Summary
Protokollen beskriver en trinnvis metode for å sette opp en ex vivo sau såret hudmodell infisert med Staphylococcus aureus. Denne høykapasitetsmodellen simulerer infeksjoner in vivo bedre sammenlignet med konvensjonelle mikrobiologiteknikker og presenterer forskere med en fysiologisk relevant plattform for å teste effekten av nye antimikrobielle stoffer.
Abstract
Utviklingen av antimikrobielle midler er en kostbar prosess med stadig lavere suksessrate, noe som gjør videre investeringer i antimikrobiell oppdagelsesforskning mindre attraktiv. Antimikrobiell legemiddeloppdagelse og påfølgende kommersialisering kan gjøres mer lukrativ hvis en fail-fast-and-fail-cheap tilnærming kan implementeres innenfor de ledende optimaliseringsstadiene der forskere har større kontroll over stoffdesign og formulering. I denne artikkelen beskrives oppsettet av en ex vivo ovine såret hudmodell infisert med Staphylococcus aureus, som er enkel, kostnadseffektiv, høy gjennomstrømning og reproduserbar. Bakteriefysiologien i modellen etterligner at under infeksjon som bakteriell spredning er avhengig av patogenets evne til å skade vevet. Etableringen av sårinfeksjon verifiseres ved en økning i levedyktige bakterietall sammenlignet med inokulum. Denne modellen kan brukes som en plattform for å teste effekten av nye antimikrobielle stoffer i blyoptimaliseringsstadiet. Det kan hevdes at tilgjengeligheten av denne modellen vil gi forskere som utvikler antimikrobielle stoffer med en fail-fast-and-fail-cheap modell, noe som vil bidra til å øke suksessraten i påfølgende dyreforsøk. Modellen vil også legge til rette for reduksjon og forbedring av dyrebruk for forskning og til slutt muliggjøre raskere og mer kostnadseffektiv oversettelse av nye antimikrobielle stoffer for hud- og bløtvevsinfeksjoner til klinikken.
Introduction
Hudinfeksjoner er et viktig globalt problem, med store økonomiske kostnader for helsepersonell over hele verden. Utvikling av multiresistens og biofilmdannelse av patogener spiller en nøkkelrolle i forekomsten av ikke-helbredende sår 1,2,3,4. Som et resultat av dette er hud- og bløtvevsinfeksjoner en av de vanligste årsakene til utvidet sykehusinnleggelse og påfølgende reinnleggelse5. Forsinkelser i sårheling er kostbare for både pasienten og helsepersonell, med noen estimater som tyder på at rundt 6,5 millioner pasienter påvirkes årlig i USA. I Storbritannia resulterer hudinfeksjoner og tilhørende komplikasjoner i omtrent 75 000 dødsfall årlig 2,4,6.
Staphylococcus aureus (S. aureus) er et formidabelt sårpatogen som ofte isoleres fra pasientsår 2,7. Fremveksten av multiresistens økte drastisk på 2000-tallet. I løpet av denne tiden var rundt 60% av akutte bakterielle hud- og hudstrukturinfeksjoner dyrkningspositive for meticillinresistente S. aureus1. Det økende antallet multiresistente stammer blant stafylokokker, og faktisk andre patogener, i løpet av de siste 2 tiårene indikerer et presserende behov for rask utvikling av antibiotika med nye virkningsmåter som kan overvinne resistens.
Siden begynnelsen av 2000-tallet har imidlertid antibiotikaoppdagelsesprogrammer blitt dominert av lengre utviklingstider og lave suksessrater, med bare 17% av nye antibiotika som går inn i kliniske studier i USA og oppnår markedsgodkjenning8. Dette antyder en forskjell mellom resultater fra in vitro-testing av nye antibiotika og deres kliniske resultater. Det kan hevdes at denne forskjellen i stor grad skyldes forskjeller i bakteriell fysiologi under infeksjoner in vivo og under konvensjonelle mikrobiologiske metoder ved testing av effekten av antibiotika i in vitro prekliniske stadier. Derfor er det behov for nye laboratoriemetoder som er mer representative for bakteriell fysiologi under infeksjon for å forbedre suksessraten i antibiotikaoppdagelsesprogrammer.
Nåværende metoder for å studere hudinfeksjoner inkluderer studier på levende dyr (f.eks. Mus), ex vivo hudmodeller (f.eks. Svin) og 3D-vevskonstruerte hudmodeller (f.eks. Menneske)9,10,11,12. Studier på levende dyr er strengt regulert og har relativt lav gjennomstrømning. I dyremodeller forårsaker sår og infeksjon betydelig nød for dyrene og reiser etiske bekymringer. Menneskelige hudmodeller, ex vivo eller vevskonstruerte, krever etisk godkjenning, overholdelse av lokal og global lovgivning (Human Tissue Act, Helsinkideklarasjonen), og det er vanskelig å skaffe vev, med noen forespørsler som tar år å oppfylle13,14. Begge modelltypene er arbeidsintensive og krever betydelig kompetanse for å sikre eksperimentell suksess. Noen nåværende ex vivo hudinfeksjonsmodeller krever pre-inokulerte plater og tilsetningsstoffer for sårsengen for å muliggjøre infeksjon; Selv om disse modellene er utrolig nyttige, er det begrensninger i infeksjonsprosessen da tilsetningsstoffer begrenser bruken av sårbunnen som næringskilde10,15,16,17. Modellen beskrevet i denne studien bruker ingen tilsetningsstoffer til sårbunnen, noe som sikrer at infeksjonspatologien og levedyktige celletall er et resultat av direkte utnyttelse av sårbunnen som eneste næringskilde.
