Summary
O protocolo descreve um método passo-a-passo para configurar um modelo de pele ferida ovina ex vivo infectada com Staphylococcus aureus. Este modelo de alto rendimento simula melhor infecções in vivo em comparação com técnicas convencionais de microbiologia e apresenta aos pesquisadores uma plataforma fisiologicamente relevante para testar a eficácia de antimicrobianos emergentes.
Abstract
O desenvolvimento de antimicrobianos é um processo caro com taxas de sucesso cada vez mais baixas, o que torna menos atraente o investimento adicional em pesquisa de descoberta de antimicrobianos. A descoberta de medicamentos antimicrobianos e a subsequente comercialização podem se tornar mais lucrativas se uma abordagem de falhar rápido e falhar barato puder ser implementada dentro dos estágios de otimização de leads, onde os pesquisadores têm maior controle sobre o design e a formulação de medicamentos. Neste artigo, descreve-se a configuração de um modelo de pele ferida ovina ex vivo infectado com Staphylococcus aureus, que é simples, econômico, de alto rendimento e reprodutível. A fisiologia bacteriana no modelo imita que durante a infecção como proliferação bacteriana é dependente da capacidade do patógeno de danificar o tecido. O estabelecimento da infecção da ferida é verificado por um aumento na contagem bacteriana viável em comparação com o inóculo. Este modelo pode ser usado como uma plataforma para testar a eficácia de antimicrobianos emergentes no estágio de otimização de chumbo. Pode-se argumentar que a disponibilidade desse modelo fornecerá aos pesquisadores que desenvolvem antimicrobianos um modelo de falha rápida e falha barata, o que ajudará a aumentar as taxas de sucesso em testes subsequentes com animais. O modelo também facilitará a redução e o refinamento do uso de animais para pesquisa e, em última análise, permitirá uma tradução mais rápida e econômica de novos antimicrobianos para infecções de pele e tecidos moles para a clínica.
Introduction
As infecções de pele são uma questão global importante, com grandes custos econômicos para os profissionais de saúde em todo o mundo. O desenvolvimento de multirresistência e formação de biofilme por patógenos desempenha um papel fundamental na prevalência de feridas não cicatrizantes 1,2,3,4. Como resultado disso, as infecções de pele e tecidos moles são um dos motivos mais comuns para a hospitalização prolongada e posterior readmissão5. Atrasos na cicatrização de feridas são caros tanto para o paciente quanto para os profissionais de saúde, com algumas estimativas sugerindo que cerca de 6,5 milhões de pacientes são afetados anualmente nos EUA. No Reino Unido, infecções de pele e complicações associadas resultam em aproximadamente 75.000 mortes anuais 2,4,6.
Staphylococcus aureus (S. aureus) é um formidável patógeno de feridas frequentemente isolado de feridas de pacientes 2,7. A taxa de emergência de multirresistência aumentou drasticamente na década de 2000. Durante esse período, cerca de 60% das infecções bacterianas agudas da pele e da estrutura da pele foram positivas para S. aureusresistente à meticilina 1. O crescente número de cepas multirresistentes entre os estafilococos, e de fato outros patógenos, nas últimas 2 décadas indica uma necessidade urgente de rápido desenvolvimento de antibióticos com novos modos de ação que possam superar a resistência.
No entanto, desde o início dos anos 2000, os programas de descoberta de antibióticos têm sido dominados por tempos de desenvolvimento mais longos e baixas taxas de sucesso, com apenas 17% dos novos antibióticos que entram em ensaios clínicos nos EUA alcançando aprovação no mercado8. Isso sugere uma disparidade entre os resultados dos testes in vitro de antibióticos emergentes e seus resultados clínicos. Pode-se argumentar que essa disparidade se deve em grande parte a diferenças na fisiologia bacteriana durante infecções in vivo e durante métodos microbiológicos convencionais ao testar a eficácia de antibióticos nos estágios pré-clínicos in vitro . Portanto, novos métodos laboratoriais que são mais representativos da fisiologia bacteriana durante a infecção são necessários para melhorar as taxas de sucesso em programas de descoberta de antibióticos.
Os métodos atuais para o estudo de infecções de pele incluem estudos em animais vivos (por exemplo, camundongos), modelos de pele ex vivo (por exemplo, suínos) e modelos de pele 3D projetados por tecidos (por exemplo, humanos)9,10,11,12. Estudos em animais vivos são estritamente regulamentados e têm rendimento relativamente baixo. Em modelos animais, ferimentos e infecções causam sofrimento significativo aos animais e levantam preocupações éticas. Os modelos de pele humana, ex vivo ou de engenharia de tecidos, requerem aprovação ética, conformidade com a legislação local e global (Lei de Tecidos Humanos, Declaração de Helsinque) e há dificuldade em adquirir tecidos, com algumas solicitações levando anos para serem atendidas13,14. Ambos os tipos de modelos são trabalhosos e exigem conhecimentos significativos para garantir o sucesso experimental. Alguns modelos atuais de infecção cutânea ex vivo requerem discos pré-inoculados e aditivos para o leito da ferida para permitir a infecção; embora esses modelos sejam incrivelmente úteis, há limitações no processo de infecção, pois os aditivos limitam a utilização do leito da ferida como fonte de nutrientes10,15,16,17. O modelo descrito neste estudo não utiliza aditivos para o leito da ferida, o que garante que a patologia da infecção e a contagem de células viáveis sejam resultado da utilização direta do leito da ferida como única fonte de nutrientes.
