Summary
Protokol, Staphylococcus aureus ile enfekte olmuş bir ex vivo küçükbaş yaralı cilt modeli oluşturmak için adım adım bir yöntem tanımlamaktadır. Bu yüksek verimli model, geleneksel mikrobiyoloji tekniklerine kıyasla enfeksiyonları in vivo olarak daha iyi simüle eder ve araştırmacılara ortaya çıkan antimikrobiyallerin etkinliğini test etmek için fizyolojik olarak ilgili bir platform sunar.
Abstract
Antimikrobiyallerin geliştirilmesi, giderek daha düşük başarı oranlarına sahip pahalı bir süreçtir ve bu da antimikrobiyal keşif araştırmalarına daha fazla yatırım yapmayı daha az çekici hale getirmektedir. Antimikrobiyal ilaç keşfi ve müteakip ticarileştirme, araştırmacıların ilaç tasarımı ve formülasyonu üzerinde daha fazla kontrole sahip oldukları kurşun optimizasyon aşamalarında hızlı ve başarısız ucuz bir yaklaşım uygulanabilirse daha kazançlı hale getirilebilir. Bu makalede, Staphylococcus aureus ile enfekte olmuş bir ex vivo ovine yaralı cilt modelinin kurulumu basit, uygun maliyetli, yüksek verim ve tekrarlanabilir olan açıklanmaktadır. Modeldeki bakteriyel fizyoloji, enfeksiyon sırasında bakteriyel proliferasyon olarak patojenin dokuya zarar verme yeteneğine bağlı olduğunu taklit eder. Yara enfeksiyonunun oluşumu, inoküluma kıyasla canlı bakteri sayımlarında bir artış ile doğrulanır. Bu model, kurşun optimizasyonu aşamasında ortaya çıkan antimikrobiyallerin etkinliğini test etmek için bir platform olarak kullanılabilir. Bu modelin mevcudiyetinin, antimikrobiyaller geliştiren araştırmacılara, sonraki hayvan denemelerinde başarı oranlarını artırmaya yardımcı olacak hızlı ve başarısız ucuz bir model sağlayacağı iddia edilebilir. Model aynı zamanda araştırma için hayvan kullanımının azaltılmasını ve iyileştirilmesini kolaylaştıracak ve sonuçta cilt ve yumuşak doku enfeksiyonları için yeni antimikrobiyallerin kliniğe daha hızlı ve daha uygun maliyetli bir şekilde çevrilmesini sağlayacaktır.
Introduction
Cilt enfeksiyonları, dünyadaki sağlık hizmeti sağlayıcılarına büyük ekonomik maliyetler getiren önemli bir küresel sorundur. Patojenler tarafından çoklu ilaç direncinin ve biyofilm oluşumunun gelişmesi, iyileşmeyen yaraların prevalansında kilit rol oynar 1,2,3,4. Bunun bir sonucu olarak, cilt ve yumuşak doku enfeksiyonları, uzun süreli hastanede yatış ve ardından yeniden kabul için daha yaygın nedenlerden biridir5. Yara iyileşmesindeki gecikmeler hem hasta hem de sağlık hizmeti sağlayıcıları için maliyetlidir ve bazı tahminler ABD'de yılda yaklaşık 6,5 milyon hastanın etkilendiğini göstermektedir. İngiltere'de, cilt enfeksiyonları ve ilişkili komplikasyonlar yılda yaklaşık 75.000 ölümle sonuçlanmaktadır 2.4,6.
Staphylococcus aureus (S. aureus) sıklıkla hasta yaralarından izole edilen zorlu bir yara patojenidir 2,7. Çoklu ilaç direncinin ortaya çıkma oranı 2000'li yıllarda büyük ölçüde artmıştır. Bu süre zarfında, akut bakteriyel deri ve cilt yapısı enfeksiyonlarının yaklaşık% 60'ı, metisiline dirençli S. aureus1 için kültür pozitifti. Son 2 on yılda Stafilokoklar ve aslında diğer patojenler arasında çoklu ilaca dirençli suşların sayısının artması, direncin üstesinden gelebilecek yeni etki biçimlerine sahip antibiyotiklerin hızlı bir şekilde geliştirilmesine acil bir ihtiyaç olduğunu göstermektedir.