Gitt behovet for nye laboratoriemetoder, er det utviklet en ny høy gjennomstrømning ex vivo ovine modell av hudinfeksjoner til bruk for å evaluere effekten av nye antibiotika. Hudinfeksjonsstudier står overfor mange utfordringer - høye kostnader, etiske bekymringer og modeller som ikke viser et fullstendig bilde20,21. Ex vivo-modeller og 3D-eksplantasjonsmodeller gir bedre visualisering av sykdomsprosessen, og effekten behandlinger kan ha fra en mer klinisk relevant modell. Her beskrives oppsettet av en ny saueskinnsmodell, som er enkel, reproduserbar og klinisk relevant og har høy gjennomstrømning. Saueskinn ble valgt som sau er et av de store pattedyrene som vanligvis brukes til å modellere responser på infeksjoner in vivo. Dessuten er de lett tilgjengelige fra slakterier, noe som sikrer en jevn tilførsel av hud til forskning, og deres blir ikke skoldet, noe som sikrer god vevskvalitet. Denne studien brukte S. aureus som eksemplarisk patogen; Modellen fungerer imidlertid bra med andre mikroorganismer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Lammehoder fra R.B Elliott og Son Abattoir ble brukt som kilde til hudprøver i dette prosjektet. Alle lammene ble slaktet for konsum som mat. I stedet for å kaste hodene, ble disse gjenbrukt til forskning. Etisk godkjenning var ikke nødvendig da vevet ble hentet fra avfall som ble kastet fra slakterier.
1. Sterilisering
- Desinfiser tang før oppsamling av hodene ved å ta rene tang og utføre tørr varmesterilisering i en ovn ved 200 °C i 1 time. Autoklav alle glass ved 121 °C i 15 min før bruk.
- Utfør alt beskrevet arbeid innenfor et mikrobiologi klasse 2 skap. Forbered alle reagenser i henhold til produsentens instruksjoner.
2. Eksempel på innsamling
- I slakteriet ble Swaledale-lam slaktet ved bedøvelse ved hjelp av elektrisitet eller en pistol i fangenskap og ekssanguinert. Samle lammehoder ikke mer enn 4 timer etter slakting.
3. Forberedelse av hodene
- Desinfiser pannedelen av lammet ved å helle ca. 100 ml 200 ppm klordioksidoppløsning på prøveområdet. Barber panneseksjonen av hodet ved hjelp av elektriske klippere og vask området med 200 ml 200 ppm klordioksidoppløsning.
- Tørk av området med etanol og blå rull og dekk prøveområdet med hårfjerningskrem i 35 minutter. Skrap forsiktig av hårfjerningskremen ved hjelp av et skrapeverktøy og vurder prøveområdet. Hvis en betydelig mengde hår gjenstår, gjenta hårfjerningsprosessen.
- Bruk ytterligere 200 ml klordioksidoppløsning for å skylle området, og skyll deretter med etanol og tørk av med en blå rulle.
- Ved hjelp av en steril 8 mm biopsi punch, kutt ut 8 mm hudprøver fra det forberedte området. Fjern prøvene med steril tang og en 15-blads skalpell, slik at alt kutant fett fjernes.
- Plasser prøvene i en steril 0,5 L krukke fylt med steril fosfatbufret saltvann (PBS), og overfør dem deretter til sterile 50 ml rør med 50 ml 200 ppm klordioksidoppløsning, inverter to ganger, og la sterilisere i 30 minutter.
- Fjern prøvene fra klordioksidoppløsningen og vask dem ved å plassere dem i et 50 ml rør fylt med 40 ml steril PBS. Når den er vasket, legg hver enkelt hudprøve i en separat brønn på en 24-brønns tallerken.
- Tilsett 350 μL forvarmet medium mens du opprettholder prøven ved luft-væske-grensesnittet. Sammensetningen av mediet er som følger: MK-medier (Medium 199 med Hanks 'salter, L-glutamat og 1,75 mg / ml natriumbikarbonat) og Hams F12 i et 1: 1-forhold, med tilsatt FBS (10% v / v), EGF (10 ng / ml), insulin (5 μg / ml), penicillin-streptomycin (100 U / ml) og amfotericin B (2,5 μg / ml).