Dada a necessidade de novos métodos laboratoriais, foi desenvolvido um novo modelo ovino ex vivo de alto rendimento de infecções de pele para uso na avaliação da eficácia de antibióticos emergentes. Os estudos de infecção cutânea enfrentam muitos desafios - altos custos, preocupações éticas e modelos que não mostram um quadro completo20,21. Modelos ex vivo e modelos explante 3D permitem uma melhor visualização do processo da doença e do impacto que os tratamentos podem ter a partir de um modelo clinicamente mais relevante. Aqui, a configuração de um novo modelo de pele ovina é descrita, que é simples, reprodutível e clinicamente relevante e tem alto rendimento. A pele ovina foi escolhida porque as ovelhas são um dos grandes mamíferos comumente usados para modelar respostas a infecções in vivo. Além disso, eles estão prontamente disponíveis nos matadouros, garantindo um suprimento constante de pele para pesquisa, e suas carcaças não são escaldadas, garantindo uma boa qualidade do tecido. Este estudo utilizou S. aureus como patógeno exemplar; no entanto, o modelo funciona bem com outros microrganismos.
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Protocol
Cabeças de cordeiro do matadouro R.B Elliott e Son foram utilizadas como fonte de amostras de pele neste projeto. Todos os cordeiros foram abatidos para consumo como alimento. Em vez de descartar as cabeças, estas foram reaproveitadas para pesquisa. A aprovação ética não foi necessária, pois o tecido era proveniente de resíduos descartados de matadouros.
1. Esterilização
- Desinfetar a pinça antes da recolha das cabeças, tomando pinças limpas e realizando esterilização a seco a quente num forno a 200 °C durante 1 h. Autoclave todos os artigos de vidro a 121 °C durante 15 minutos antes da utilização.
- Realizar todo o trabalho descrito dentro de um gabinete de classe 2 de microbiologia. Prepare todos os reagentes de acordo com as instruções do fabricante.
2. Coleta de amostras
- No matadouro, os cordeiros Swaledale eram abatidos por atordoamento usando eletricidade ou uma pistola de parafuso cativo e exsanguinados. Recolher cabeças de borrego não mais de 4 h após o abate.
3. Preparação das cabeças
- Desinfetar a secção da testa do borrego derramando aproximadamente 100 ml de solução de dióxido de cloro a 200 ppm na área da amostra. Raspe a seção da testa da cabeça usando cortadores elétricos e lave a área com 200 mL de solução de dióxido de cloro de 200 ppm.
- Limpe a área com etanol e rolo azul e cubra a área da amostra com creme de depilação por 35 min. Raspe suavemente o creme de depilação usando uma ferramenta de raspagem e avalie a área da amostra. Se uma quantidade significativa de pelos permanecer, repita o processo de depilação.
- Use mais 200 mL de solução de dióxido de cloro para enxaguar a área e, em seguida, enxaguar com etanol e limpar com um rolo azul.
- Usando um punch de biópsia estéril de 8 mm, corte amostras de pele de 8 mm da área preparada. Remova as amostras usando pinça estéril e um bisturi de 15 lâminas, garantindo que toda a gordura cutânea seja removida.
- Coloque as amostras em um frasco estéril de 0,5 L preenchido com solução salina estéril tamponada com fosfato (PBS) e, em seguida, transfira-as para tubos estéreis de 50 mL com 50 mL de solução de dióxido de cloro de 200 ppm, inverta duas vezes e deixe esterilizar por 30 min.
- Retire as amostras da solução de dióxido de cloro e lave-as colocando-as num tubo de 50 ml preenchido com 40 ml de PBS estéril. Uma vez lavado, coloque cada amostra de pele individual em um poço separado de uma placa de 24 poços.
- Adicionar 350 μL de meio pré-aquecido, mantendo a amostra na interface ar-líquido. A composição do meio é a seguinte: MK (Meio 199 com sais de Hanks, L-glutamato e 1,75 mg/mL de bicarbonato de sódio) e F12 de Ham, na proporção de 1:1, com adição de FBS (10% v/v), EGF (10 ng/mL), insulina (5 μg/mL), penicilina-estreptomicina (100 U/mL) e anfotericina B (2,5 μg/mL).
- Selar as placas de 24 poços com uma vedação de placa permeável a gás e incubar a 37 °C em uma incubadora de tecido de CO2 a 5% umidificada por até 24 h.
