche emergenti nelle fasi precliniche. A differenza della maggior parte dei modelli di infezione ex vivo descritti nella letteratura scientifica 10,15,24,25,26,27,28, in questo modello, i patogeni esposti al tessuto ex vivo non sono integrati con terreni di coltura durante l'infezione. La proliferazione dei patogeni e la successiva infezione dipendono dalla capacità dell'organismo di danneggiare il tessuto. Pertanto, la fisiologia del patogeno in questo modello è più strettamente correlata a quella durante le infezioni in vivo rispetto alle colture microbiologiche convenzionali. Da questo modello si ottiene un'infezione altamente riproducibile, come giudicato dal numero di CFU recuperati dal tessuto dopo l'incubazione.
Con la pletora di equivalenti di pelle umana e modelli di ferite ex vivo umane e suine, l'uso di tessuto ovino in questo modello potrebbe essere superficialmente considerato un limite. Tuttavia, le pecore sono tra il gruppo di grandi animali utilizzati come modelli di infezioni in vivo 29,30,31. Inoltre, le pecore sono state utilizzate come surrogati per gli esseri umani nella ricerca immunologica e nello sviluppo di vaccini, indicando che le loro risposte immunitarie sono simili a quelle degli esseri umani32. Il processo di riparazione dei tessuti durante la guarigione delle ferite è simile nei grandi mammiferi, comprese le pecore e gli esseri umani33,34, e gli interventi per migliorare la guarigione delle ferite che sono stati dimostrati con successo nelle pecore sono stati suggeriti per la traduzione nell'uomo35,36,37. Pertanto, l'uso di pelle ovina ex vivo in questo modello di ferita non è una limitazione. Inoltre, questo modello ovino può essere giudicato un'alternativa affidabile ai modelli che incorporano pelle umana o suina per i seguenti motivi. La disponibilità di pelle umana è limitata e di qualità variabile quando disponibile38. L'epidermide umana di ingegneria tissutale e gli equivalenti cutanei viventi richiedono perfezionamenti nelle loro condizioni di coltura per garantire la riproducibilità nella fisiologia dei tessuti39. Sebbene la pelle suina sia più accessibile della pelle umana, la pelle suina ampiamente disponibile viene scottata come parte della lavorazione della carcassa nel mattatoio, che rimuove l'epidermide10. Per esperienza, la pelle suina non scottata è meno facilmente disponibile dai macelli.
In tutto il protocollo qui descritto, ci sono passaggi critici che garantiscono il successo del modello. Il passaggio più critico prevede la sterilizzazione del tessuto dopo la raccolta. La soluzione di biossido di cloro deve essere miscelata con i campioni di tessuto e deve essere consentito un tempo di contatto di 30 minuti per disinfettare sufficientemente il tessuto e rimuovere i contaminanti. Inoltre, durante l'impostazione di questo esperimento, possono verificarsi torbidità o contaminazione fungina a causa di una manipolazione impropria o di un trattamento inefficace con disinfettanti e mezzi antibiotici. In tal caso, i campioni che sviluppano torbidità devono essere scartati. Per ridurre lo sviluppo di torbidità e contaminazione, l'ambiente di laboratorio deve essere mantenuto pulito, con frequenti sterilizzazioni dell'incubatore, l'uso di punte filtranti e garantendo la completa sterilizzazione degli strumenti e dei contenitori utilizzati con i campioni. Un altro passo critico nel protocollo è quando il punzone bioptico da 4 mm viene utilizzato per ferire il tessuto. L'uso di questo strumento consente letti di ferite di dimensioni simili per garantire la ripetibilità e la riproducibilità del protocollo. La variabilità delle dimensioni del letto della ferita influisce sull'endpoint CFU. Quando c'è un'adeguata rimozione del lembo di tessuto, i risultati sono molto più coerenti. Un ulteriore passo critico associato all'integrità del conteggio dei CFU endpoint è l'uso dell'omogeneizzatore a punta fine per liberare le cellule batteriche. Si è visto che la posizione della punta dell'omogeneizzatore ha un impatto sul conteggio dei CFU da campione a campione; Quando la punta è stata posizionata correttamente direttamente sul letto della ferita, c'era molta meno variabilità osservata da campione a campione.