- Forsegl platene med 24 brønner med en gasspermeabel platetetning og inkuber ved 37 °C i en fuktet 5 % CO2 vevsinkubator i opptil 24 timer.
4. Vedlikehold av hudprøver
- Etter inkubasjon, fjern kulturmediet og skyll prøvene i 500 μL steril PBS. Tilsett antibiotikafrie medier i hver prøve og inkuber ved 37 °C i en fuktet 5 % CO 2-vevsinkubator i 24 timer for å fjerne gjenværende antibiotika i prøven.
- Hvis turbiditet eller soppinfeksjon utvikles i antibiotikafrie medier etter 24 timer, kast deretter prøven.
5. Tilberedning av inokulum
- Forbered et 50 ml rør med 10 ml steril tryptisk soyabuljong. Ta en fersk agarplate av S. aureus og bruk en vattpinne for å overføre flere kolonier i buljongen. Inkuber i 18 timer ved 37 °C ved 150 o/min.
- Sentrifuge på 4000 x g i 3 min. Fjern supernatanten og resuspend cellepelleten i 10 ml steril PBS. Gjenta to ganger for å sikre tilstrekkelig vask av cellene.
- Juster inokulum til 0,6 OD600 i steril PBS. Bekreft inokulumbelastningen ved å foreta et manuelt levedyktig plateantall.
6. Infeksjon av hudprøver
- Forbered en fersk 24-brønns tallerken med 400 μL forvarmede antibiotikafrie medier og tilsett i 24-brønnsinnsatsene ved hjelp av sterile tang.
- Fjern mediet fra hudprøvene, vask med 500 μL steril PBS, og fjern vasken. Bruk steril tang til å holde prøven forsiktig til bunnen av brønnen.
- Bruk en 4 mm stansebiopsi for å lage en sentral sårklaff, piercing gjennom til en grov dybde på 1-2 mm. Bruk deretter en 15-blads skalpell og steril tannet allis vevstang for å fjerne det øverste laget av sårklaffen. Variabilitet i sårdimensjonene kan påvirke utfallet av infeksjonen og endepunktkolonidannende enheter (CFU).
- Når alle prøvene er såret, overfør dem til 24-brønnsinnsatsene ved hjelp av sterile tang. Pipette 15 μL av bakteriell inokulum i sårbunnen. Inkuber deretter i 24 timer ved 37 °C i en fuktet 5 % CO2 vevsinkubator.
- Hvis lengre inkubasjonsperioder er nødvendige, fjern mediet og erstatt det med friske medier hver 24. time og inkuber under de samme forholdene.
7. Bestemmelse av bakteriebelastningen
- Fjern mediet fra bunnen av brønnene. Med steril tang, overfør hver prøve til et separat 50 ml rør fylt med 1 ml steril PBS.
- Bruk en finspisset homogenisator for å homogenisere overflaten av prøven. Pass på at sårsengen er i direkte kontakt med spissen av homogenisatoren.
- Homogeniser hver prøve i 35 s på middels / høy. Homogenisatoren løsner bakteriene fra overflaten av sårsengen for å tillate oppregning av bakteriebelastningen.
- Når alle prøvene er behandlet, vortex hver prøve, i sin tur, før pipettering. Dette er for å sikre at bakteriehomogenatet blandes.
- Pipette 20 μL virvelhomogenat inn i den tilsvarende brønnen på en 96-brønnsplate som inneholder 180 μL steril PBS.
- Fortynn serielt hvert prøvehomogenat til 1 x 10-7 og pipette 10 μL av det fortynnede homogenatet på en tryptisk soyaagarplate i tre eksemplarer.
- Inkuber agarplaten i 18 timer ved 37 °C. Tell deretter antall kolonier for å bestemme CFU for hver prøve.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Identifiseringen av en måte å sterilisere huden på før man satte opp sårinfeksjonsmodellen var utfordrende. Utfordringen lå i å sterilisere huden uten å skade de forskjellige hudlagene, som deretter kan få utilsiktede konsekvenser i utfallet av infeksjon. For å identifisere et passende steriliseringsregime ble ulike behandlinger prøvd i varierende tidsperioder, som beskrevet i tabell 1. Forurensning ble registrert som utvikling av turbiditet etter 48 timer i MK-mediet som ble brukt til å opprettholde hudprøvene. Vevsintegritet ble overvåket med histologi etterfulgt av farging med hematoksylin og eosin (H&E) umiddelbart etter behandling (figur 1). En 30 minutters behandling med klordioksid viste seg å være den mest effektive for reproduserbar sterilisering av hudvevet samtidig som vevets integritet ble bevart.