4. Manutenção de amostras de pele
- Após a incubação, retirar o meio de cultura e enxaguar as amostras em 500 μL de PBS estéril. Adicionar meios isentos de antibióticos a cada amostra e incubar a 37 °C numa incubadora de tecido de CO2 a 5% humidificada durante 24 h para remover os antibióticos residuais da amostra.
- Se turbidez ou infecção fúngica se desenvolverem no meio livre de antibióticos após 24 h, descarte a amostra.
5. Preparação do inóculo
- Prepare um tubo de 50 mL com 10 mL de caldo de soja tríptico estéril. Pegue um prato de ágar fresco de S. aureus e use um cotonete para transferir várias colônias para o caldo. Incubar durante 18 h a 37 °C a 150 rpm.
- Centrífuga a 4.000 x g por 3 min. Remova o sobrenadante e ressuspenda o pellet celular em 10 mL de PBS estéril. Repita duas vezes para garantir a lavagem adequada das células.
- Ajustar o inóculo para 0,6 OD600 em PBS estéril. Confirme a carga de inóculo realizando uma contagem manual de placas viáveis.
6. Infecção de amostras de pele
- Prepare uma placa fresca de 24 poços com 400 μL de meio pré-aquecido livre de antibióticos e adicione as inserções de 24 poços usando pinça estéril.
- Remova o meio das amostras de pele, lave com 500 μL de PBS estéril e remova a lavagem. Use pinças estéreis para segurar suavemente a amostra no fundo do poço.
- Use uma biópsia por punção de 4 mm para fazer um retalho central da ferida, perfurando até uma profundidade aproximada de 1-2 mm. Em seguida, use um bisturi de 15 lâminas e pinças de tecido allis dentadas estéreis para remover a camada superior do retalho da ferida. A variabilidade nas dimensões da ferida pode afetar o desfecho da infecção e as unidades formadoras de colônias (UFC) do desfecho.
- Uma vez que todas as amostras tenham sido feridas, transfira-as para as inserções de 24 poços usando pinça estéril. Pipetar 15 μL do inóculo bacteriano para o leito da ferida. Em seguida, incubar por 24 h a 37 °C em uma incubadora de tecido de CO2 a 5% umidificada.
- Se forem necessários períodos de incubação mais longos, remova o meio e substitua-o por um meio fresco a cada 24 horas e incube nas mesmas condições.
7. Determinação da carga bacteriana
- Remova a mídia do fundo dos poços. Com pinça estéril, transfira cada amostra para um tubo separado de 50 mL preenchido com 1 mL de PBS estéril.
- Use um homogeneizador de ponta fina para homogeneizar a superfície da amostra. Tome cuidado para garantir que o leito da ferida esteja em contato direto com a ponta do homogeneizador.
- Homogeneizar cada amostra por 35 s em médio/alto. O homogeneizador desprende as bactérias da superfície do leito da ferida para permitir a enumeração da carga bacteriana.
- Uma vez que todas as amostras são processadas, vórtice cada amostra, por sua vez, antes da pipetagem. Isso é para garantir que o homogeneizado bacteriano seja misturado.
- Pipetar 20 μL de homogeneizado vórtice para o poço correspondente de uma placa de 96 poços contendo 180 μL de PBS estéril.
- Diluir serialmente cada homogeneizado da amostra para 1 x 10−7 e pipetar 10 μL do homogeneizado diluído para uma placa tríptica de ágar soja em triplicat.
- Incubar a placa de ágar durante 18 h a 37 °C. Em seguida, conte o número de colônias para determinar a UFC para cada amostra.
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Representative Results
A identificação de uma via para esterilizar a pele antes da configuração do modelo de infecção da ferida foi um desafio. O desafio estava em esterilizar a pele sem danificar as diferentes camadas da pele, que podem então ter consequências não intencionais no resultado da infecção. Para identificar um regime de esterilização adequado, diferentes tratamentos foram tentados por diferentes períodos de tempo, conforme descrito na Tabela 1. A contaminação foi registrada como o desenvolvimento de turbidez após 48 h no meio MK utilizado para a manutenção das amostras de pele. A integridade tecidual foi monitorada por histologia seguida de coloração com hematoxilina e eosina (H&E) imediatamente após o tratamento (Figura 1). Um tratamento de 30 minutos com dióxido de cloro provou ser o mais eficaz na esterilização reprodutível do tecido cutâneo, preservando a integridade do tecido.