Bununla birlikte, 2000'li yılların başından bu yana, antibiyotik keşif programlarına daha uzun gelişim süreleri ve düşük başarı oranları hakim olmuştur ve ABD'deki klinik çalışmalara giren yeni antibiyotiklerin sadece% 17'si pazar onayını almıştır8. Bu, ortaya çıkan antibiyotiklerin in vitro testlerinden elde edilen sonuçlar ile klinik sonuçları arasında bir eşitsizlik olduğunu göstermektedir. Bu eşitsizliğin büyük ölçüde in vivo enfeksiyonlar sırasında ve in vitro preklinik aşamalarda antibiyotiklerin etkinliğini test ederken geleneksel mikrobiyolojik yöntemler sırasında bakteriyel fizyolojideki farklılıklardan kaynaklandığı iddia edilebilir. Bu nedenle, antibiyotik keşif programlarındaki başarı oranlarını artırmak için enfeksiyon sırasında bakteriyel fizyolojiyi daha iyi temsil eden yeni laboratuvar yöntemlerine ihtiyaç vardır.
Cilt enfeksiyonlarını incelemek için mevcut yöntemler arasında canlı hayvanlar (örneğin, fareler), ex vivo cilt modelleri (örneğin, domuz) ve 3D doku mühendisliği cilt modelleri (örneğin, insan) 9,10,11,12 üzerinde yapılan çalışmalar bulunmaktadır. Canlı hayvanlardaki çalışmalar sıkı bir şekilde düzenlenir ve nispeten düşük verime sahiptir. Hayvan modellerinde, yaralanma ve enfeksiyon hayvanlar için önemli sıkıntılara neden olur ve etik kaygıları gündeme getirir. Ex-vivo veya doku mühendisliği yapılmış insan derisi modelleri, etik onay, yerel ve küresel mevzuata (İnsan Dokusu Yasası, Helsinki Deklarasyonu) uygunluk gerektirir ve bazı taleplerin yerine getirilmesi yıllar süren dokuların elde edilmesinde zorluklar vardır.13,14. Her iki model türü de emek yoğundur ve deneysel başarıyı sağlamak için önemli uzmanlık gerektirir. Bazı mevcut ex vivo cilt enfeksiyonu modelleri, enfeksiyonu sağlamak için yara yatağı için önceden aşılanmış diskler ve katkı maddeleri gerektirir; Bu modeller inanılmaz derecede yararlı olsa da, katkı maddeleri yara yatağının besin kaynağı olarak kullanımını sınırladığı için enfeksiyon sürecinde sınırlamalar vardır10,15,16,17. Bu çalışmada açıklanan model, yara yatağına hiçbir katkı maddesi kullanmamakta, bu da enfeksiyon patolojisinin ve canlı hücre sayımlarının, yara yatağının tek besin kaynağı olarak doğrudan kullanılmasının bir sonucu olmasını sağlamaktadır.
Yeni laboratuvar yöntemlerine duyulan ihtiyaç göz önüne alındığında, ortaya çıkan antibiyotiklerin etkinliğini değerlendirmede kullanılmak üzere cilt enfeksiyonlarının yeni bir yüksek verimli ex vivo küçükbaş modeli geliştirilmiştir. Cilt enfeksiyonu çalışmaları birçok zorlukla karşı karşıyadır: yüksek maliyetler, etik kaygılar ve tam bir resim göstermeyen modeller20,21. Ex vivo modeller ve 3D eksplant modelleri, hastalık sürecinin daha iyi görselleştirilmesini sağlar ve etki tedavileri klinik olarak daha alakalı bir modelden sahip olabilir. Burada, basit, tekrarlanabilir ve klinik olarak alakalı ve yüksek verime sahip yeni bir küçükbaş hayvan cilt modelinin kurulumu açıklanmaktadır. Koyun, in vivo enfeksiyonlara verilen yanıtları modellemek için yaygın olarak kullanılan büyük memelilerden biri olduğu için küçükbaş hayvan derisi seçilmiştir. Dahası, mezbahalardan kolayca temin edilebilirler, araştırma için sürekli bir cilt kaynağı sağlarlar ve karkasları haşlanmaz, bu da iyi doku kalitesi sağlar. Bu çalışmada örnek patojen olarak S. aureus kullanılmıştır; ancak, model diğer mikroorganizmalarla iyi çalışır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu projede deri örneklerinin kaynağı olarak R.B Elliott ve Son Mezbaha'dan kuzu başları kullanılmıştır. Bütün kuzular yiyecek olarak tüketilmek üzere kesildi. Kafaları atmak yerine, bunlar araştırma için yeniden tasarlandı. Doku mezbahalardan atılan atıklardan kaynaklandığı için etik onay gerekli değildi.