I det eksperimentelle oppsettet plasseres det sårede sterile vevet i det apikale kammeret til en 24-brønns innsats ved luft-væskegrensesnittet (figur 2A). To forskjellige såreteknikker ble forsøkt - en klafffjerningsteknikk, der vevet blir såret av et slagbiopsiverktøy og det øverste laget av det sårede vevet fjernes ved hjelp av en kombinasjon av en 15-blads skalpell og steril tannet allis vevstang, og en ripeteknikk, der vevet blir såret av et slagbiopsiverktøy alene. Selv om scratch-modellen hadde et høyere gjennomsnittlig antall CFUer etter 24 timer, var resultatene variable. Klafffjerningsteknikken ga mer konsistente resultater (figur 2C). Etter 48 timer ble ca. 100 ganger flere bakterielle CFUer gjenfunnet fra det sårede vevet sammenlignet med inokulum (figur 2D). Dette ble ansett å indikere en vellykket infeksjon. En hvit film i sårbunnen var påvist på vevet 48 timer etter infeksjon (figur 2B). Gramfargede histologiseksjoner av infisert vev indikerte tilstedeværelse av S. aureus-celler i sårsengen (figur 2E,F). Gramfargede histologiseksjoner av uinfisert vev angis som komparator (figur 2G,H).
Fra ett lammehode kan en 100 cm2 seksjon (10 cm x 10 cm) nås realistisk. Gitt at hver hudflekk stanses ut av pannen ved hjelp av en sirkulær stansebiopsi med en diameter på 8 mm, kan ca. 100 hudflekker fås fra ett lams panne per uke. Anskaffelse av ytterligere lammehoder øker proporsjonalt antall hudprøver som kan tas per uke. Derfor hevdes det at prosedyren er relativt høy gjennomstrømning. For denne studien ble 24 hudprøver oppnådd rutinemessig per uke. Hud fra ulike lammehoder ble behandlet som biologiske kopier for å ta hensyn til den potensielle donor-til-donor-variasjonen. Under tilberedningen av hudplastrene (trinn 3.1-3.8) er det viktigste tidsforbruket 30 minutters inkubasjon av hudprøvene i klordioksidoppløsningen og 2 x 35 min ventetid på hårfjerningskrembehandlingen. Bruken av stansebiopsi for å generere de 24 hudplastrene tar omtrent 15 minutter. Det er denne gangen som vil skalere lineært hvis antall hudplaster ble økt.
| Desinfeksjonsmiddel | 10 min | 30 min | 60 min |
| 1 % medisinsk overflatedesinfeksjonsmiddel på høyt nivå | F | P | P |
| 1 % flerbruks desinfeksjonsmiddel | F | F | P |
| 3% povidon | F | F | F |
| 5% povidon | F | P | P |
| 10% povidon | F | P | P |
| 70% etanol | F | P | P |
| UV | F | F | F |
| 0,55% hypokloritt | F | P | P |
| 200 ppm klordioksid | F | P | P |
Tabell 1: Sterilisering av ferskt lammeskinn. Hver hudprøve ble liggende i desinfeksjonsmiddelet i den angitte tiden. F betegner manglende sterilisering av vevet, med bakteriell forurensning tilstede i media. P betegner passering, uten bakteriell forurensning tilstede i media.
Figur 1: Histologi av uinfisert ex vivo sauehud behandlet med desinfeksjonsmidler (H&E-flekk) ved 100x forstørrelse. (A) Kontroller hudprøve med 30 min behandling i PBS. Noen epidermal shedding kan ses, men epidermis er ikke forstyrret. (B) Sauehud behandlet med 1 % medisinsk overflatedesinfeksjonsmiddel på høyt nivå i 30 minutter. Epidermal shedding (svart pil) sammen med noen forstyrrelser i stratum granulosum (blå pil). (C) Saueskinn behandlet med 5 % povidon i 30 minutter. Moderat skade på vevet kan ses her, med epidermal utskillelse av stratum corneum (svart pil). Det er minimal forstyrrelse i de underliggende epidermale lagene. (D) Sauehud behandlet med 10 % povidon i 30 minutter. De øverste lagene av epidermis har blitt skadet, med tegn på shedding (svart pil) og tynning (grønn pil). (E) Sauehud behandlet med 2 % flerbruksdesinfeksjonsmiddel i 30 minutter. Alvorlig skade på prøven kan observeres, med betydelig epidermal shedding (svart pil) og fullstendig utryddelse av stratum corneum (rød pil). (F) Saueskinn behandlet i 200 ppm klordioksid i 30 minutter. Noen epidermal shedding kan ses, men epidermis er intakt. (G) Sauehud behandlet med 0,6% hypokloritt i 30 minutter. Alvorlig skade på epidermis er tilstede, med et høyt nivå av epidermal shedding (svart pil) og utryddelse av epidermis på steder (rød pil). (H) Saueskinn behandlet med 70% etanol i 30 minutter. Skader på epidermis kan ses, med betydelig epidermal shedding (svart pil). Skalaen er 200 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Ex vivo sauehud infisert med S. aureus. (A) Skjematisk av det eksperimentelle oppsettet. (B) Bilder av huden på ex vivo sauer før infeksjon (venstre bilde) og etter 48 timers infeksjon (høyre bilde). Legg merke til den hvite filmen som er tilstede etter 48 timers inkubasjon i infisert vev, som er fraværende i uinfisert vev. (C) Testing av effekten av forskjellige sårmetoder på den endelige kolonidannende enheten (CFU) teller etter homogenisering. Fjerning av klaff (n = 6) og riper (n = 9) infisert med S. aureus i 24 timer. Feilfelt angir standardavvik. angir en p-verdi < 0,0001. (D) Testing av effekten av inkubasjonstider på CFU-tellinger etter homogenisering. 