Na configuração experimental, o tecido estéril ferido é colocado na câmara apical de uma inserção de 24 poços na interface ar-líquido (Figura 2A). Duas técnicas diferentes de ferimento foram tentadas - uma técnica de remoção de retalho, na qual o tecido é ferido por uma ferramenta de biópsia por punção e a camada superior do tecido ferido é removida usando uma combinação de um bisturi de 15 lâminas e pinças de tecido allis dentadas estéreis, e uma técnica de arranhão, na qual o tecido é ferido apenas por uma ferramenta de biópsia por punção. Embora o modelo scratch tenha abrigado um maior número médio de UFCs após 24 h, os resultados foram variáveis. A técnica de remoção do retalho produziu resultados mais consistentes (Figura 2C). Após 48 h, aproximadamente 100 vezes mais UFCs bacterianas foram recuperadas do tecido ferido em comparação com o inóculo (Figura 2D). Isso foi considerado como indicando uma infecção bem-sucedida. Um filme branco no leito da ferida foi evidente no tecido 48 h após a infecção (Figura 2B). Cortes histológicos corados por Gram do tecido infectado indicaram a presença de células de S. aureus no leito da ferida (Figura 2E,F). Seções histológicas coradas de grama de tecido não infectado são fornecidas como comparador (Figura 2G,H).
A partir da cabeça de um cordeiro, uma seção de 100 cm2 (10 cm x 10 cm) pode ser acessada de forma realista. Dado que cada pedaço de pele é perfurado para fora da testa usando uma biópsia circular de 8 mm de diâmetro, aproximadamente 100 manchas de pele podem ser obtidas da testa de um cordeiro por semana. A aquisição de mais cabeças de cordeiro aumenta proporcionalmente o número de amostras de pele que podem ser obtidas por semana. Assim, alega-se que o procedimento é relativamente alto rendimento. Para este estudo, foram obtidas 24 amostras de pele rotineiramente por semana. A pele de várias cabeças de cordeiro foi processada como réplicas biológicas para explicar a variabilidade potencial doador para doador. Durante a preparação das manchas de pele (etapas 3.1-3.8), o maior consumo de tempo é a incubação de 30 minutos das amostras de pele na solução de dióxido de cloro e a espera de 2 x 35 minutos para o tratamento com creme de depilação. O uso de biópsia por punção para gerar as 24 manchas na pele leva cerca de 15 minutos. É desta vez que aumentaria linearmente se o número de manchas na pele fosse aumentado.
| Desinfetante | 10 min | 30 min | 60 min |
| 1% de desinfetante de superfície médica de alto nível | F | P | P |
| 1% de desinfetante multiuso | F | F | P |
| 3% povidona | F | F | F |
| 5% povidona | F | P | P |
| 10% povidona | F | P | P |
| 70% etanol | F | P | P |
| UV | F | F | F |
| 0,55% hipoclorito | F | P | P |
| 200 ppm de dióxido de cloro | F | P | P |
Tabela 1: Esterilização da pele fresca de cordeiro. Cada amostra de pele foi deixada no desinfetante pelo tempo especificado. F denota falha na esterilização do tecido, com contaminação bacteriana presente no meio. P denota passagem, sem contaminação bacteriana presente no meio.
Figura 1: Histologia da pele ovina não infectada ex vivo tratada com desinfetantes (coloração H&E) com aumento de 100x. (A) Amostra de pele de controle com tratamento de 30 min em PBS. Algum derramamento epidérmico pode ser visto, mas a epiderme não é interrompida. (B) Pele ovina tratada com 1% de desinfetante de superfície médica de alto nível por 30 min. Derramamento epidérmico (seta preta), juntamente com alguma ruptura no estrato granuloso (seta azul). (C) Pele ovina tratada com povidona a 5% por 30 min. Danos moderados ao tecido podem ser vistos aqui, com derramamento epidérmico do estrato córneo (seta preta). Há uma interrupção mínima nas camadas epidérmicas subjacentes. (D) Pele ovina tratada com povidona a 10% por 30 min. As camadas superiores da epiderme foram danificadas, com evidências de derramamento (seta preta) e afinamento (seta verde). (E) Pele ovina tratada com desinfetante multiuso a 2% por 30 min. Danos graves à amostra podem ser observados, com derramamento epidérmico significativo (seta preta) e erradicação completa do estrato córneo (seta vermelha). (F) Pele ovina tratada em dióxido de cloro de 200 ppm durante 30 min. Algum derramamento epidérmico pode ser visto, mas a epiderme está intacta. (G) Pele ovina tratada com hipoclorito a 0,6% por 30 min. Danos graves à epiderme estão presentes, com um alto nível de derramamento epidérmico (seta preta) e erradicação da epiderme em locais (seta vermelha). (H) Pele ovina tratada com etanol a 70% por 30 min. Danos à epiderme podem ser observados, com derramamento epidérmico significativo (seta preta). A barra de escala é de 200 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Pele ovina ex vivo infectada com S. aureus. (A) Esquema da configuração experimental. (B) Fotos de pele ovina ex vivo antes da infecção (imagem à esquerda) e pós-infecção 48 h (imagem à direita). Observe o filme branco presente após 48 h de incubação no tecido infectado, que está ausente no tecido não infectado. (C) Testando o efeito de diferentes métodos de ferimento na contagem da unidade formadora de colônias final (UFC) após a homogeneização. Remoção do retalho (n = 6) e arranhão (n = 9) infectado com S. aureus por 24 h. As barras de erro indicam desvio padrão. indica um valor de p < 0,0001. (D) Testando o efeito dos tempos de incubação nas contagens de UFC após homogeneização. 