Tuttavia, il modello qui proposto non è privo di limitazioni. Questo modello ha limitazioni inerenti a tutti gli studi ex vivo (cioè la mancanza di flusso vascolare attivo, l'assenza di microbiota commensale, che può modulare il progresso dell'infezione e l'assenza di cellule immunitarie). Si può sostenere che, poiché il modello di ferita ex vivo non incorpora cellule immunitarie attive, la progressione dell'infezione in vivo in presenza di queste cellule potrebbe essere diversa da quella osservata nei modelli ex vivo. Indipendentemente da ciò, i modelli ex vivo forniscono una superficie tissutale per l'attaccamento e una fonte di nutrienti per i batteri e presentano una barriera di diffusione 3D alle formulazioni, che consente una valutazione più accurata dell'efficacia antimicrobica rispetto alle tecniche di coltura microbiologica convenzionali.
Un vantaggio chiave del modello è che il tessuto proviene da agnelli coltivati per il consumo umano. Più in particolare, il modello riutilizza la pelle dalle teste degli agnelli, che di solito vengono scartati. Inoltre, il modello ha un'elevata produttività e consente studi comparativi economici, rapidi e riproducibili. Si può sostenere che la disponibilità di questo modello ridurrà e perfezionerà la necessità di animali appositamente allevati per la ricerca traslazionale in linea con i principi delle tre R, che facilitano pratiche di ricerca più umane. Sebbene il modello qui descritto incorpori S. aureus come patogeno esemplare, il modello può essere utilizzato con altri microrganismi tra cui altri batteri, funghi e virus, ampliando così la portata dello sviluppo di farmaci che il modello consente. Si può prevedere che l'uso di questo modello consentirà la rapida traduzione di antibiotici tanto necessari per le infezioni della pelle, fornendo ai ricercatori un maggiore controllo sulla progettazione e la formulazione dei farmaci nelle fasi precliniche.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare
Acknowledgments
Gli autori desiderano ringraziare EPSRC (EP/R513313/1) per il finanziamento. Gli autori desiderano anche ringraziare R.B Elliot e Son Abattoir a Calow, Chesterfield, per aver fornito teste di agnelli e per essere stati così accomodanti nelle prime fasi del progetto, Kasia Emery per il suo supporto durante lo sviluppo di questo protocollo e Fiona Wright del Dipartimento di infezione, immunità e malattie cardiovascolari dell'Università di Sheffield per l'elaborazione dei campioni istologici e per essere stata così incredibilmente utile durante questo progetto.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24 Well Companion Plate | SLS | 353504 | |
| 4 mm Biopsy Punch | Williams Medical | D7484 | |
| 50 ml centrifuge tubes | Fisher Scientific | 10788561 | |
| 8 mm Biopsy Punch | Williams Medical | D7488 | |
| Amphotericin B solution, sterile | Sigma | A2942 | |
| Colour Pro Style Cordless Hair Clipper | Wahl | 9639-2117X | Hair Clippers |
| Dual Oven Incubator | SLS | OVe1020 | Sterilising oven |
| Epidermal growth factor | SLS | E5036-200UG | |
| Ethanol | Honeywell | 458600-2.5L | |
| F12 HAM | Sigma | N4888 | |
| Foetal bovine serum | Labtech International | CA-115/500 | |
| Forceps | Fisher Scientific | 15307805 | |
| Hair Removal Cream | Veet | Not applicable | |
| Heracell VIOS 160i | Thermo Scientific | 15373212 | Tissue culture incubator |
| Heraeus Megafuge 16R | VWR | 521-2242 | Centrifuge |
| Homogenizer 220, Handheld | Fisher Scientific | 15575809 | |
| Homogenizer 220, plastic blending cones | Fisher Scientific | 15585819 | |
| Insert Individual 24 well 0.4um membrane | VWR International | 353095 | |
| Insulin, recombinant Human | SLS | 91077C-1G | |
| Medium 199 (MK media) | Sigma | M0393 | |
| Microplate, cell culture Costar 96 well | Fisher Scientific | 10687551 | |
| Multitron | Infors | Not applicable | Bacterial incubator |
| PBS tablets | Sigma | P4417-100TAB | |
| Penicillin-Streptomycin | SLS | P0781 | |
| Plate seals | Fisher Scientific | ESI-B-100 | |
| Safe 2020 | Fisher Scientific | 1284804 | Class II microbiology safety cabinet |
| Scalpel blade number 15 | Fisher Scientific | O305 | |
| Scalpel Swann Morton | Fisher Scientific | 11849002 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma | S5761-1KG | |
| Toothed Allis Tissue Forceps | Rocialle | RSPU500-322 | |
| Tryptic Soy Agar | Merck Life Science UK Limited | 14432-500G-F | |
| Tryptic Soy Broth | Merck Life Science UK Limited | 41298-500G-F | |
| Vimoba Tablets | Quip Labs | VMTAB75BX |
References
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