24 timers inkubasjon (n = 6) og 48 timers inkubasjon (n = 12). Feilfelt angir standardavvik. angir en p-verdi < 0,0001. (E,F) Representative bilder av histopatologisk analyse av infisert sauehud etter 48 timers infeksjon med modifisert Gram-flekk (E) ved 100x forstørrelse (skalabar på 200 μm). Boksen indikerer området forstørret i (F) ved 1,000x forstørrelse (skalalinje på 50 μm). Svarte piler indikerer bakterier. (G,H) Representative bilder av histopatologisk analyse av uinfisert sauehud etter en 48 timers periode (kontroll) med en modifisert gGram-flekk (G) ved 100x forstørrelse (skalabar på 200 μm). Boksen indikerer området forstørret i (H) ved 1,000x forstørrelse (skalalinje på 50 μm). Statistisk analyse ble utført som en enveis ANOVA. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Utviklingen av antimikrobielle midler er et viktig, men dyrt venture som anslås å koste rundt 1 milliard dollar og ta rundt 15 år å fullføre. Over 90% av antimikrobiell legemiddeloppdagelse og prekliniske studier av antimikrobiell legemiddeleffekt utføres av akademiske forskere og små og mellomstore bedrifter med typisk mindre enn 50 ansatte22. Disse lagene er svært økonomisk begrenset, noe som gjør svikt i blymolekyler i senere stadier av translasjonsforskning katastrofal. Økningen i antimikrobiell resistens overgår utviklingen av nye antimikrobielle stoffer, noe som ytterligere intensiverer behovet for å forvalte den allerede begrensede investeringen i antimikrobiell forskning ansvarlig23.
Forskjellen i bakteriell fysiologi mellom infeksjoner in vivo og in vitro laboratoriekulturer har en tendens til å forårsake en overestimering av den antimikrobielle effekten av treffene under blyidentifikasjonsstadiet. Slik overestimering bidrar til de høye frafallsratene man ser i de påfølgende oversettelsesstadiene. Tilgjengeligheten av in vitro antimikrobielle effekttestplattformer som inkorporerer bakterier med en fysiologi som bedre etterligner den som finnes under infeksjoner in vivo , vil muliggjøre en mer nøyaktig estimering av antimikrobiell effekt og gi forskere større kontroll over blyoptimalisering uten å stole på dyre og tett regulerte dyreforsøk. Slike modeller vil også redusere frafallet i de påfølgende stadiene av oversettelsen og kan gjøre antimikrobiell legemiddeloppdagelse mer attraktivt for investeringer.
Denne sauehudinfeksjonsmodellen som er beskrevet her, er et nyttig verktøy som vil gi forskere en fysiologisk relevant in vitro-modell av et infisert sår for å teste effekten av nye aktuelle antimikrobielle formuleringer i prekliniske stadier. I motsetning til flertallet av ex vivo-infeksjonsmodeller beskrevet i den vitenskapelige litteraturen 10,15,24,25,26,27,28, i denne modellen, blir patogenene utsatt for ex vivo-vevet ikke supplert med kulturmedier under infeksjon. Patogenproliferasjon og påfølgende infeksjon er avhengig av organismens evne til å skade vevet. Derfor er patogenfysiologien i denne modellen nærmere beslektet med den under in vivo-infeksjoner sammenlignet med konvensjonelle mikrobiologiske kulturer. En svært reproduserbar infeksjon oppnås fra denne modellen, bedømt av antall CFU hentet fra vevet etter inkubasjon.
Med mengden av menneskelige hudekvivalenter og humane og svin ex vivo sårmodeller, kan bruken av sauevev i denne modellen overfladisk hevdes å være en begrensning. Sau er imidlertid blant gruppen av store dyr som brukes som modeller for infeksjoner in vivo 29,30,31. Videre har sauer blitt brukt som surrogater for mennesker i immunologiforskning og vaksineutvikling, noe som indikerer at deres immunresponser ligner på mennesker32. Vevsreparasjonsprosessen under sårheling er lik hos store pattedyr, inkludert sauer og mennesker33,34, og tiltak for å forbedre sårheling som har blitt vellykket demonstrert hos sauer, har blitt foreslått for oversettelse til mennesker35,36,37. Derfor er bruk av ex vivo sauehud i denne sårmodellen ikke en begrensning. Videre kan denne sauemodellen anses å være et pålitelig alternativ til modeller som inneholder menneske- eller svinhud av følgende grunner. Tilgjengeligheten av menneskehud er begrenset og av variabel kvalitet når den er tilgjengelig38. Vevskonstruert human epidermis og levende hudekvivalenter krever forbedringer i deres dyrkingsforhold for å sikre reproduserbarhet i vevsfysiologi39. Selv om svinehud er mer tilgjengelig enn menneskelig hud, blir den allment tilgjengelige svinehuden skoldet som en del av kadaverbehandlingen i slakteriet, som fjerner epidermis10. Av erfaring er uskjellet svinehud mindre tilgjengelig fra slakterier.