24 h de incubação (n = 6) e 48 h de incubação (n = 12). As barras de erro indicam desvio padrão. indica um valor de p < 0,0001. (E,F) Imagens representativas da análise histopatológica da pele ovina infectada pós-infecção por 48 h com coloração de Gram modificada (E) com ampliação de 100x (barra de escala de 200 μm). A caixa indica a área ampliada em (F) a uma ampliação de 1.000x (barra de escala de 50 μm). Setas pretas indicam bactérias. (G,H) Imagens representativas da análise histopatológica da pele ovina não infectada após um período de 48 h (controle) com coloração de gGram modificada (G) com ampliação de 100x (barra de escala de 200 μm). A caixa indica a área ampliada em (H) com ampliação de 1.000x (barra de escala de 50 μm). A análise estatística foi realizada como ANOVA one-way. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
O desenvolvimento de antimicrobianos é um empreendimento importante, mas caro, que é estimado em cerca de US $ 1 bilhão e leva cerca de 15 anos para ser concluído. Mais de 90% da descoberta de medicamentos antimicrobianos e estudos pré-clínicos de eficácia de medicamentos antimicrobianos são realizados por pesquisadores acadêmicos e pequenas e médias empresas com tipicamente menos de 50 funcionários22. Essas equipes são muito limitadas financeiramente, o que torna calamitosa a falha das moléculas de chumbo em estágios posteriores da pesquisa translacional. O aumento da resistência antimicrobiana está a ultrapassar o desenvolvimento de novos agentes antimicrobianos, o que intensifica ainda mais a necessidade de gerir de forma responsável o já limitado investimento na investigação antimicrobiana23.
A disparidade na fisiologia bacteriana entre infecções em culturas laboratoriais in vivo e in vitro tende a causar uma superestimação da eficácia antimicrobiana dos hits durante a fase de identificação do chumbo. Essa superestimação contribui para as altas taxas de atrito observadas durante os estágios subsequentes da tradução. A disponibilidade de plataformas de teste de eficácia antimicrobiana in vitro que incorporam bactérias com uma fisiologia que imita melhor as encontradas durante infecções in vivo permitirá uma estimativa mais precisa da eficácia antimicrobiana e proporcionará aos pesquisadores um maior controle da otimização do chumbo sem depender de testes em animais caros e rigidamente regulamentados. Tais modelos também diminuirão as taxas de atrito durante os estágios subsequentes de tradução e podem tornar a descoberta de medicamentos antimicrobianos mais atraente para o investimento.
Este modelo de infecção da pele ovina descrito aqui é uma ferramenta útil que fornecerá aos pesquisadores um modelo in vitro fisiologicamente relevante de uma ferida infectada para testar a eficácia de formulações antimicrobianas tópicas emergentes nos estágios pré-clínicos. Em contraste com a maioria dos modelos de infecção ex vivo descritos na literatura científica 10,15,24,25,26,27,28, nesse modelo, os patógenos expostos ao tecido ex vivo não são suplementados com meios de cultura durante a infecção. A proliferação de patógenos e a infecção subsequente dependem da capacidade do organismo de danificar o tecido. Portanto, a fisiologia do patógeno neste modelo está mais intimamente relacionada àquela durante infecções in vivo em comparação com as culturas microbiológicas convencionais. Uma infecção altamente reprodutível é obtida a partir deste modelo, conforme julgado pelo número de UFCs recuperadas do tecido após a incubação.
Com a infinidade de equivalentes de pele humana e modelos de feridas ex vivo humanos e suínos, o uso de tecido ovino neste modelo poderia ser superficialmente argumentado como uma limitação. No entanto, os ovinos estão entre o grupo de animais de grande porte utilizados como modelos de infecções in vivo 29,30,31. Além disso, ovinos têm sido utilizados como substitutos para humanos em pesquisas imunológicas e desenvolvimento de vacinas, indicando que suas respostas imunes são semelhantes às dos humanos32. O processo de reparo tecidual durante a cicatrização de feridas é semelhante em mamíferos de grande porte, incluindo ovinos e humanos 33,34, e intervenções para melhorar a cicatrização de feridas que foram demonstradas com sucesso em ovinos têm sido sugeridas para tradução para humanos35,36,37. Portanto, o uso de pele ovina ex vivo neste modelo de ferida não é uma limitação. Além disso, este modelo ovino pode ser considerado uma alternativa confiável aos modelos que incorporam pele humana ou suína pelas seguintes razões. A disponibilidade de pele humana é limitada e de qualidade variável quando disponível38. A epiderme humana modificada por tecidos e os equivalentes de pele viva requerem refinamentos em suas condições de cultivo para garantir a reprodutibilidade na fisiologia tecidual39. Embora a pele suína seja mais acessível do que a pele humana, a pele suína amplamente disponível é escaldada como parte do processamento de carcaça no matadouro, o que remove a epiderme10. Por experiência, a pele suína não escaldada está menos prontamente disponível em matadouros.