Gjennom protokollen som er beskrevet her, er det kritiske skritt som sikrer suksess for modellen. Det mest kritiske trinnet innebærer sterilisering av vevet etter høsting. Klordioksidoppløsning må blandes med vevsprøvene, og en kontakttid på 30 minutter må tillates å desinfisere vevet tilstrekkelig og fjerne forurensninger. Videre, når du setter opp dette eksperimentet, kan det oppstå turbiditet eller soppforurensning på grunn av feil håndtering eller ineffektiv behandling med desinfeksjonsmidler og antibiotika. I et slikt tilfelle må prøver som utvikler turbiditet kastes. For å redusere utviklingen av turbiditet og forurensning, bør laboratoriemiljøet holdes rent, med hyppig sterilisering av inkubatoren, bruk av filterspisser og sikre fullstendig sterilisering av verktøyene og beholderne som brukes med prøvene. Et annet kritisk trinn i protokollen er når 4 mm biopsistans brukes til å vikle vevet. Bruken av dette verktøyet muliggjør sårsenger av tilsvarende størrelse for å sikre repeterbarhet og reproduserbarhet av protokollen. Variasjon i sårsengstørrelsen påvirker endepunktet CFU. Når det er tilstrekkelig fjerning av vevslappen, er resultatene mye mer konsistente. Et ytterligere kritisk skritt knyttet til integriteten til endepunktet CFU-telling er bruken av den finspissede homogenisatoren for å frigjøre bakterieceller. Posisjonen til homogenisatorspissen ble sett å ha innvirkning på CFU-tellingen fra prøve til prøve; Når spissen var riktig plassert direkte på sårbunnen, var det mye mindre variasjon sett fra prøve til prøve.
Likevel er modellen som foreslås her ikke uten begrensninger. Denne modellen har begrensninger knyttet til alle ex vivo-studier (dvs. mangel på aktiv vaskulær strømning, fravær av kommensalmikrobiota, som kan modulere infeksjonsfremgang og fravær av immunceller). Det kan hevdes at siden ex vivo sårmodellen ikke inneholder aktive immunceller, kan infeksjonsprogresjonen in vivo i nærvær av disse cellene være forskjellig fra det som er observert i ex vivo-modeller. Uansett gir ex vivo-modeller en vevsoverflate for vedlegg og en næringskilde for bakterier og presenterer en 3D-diffusjonsbarriere for formuleringer, noe som muliggjør en mer nøyaktig vurdering av antimikrobiell effekt enn konvensjonelle mikrobiologiske kulturteknikker.
En viktig fordel med modellen er at vevet kommer fra lam som dyrkes til konsum. Mer spesielt gjenbruker modellen hud fra lammehoder, som vanligvis kastes. Videre har modellen høy gjennomstrømning og muliggjør kostnadseffektive, raske og reproduserbare komparative studier. Det kan hevdes at tilgjengeligheten av denne modellen vil redusere og foredle behovet for dyr som er spesialavlet for translasjonsforskning i tråd med prinsippene i de tre R-ene, noe som letter mer human forskningspraksis. Selv om modellen beskrevet her inkorporerer S. aureus som det eksemplariske patogenet, kan modellen brukes med andre mikroorganismer, inkludert andre bakterier, sopp og virus, og dermed utvide omfanget av stoffutvikling som modellen muliggjør. Det kan tenkes at bruken av denne modellen vil muliggjøre rask oversettelse av sårt tiltrengte antibiotika for hudinfeksjoner ved å gi forskere større kontroll over stoffdesign og formulering i prekliniske stadier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre
Acknowledgments
Forfatterne takker EPSRC (EP/R513313/1) for finansieringen. Forfatterne vil også takke R.B Elliot og Son Abattoir i Calow, Chesterfield, for å gi lammehoder og for å være så imøtekommende i de tidlige stadiene av prosjektet, Kasia Emery for hennes støtte gjennom utviklingen av denne protokollen, og Fiona Wright fra Institutt for infeksjon, immunitet og kardiovaskulær sykdom ved University of Sheffield for å behandle histologiprøvene og være så utrolig nyttig gjennom hele dette prosjektet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24 Well Companion Plate | SLS | 353504 | |
| 4 mm Biopsy Punch | Williams Medical | D7484 | |
| 50 ml centrifuge tubes | Fisher Scientific | 10788561 | |
| 8 mm Biopsy Punch | Williams Medical | D7488 | |
| Amphotericin B solution, sterile | Sigma | A2942 | |
| Colour Pro Style Cordless Hair Clipper | Wahl | 9639-2117X | Hair Clippers |
| Dual Oven Incubator | SLS | OVe1020 | Sterilising oven |
| Epidermal growth factor | SLS | E5036-200UG | |
| Ethanol | Honeywell | 458600-2.5L | |
| F12 HAM | Sigma | N4888 | |
| Foetal bovine serum | Labtech International | CA-115/500 | |
| Forceps | Fisher Scientific | 15307805 | |
| Hair Removal Cream | Veet | Not applicable | |
| Heracell VIOS 160i | Thermo Scientific | 15373212 | Tissue culture incubator |
| Heraeus Megafuge 16R | VWR | 521-2242 | Centrifuge |
| Homogenizer 220, Handheld | Fisher Scientific | 15575809 | |
| Homogenizer 220, plastic blending cones | Fisher Scientific | 15585819 | |
| Insert Individual 24 well 0.4um membrane | VWR International | 353095 | |
| Insulin, recombinant Human | SLS | 91077C-1G | |
| Medium 199 (MK media) | Sigma | M0393 | |
| Microplate, cell culture Costar 96 well | Fisher Scientific | 10687551 | |
| Multitron | Infors | Not applicable | Bacterial incubator |
| PBS tablets | Sigma | P4417-100TAB | |
| Penicillin-Streptomycin | SLS | P0781 | |
| Plate seals | Fisher Scientific | ESI-B-100 | |
| Safe 2020 | Fisher Scientific | 1284804 | Class II microbiology safety cabinet |
| Scalpel blade number 15 | Fisher Scientific | O305 | |
| Scalpel Swann Morton | Fisher Scientific | 11849002 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma | S5761-1KG | |
| Toothed Allis Tissue Forceps | Rocialle | RSPU500-322 | |
| Tryptic Soy Agar | Merck Life Science UK Limited | 14432-500G-F | |
| Tryptic Soy Broth | Merck Life Science UK Limited | 41298-500G-F | |
| Vimoba Tablets | Quip Labs | VMTAB75BX |
References
- Claeys, K. C., et al. Novel application of published risk factors for methicillin-resistant S. aureus in acute bacterial skin and skin structure infections. International Journal of Antimicrobial Agents. 51 (1), 43-46 (2018).
- Rahim, K., et al.
- Guest, J. F., Fuller, G. W., Vowden, P. Costs and outcomes in evaluating management of unhealed surgical wounds in the community in clinical practice in the UK: A cohort study. BMJ Open. 8 (12), 022591 (2018).
- Sen, C. K., et al. Human skin wounds: A major and snowballing threat to public health and the economy. Wound Repair and Regeneration. 17 (6), 763-771 (2009).
- Wilcox, M. H., Dryden, M. Update on the epidemiology of healthcare-acquired bacterial infections: Focus on complicated skin and skin structure infections. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 76, Supplement 4 (2021).
- Han, G., Ceilley, R. Chronic wound healing: A review of current management and treatments. Advances in Therapy. 34 (3), 599-610 (2017).
- Percival, S. L., Hill, K. E., Malic, S., Thomas, D. W., Williams, D. W. Antimicrobial tolerance and the significance of persister cells in recalcitrant chronic wound biofilms. Wound Repair and Regeneration. 19 (1), 1-9 (2011).
- Dheman, N., et al. An analysis of antibacterial drug development trends in the United States, 1980-2019. Clinical Infectious Diseases. 73 (11), 4444-4450 (2021).
- MacNeil, S., Shepherd, J., Smith, L. Production of tissue-engineered skin and oral mucosa for clinical and experimental use. Methods in Molecular Biology. 695, 129-153 (2011).
- Yang, Q., et al. Development of a novel ex vivo porcine skin explant model for the assessment of mature bacterial biofilms. Wound Repair and Regeneration. 21 (5), 704-714 (2013).
- Malachowa, N., Kobayashi, S. D., Lovaglio, J., Deleo, F. R. Mouse model of Staphylococcus aureus skin infection. Methods in Molecular Biology. 1031, 109-116 (2013).
- Brandenburg, K. S., Calderon, D. F., Kierski, P. R., Czuprynski, C. J., Mcanulty, J. F. Novel murine model for delayed wound healing using a biological wound dressing with Pseudomonas aeruginosa biofilms. Microbial Pathogenesis. 122, 30-38 (2018).
- Bledsoe, M. J., Grizzle, W. E. The use of human tissues for research: What investigators need to know. Alternatives to Laboratory Animals. , (2022).
- Danso, M. O., Berkers, T., Mieremet, A., Hausil, F., Bouwstra, J. A. An ex vivo human skin model for studying skin barrier repair. Experimental Dermatology. 24 (1), 48-54 (2015).
- Torres, J. P., et al. Ex vivo murine skin model for B. burgdorferi biofilm. Antibiotics. 9 (9), 1-18 (2020).