Ao longo do protocolo descrito aqui, existem etapas críticas que garantem o sucesso do modelo. A etapa mais crítica envolve a esterilização do tecido após a colheita. A solução de dióxido de cloro deve ser misturada com as amostras de tecido, e deve ser permitido um tempo de contacto de 30 minutos para desinfectar suficientemente o tecido e remover os contaminantes. Além disso, ao configurar este experimento, turbidez ou contaminação fúngica podem ocorrer devido ao manuseio inadequado ou tratamento ineficaz com desinfetantes e meios antibióticos. Nesse caso, as amostras que desenvolvem turbidez devem ser descartadas. Para reduzir o desenvolvimento de turbidez e contaminação, o ambiente laboratorial deve ser mantido limpo, com esterilização frequente da incubadora, uso de pontas filtrantes e garantia de esterilização completa das ferramentas e recipientes utilizados com as amostras. Outro passo crítico no protocolo é quando o punch de biópsia de 4 mm é usado para ferir o tecido. O uso dessa ferramenta permite leitos de feridas de tamanho semelhante para garantir a repetibilidade e a reprodutibilidade do protocolo. A variabilidade no tamanho do leito da ferida afeta a UFC do desfecho. Quando há remoção adequada do retalho tecidual, os resultados são muito mais consistentes. Um outro passo crítico associado à integridade da contagem de UFC do endpoint é o uso do homogeneizador de ponta fina para liberar células bacterianas. A posição da ponta do homogeneizador mostrou ter um impacto na contagem de UFC de amostra para amostra; quando a ponta foi corretamente colocada diretamente no leito da ferida, houve muito menos variabilidade observada de amostra para amostra.
No entanto, o modelo aqui proposto não é isento de limitações. Esse modelo tem limitações inerentes a todos os estudos ex vivo (ou seja, a falta de fluxo vascular ativo, a ausência de microbiota comensal, que pode modular o progresso da infecção, e a ausência de células imunes). Pode-se argumentar que, uma vez que o modelo de ferida ex vivo não incorpora células imunes ativas, a progressão da infecção in vivo na presença dessas células pode ser diferente da observada nos modelos ex vivo . Independentemente disso, os modelos ex vivo fornecem uma superfície de tecido para fixação e uma fonte de nutrientes para bactérias e apresentam uma barreira de difusão 3D para formulações, o que permite uma avaliação mais precisa da eficácia antimicrobiana do que as técnicas convencionais de cultura de microbiologia.
Uma das principais vantagens do modelo é que o tecido é proveniente de cordeiros que são cultivados para consumo humano. Mais particularmente, o modelo reaproveita a pele das cabeças dos cordeiros, que geralmente são descartadas. Além disso, o modelo tem alto rendimento e permite estudos comparativos econômicos, rápidos e reprodutíveis. Pode-se argumentar que a disponibilidade desse modelo reduzirá e refinará a necessidade de animais criados especificamente para pesquisa translacional, de acordo com os princípios dos três Rs, que facilitam práticas de pesquisa mais humanas. Embora o modelo descrito aqui incorpore S. aureus como o patógeno exemplar, o modelo pode ser usado com outros microrganismos, incluindo outras bactérias, fungos e vírus, ampliando assim o escopo de desenvolvimento de medicamentos que o modelo permite. Pode-se imaginar que o uso desse modelo permitirá a rápida tradução de antibióticos muito necessários para infecções de pele, proporcionando aos pesquisadores maior controle sobre o design e a formulação de medicamentos nos estágios pré-clínicos.
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Disclosures
Os autores não têm nada a divulgar
Acknowledgments
Os autores gostariam de agradecer ao EPSRC (EP/R513313/1) pelo financiamento. Os autores também gostariam de agradecer a R.B Elliot e Son Abattoir em Calow, Chesterfield, por fornecer cabeças de cordeiro e por serem tão complacentes nos estágios iniciais do projeto, Kasia Emery por seu apoio durante todo o desenvolvimento deste protocolo, e Fiona Wright do Departamento de Infecção, Imunidade e Doenças Cardiovasculares da Universidade de Sheffield por processar as amostras de histologia e ser tão incrivelmente útil ao longo deste projeto.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24 Well Companion Plate | SLS | 353504 | |
| 4 mm Biopsy Punch | Williams Medical | D7484 | |
| 50 ml centrifuge tubes | Fisher Scientific | 10788561 | |
| 8 mm Biopsy Punch | Williams Medical | D7488 | |
| Amphotericin B solution, sterile | Sigma | A2942 | |
| Colour Pro Style Cordless Hair Clipper | Wahl | 9639-2117X | Hair Clippers |
| Dual Oven Incubator | SLS | OVe1020 | Sterilising oven |
| Epidermal growth factor | SLS | E5036-200UG | |
| Ethanol | Honeywell | 458600-2.5L | |
| F12 HAM | Sigma | N4888 | |
| Foetal bovine serum | Labtech International | CA-115/500 | |
| Forceps | Fisher Scientific | 15307805 | |
| Hair Removal Cream | Veet | Not applicable | |
| Heracell VIOS 160i | Thermo Scientific | 15373212 | Tissue culture incubator |
| Heraeus Megafuge 16R | VWR | 521-2242 | Centrifuge |
| Homogenizer 220, Handheld | Fisher Scientific | 15575809 | |
| Homogenizer 220, plastic blending cones | Fisher Scientific | 15585819 | |
| Insert Individual 24 well 0.4um membrane | VWR International | 353095 | |
| Insulin, recombinant Human | SLS | 91077C-1G | |
| Medium 199 (MK media) | Sigma | M0393 | |
| Microplate, cell culture Costar 96 well | Fisher Scientific | 10687551 | |
| Multitron | Infors | Not applicable | Bacterial incubator |
| PBS tablets | Sigma | P4417-100TAB | |
| Penicillin-Streptomycin | SLS | P0781 | |
| Plate seals | Fisher Scientific | ESI-B-100 | |
| Safe 2020 | Fisher Scientific | 1284804 | Class II microbiology safety cabinet |
| Scalpel blade number 15 | Fisher Scientific | O305 | |
| Scalpel Swann Morton | Fisher Scientific | 11849002 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma | S5761-1KG | |
| Toothed Allis Tissue Forceps | Rocialle | RSPU500-322 | |
| Tryptic Soy Agar | Merck Life Science UK Limited | 14432-500G-F | |
| Tryptic Soy Broth | Merck Life Science UK Limited | 41298-500G-F | |
| Vimoba Tablets | Quip Labs | VMTAB75BX |
References
- Claeys, K. C., et al. Novel application of published risk factors for methicillin-resistant S. aureus in acute bacterial skin and skin structure infections. International Journal of Antimicrobial Agents. 51 (1), 43-46 (2018).
- Rahim, K., et al.
- Guest, J. F., Fuller, G. W., Vowden, P. Costs and outcomes in evaluating management of unhealed surgical wounds in the community in clinical practice in the UK: A cohort study. BMJ Open. 8 (12), 022591 (2018).
- Sen, C. K., et al. Human skin wounds: A major and snowballing threat to public health and the economy. Wound Repair and Regeneration. 17 (6), 763-771 (2009).
- Wilcox, M. H., Dryden, M. Update on the epidemiology of healthcare-acquired bacterial infections: Focus on complicated skin and skin structure infections. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 76, Supplement 4 (2021).
- Han, G., Ceilley, R. Chronic wound healing: A review of current management and treatments. Advances in Therapy. 34 (3), 599-610 (2017).
- Percival, S. L., Hill, K. E., Malic, S., Thomas, D. W., Williams, D. W. Antimicrobial tolerance and the significance of persister cells in recalcitrant chronic wound biofilms. Wound Repair and Regeneration. 19 (1), 1-9 (2011).
- Dheman, N., et al. An analysis of antibacterial drug development trends in the United States, 1980-2019. Clinical Infectious Diseases. 73 (11), 4444-4450 (2021).
- MacNeil, S., Shepherd, J., Smith, L. Production of tissue-engineered skin and oral mucosa for clinical and experimental use. Methods in Molecular Biology. 695, 129-153 (2011).
- Yang, Q., et al. Development of a novel ex vivo porcine skin explant model for the assessment of mature bacterial biofilms. Wound Repair and Regeneration. 21 (5), 704-714 (2013).
- Malachowa, N., Kobayashi, S. D., Lovaglio, J., Deleo, F. R. Mouse model of Staphylococcus aureus skin infection. Methods in Molecular Biology. 1031, 109-116 (2013).
- Brandenburg, K. S., Calderon, D. F., Kierski, P. R., Czuprynski, C. J., Mcanulty, J. F. Novel murine model for delayed wound healing using a biological wound dressing with Pseudomonas aeruginosa biofilms. Microbial Pathogenesis. 122, 30-38 (2018).
- Bledsoe, M. J., Grizzle, W. E. The use of human tissues for research: What investigators need to know. Alternatives to Laboratory Animals. , (2022).
- Danso, M. O., Berkers, T., Mieremet, A., Hausil, F., Bouwstra, J. A. An ex vivo human skin model for studying skin barrier repair. Experimental Dermatology. 24 (1), 48-54 (2015).
- Torres, J. P., et al. Ex vivo murine skin model for B. burgdorferi biofilm. Antibiotics. 9 (9), 1-18 (2020).