- Zhao, G., et al. Delayed wound healing in diabetic (db/db) mice with Pseudomonas aeruginosa biofilm challenge: A model for the study of chronic wounds. Wound Repair and Regeneration. 18 (5), 467-477 (2010).
- Schierle, C. F., Dela Garza, M., Mustoe, T. A., Galiano, R. D. Staphylococcal biofilms impair wound healing by delaying reepithelialization in a murine cutaneous wound model. Wound Repair and Regeneration. 17 (3), 354-359 (2009).
- Trøstrup, H., et al. Pseudomonas aeruginosa biofilm aggravates skin inflammatory response in BALB/c mice in a novel chronic wound model. Wound Repair and Regeneration. 21 (2), 292-299 (2013).
- Thompson, M. G., et al. Evaluation of gallium citrate formulations against a multidrug-resistant strain of Klebsiella pneumoniae in a murine wound model of infection. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 59 (10), 6484-6493 (2015).
- Maboni, G., et al. A novel 3D skin explant model to study anaerobic bacterial infection. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 404 (2017).
- Macneil, S. Progress and opportunities for tissue-engineered skin. Nature. 445 (7130), 874-880 (2007).
- Theuretzbacher, U., Outterson, K., Engel, A., Karlén, A. The global preclinical antibacterial pipeline. Nature Reviews Microbiology. 18 (5), 275-285 (2019).
- Miethke, M., et al. Towards the sustainable discovery and development of new antibiotics. Nature Reviews Chemistry. 5 (10), 726-749 (2021).
- Guedes, G. M. M., et al. Ex situ model of biofilm-associated wounds: Providing a host-like environment for the study of Staphylococcus aureus and Pseudomonas aeruginosa biofilms. Journal of Applied Microbiology. 131 (3), 1487-1497 (2021).
- Johnson, C. J., et al. Augmenting the activity of chlorhexidine for decolonization of Candida auris from porcine skin. Journal of Fungi. 7 (10), 804 (2021).
- Horton, M. V., et al. Candida auris Forms High-Burden Biofilms in Skin Niche Conditions and on Porcine Skin. mSphere. 5 (1), 00910-00919 (2020).
- Ashrafi, M., et al. Validation of biofilm formation on human skin wound models and demonstration of clinically translatable bacteria-specific volatile signatures. Scientific Reports. 8, 1-16 (2018).
- Brackman, G., Coenye, T. In vitro and in vivo biofilm wound models and their application. Advances in Experimental Medicine and Biology. 897, 15-32 (2016).
- Rumbaugh, K. P., Carty, N. L. In Vivo Models of Biofilm Infection. Biofilm Infections. , Springer. New York, NY. 267-290 (2011).
- Boase, S., Valentine, R., Singhal, D., Tan, L. W., Wormald, P. J. A sheep model to investigate the role of fungal biofilms in sinusitis: Fungal and bacterial synergy. International Forum of Allergy & Rhinology. 1 (5), 340-347 (2011).
- Williams, D. L., et al. Experimental model of biofilm implant-related osteomyelitis to test combination biomaterials using biofilms as initial inocula. Journal of Biomedical Materials Research. Part A. 100 (7), 1888-1900 (2012).
- Scheerlinck, J. P. Y., Snibson, K. J., Bowles, V. M., Sutton, P. Biomedical applications of sheep models: From asthma to vaccines. Trends in Biotechnology. 26 (5), 259-266 (2008).
- Metcalfe, A. D., Ferguson, M. W. J. Tissue engineering of replacement skin: The crossroads of biomaterials, wound healing, embryonic development, stem cells and regeneration. Journal of the Royal Society Interface. 4 (14), 413-417 (2007).
- Kazemi-Darabadi, S., Sarrafzadeh-Rezaei, F., Farshid, A. A., Dalir-Naghadeh, B. Allogenous skin fibroblast transplantation enhances excisional wound healing following alloxan diabetes in sheep, a randomized controlled trial. International Journal of Surgery. 12 (8), 751-756 (2014).
- Martinello, T., et al. Allogeneic mesenchymal stem cells improve the wound healing process of sheep skin. BMC Veterinary Research. 14 (1), 1-9 (2018).
- Roberts, C. D., Windsor, P. A. Innovative pain management solutions in animals may provide improved wound pain reduction during debridement in humans: An opinion informed by veterinary literature. International Wound Journal. 16 (4), 968 (2019).
- Mazzone, L., et al. Bioengineering and in utero transplantation of fetal skin in the sheep model: A crucial step towards clinical application in human fetal spina bifida repair. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 14 (1), 58-65 (2020).
- Olkowska, E., Gržinić, G. Skin models for dermal exposure assessment of phthalates. Chemosphere. 295, 133909 (2022).
- Couto, N., et al. Label-free quantitative proteomics and substrate-based mass spectrometry imaging of xenobiotic metabolizing enzymes in ex vivo human skin and a human living skin equivalent model. Drug Metabolism and Disposition. 49 (1), 39-52 (2021).