- Zhao, G., et al. Delayed wound healing in diabetic (db/db) mice with Pseudomonas aeruginosa biofilm challenge: A model for the study of chronic wounds. Wound Repair and Regeneration. 18 (5), 467-477 (2010).
- Schierle, C. F., Dela Garza, M., Mustoe, T. A., Galiano, R. D. Staphylococcal biofilms impair wound healing by delaying reepithelialization in a murine cutaneous wound model. Wound Repair and Regeneration. 17 (3), 354-359 (2009).
- Trøstrup, H., et al. Pseudomonas aeruginosa biofilm aggravates skin inflammatory response in BALB/c mice in a novel chronic wound model. Wound Repair and Regeneration. 21 (2), 292-299 (2013).
- Thompson, M. G., et al. Evaluation of gallium citrate formulations against a multidrug-resistant strain of Klebsiella pneumoniae in a murine wound model of infection. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 59 (10), 6484-6493 (2015).
- Maboni, G., et al. A novel 3D skin explant model to study anaerobic bacterial infection. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 404 (2017).
- Macneil, S. Progress and opportunities for tissue-engineered skin. Nature. 445 (7130), 874-880 (2007).
- Theuretzbacher, U., Outterson, K., Engel, A., Karlén, A. The global preclinical antibacterial pipeline. Nature Reviews Microbiology. 18 (5), 275-285 (2019).
- Miethke, M., et al. Towards the sustainable discovery and development of new antibiotics. Nature Reviews Chemistry. 5 (10), 726-749 (2021).
- Guedes, G. M. M., et al. Ex situ model of biofilm-associated wounds: Providing a host-like environment for the study of Staphylococcus aureus and Pseudomonas aeruginosa biofilms. Journal of Applied Microbiology. 131 (3), 1487-1497 (2021).
- Johnson, C. J., et al. Augmenting the activity of chlorhexidine for decolonization of Candida auris from porcine skin. Journal of Fungi. 7 (10), 804 (2021).
- Horton, M. V., et al. Candida auris Forms High-Burden Biofilms in Skin Niche Conditions and on Porcine Skin. mSphere. 5 (1), 00910-00919 (2020).
- Ashrafi, M., et al. Validation of biofilm formation on human skin wound models and demonstration of clinically translatable bacteria-specific volatile signatures. Scientific Reports. 8, 1-16 (2018).
- Brackman, G., Coenye, T. In vitro and in vivo biofilm wound models and their application. Advances in Experimental Medicine and Biology. 897, 15-32 (2016).
- Rumbaugh, K. P., Carty, N. L. In Vivo Models of Biofilm Infection. Biofilm Infections. , Springer. New York, NY. 267-290 (2011).
- Boase, S., Valentine, R., Singhal, D., Tan, L. W., Wormald, P. J. A sheep model to investigate the role of fungal biofilms in sinusitis: Fungal and bacterial synergy. International Forum of Allergy & Rhinology. 1 (5), 340-347 (2011).
- Williams, D. L., et al. Experimental model of biofilm implant-related osteomyelitis to test combination biomaterials using biofilms as initial inocula. Journal of Biomedical Materials Research. Part A. 100 (7), 1888-1900 (2012).
- Scheerlinck, J. P. Y., Snibson, K. J., Bowles, V. M., Sutton, P. Biomedical applications of sheep models: From asthma to vaccines. Trends in Biotechnology. 26 (5), 259-266 (2008).
- Metcalfe, A. D., Ferguson, M. W. J. Tissue engineering of replacement skin: The crossroads of biomaterials, wound healing, embryonic development, stem cells and regeneration. Journal of the Royal Society Interface. 4 (14), 413-417 (2007).
- Kazemi-Darabadi, S., Sarrafzadeh-Rezaei, F., Farshid, A. A., Dalir-Naghadeh, B. Allogenous skin fibroblast transplantation enhances excisional wound healing following alloxan diabetes in sheep, a randomized controlled trial. International Journal of Surgery. 12 (8), 751-756 (2014).
- Martinello, T., et al. Allogeneic mesenchymal stem cells improve the wound healing process of sheep skin. BMC Veterinary Research. 14 (1), 1-9 (2018).
- Roberts, C. D., Windsor, P. A. Innovative pain management solutions in animals may provide improved wound pain reduction during debridement in humans: An opinion informed by veterinary literature. International Wound Journal. 16 (4), 968 (2019).
- Mazzone, L., et al. Bioengineering and in utero transplantation of fetal skin in the sheep model: A crucial step towards clinical application in human fetal spina bifida repair. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 14 (1), 58-65 (2020).
- Olkowska, E., Gržinić, G. Skin models for dermal exposure assessment of phthalates. Chemosphere. 295, 133909 (2022).
- Couto, N., et al. Label-free quantitative proteomics and substrate-based mass spectrometry imaging of xenobiotic metabolizing enzymes in ex vivo human skin and a human living skin equivalent model. Drug Metabolism and Disposition. 49 (1), 39-52 (2021).