1. Sterilizasyon
- Kafaları toplamadan önce forsepsleri temiz forseps alarak ve 1 saat boyunca 200 °C'de bir fırında kuru ısı sterilizasyonu yaparak dezenfekte edin. Tüm cam eşyaları kullanmadan önce 15 dakika boyunca 121 ° C'de otoklav yapın.
- Tarif edilen tüm çalışmaları bir mikrobiyoloji sınıf 2 kabini içinde gerçekleştirin. Tüm reaktifleri üreticinin talimatlarına göre hazırlayın.
2. Örnek toplama
- Mezbahada, Swaledale kuzuları elektrik veya esir cıvatalı tabanca kullanılarak çarpıcı bir şekilde kesildi ve exsanguined edildi. Kuzu kafalarını kesim sonrası en fazla 4 saat toplayın.
3. Kafaların hazırlanması
- Kuzunun alın kısmını, numune alanına yaklaşık 100 mL 200 ppm klor dioksit çözeltisi dökerek dezenfekte edin. Başın alın kısmını elektrikli makaslar kullanarak tıraş edin ve alanı 200 mL 200 ppm klor dioksit çözeltisi ile yıkayın.
- Alanı etanol ve mavi rulo ile silin ve numune alanını 35 dakika boyunca epilasyon kremi ile örtün. Bir kazıma aleti kullanarak epilasyon kremini nazikçe kazıyın ve numune alanını değerlendirin. Önemli miktarda saç kalırsa, epilasyon işlemini tekrarlayın.
- Alanı durulamak için 200 mL klor dioksit çözeltisi kullanın ve ardından etanol ile durulayın ve mavi bir rulo ile silin.
- Steril 8 mm biyopsi punch kullanarak, hazırlanan bölgeden 8 mm cilt örneklerini kesin. Steril forseps ve 15 bıçaklı bir neşter kullanarak numuneleri çıkarın ve tüm kutanöz yağların çıkarılmasını sağlayın.
- Numuneleri steril fosfat tamponlu salin (PBS) ile doldurulmuş steril bir 0,5 L kavanoza yerleştirin ve ardından 50 mL 200 ppm klor dioksit çözeltisi içeren steril 50 mL tüplere aktarın, iki kez ters çevirin ve 30 dakika sterilize etmeye bırakın.
- Numuneleri klor dioksit çözeltisinden çıkarın ve 40 mL steril PBS ile doldurulmuş 50 mL'lik bir tüpe yerleştirerek yıkayın. Yıkandıktan sonra, her bir cilt örneğini 24 delikli bir plakanın ayrı bir kuyucuğuna yerleştirin.
- Numuneyi hava-sıvı arayüzünde tutarken 350 μL önceden ısıtılmış ortam ekleyin. Ortamın bileşimi aşağıdaki gibidir: MK ortamı (Hanks'in tuzları, L-glutamat ve 1.75 mg / mL sodyum bikarbonat ile Orta 199) ve Ham'ın F12'si, FBS (% 10 v / v), EGF (10 ng / mL), insülin (5 μg / mL), penisilin-streptomisin (100 U / mL) ve amfoterisin B (2.5 μg / mL) eklenmiştir.
- 24 delikli plakaları gaz geçirgen bir plaka contası ile kapatın ve nemlendirilmiş% 5 CO 2 doku inkübatöründe24 saate kadar 37 ° C'de inkübe edin.
4. Cilt örneklerinin bakımı
- Kuluçkadan sonra, kültür ortamını çıkarın ve numuneleri 500 μL steril PBS içinde durulayın. Her numuneye antibiyotik içermeyen ortamlar ekleyin ve numunedeki artık antibiyotikleri çıkarmak için nemlendirilmiş% 5 CO2 doku inkübatöründe 24 saat boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
- 24 saat sonra antibiyotiksiz ortamda bulanıklık veya mantar enfeksiyonu gelişirse, numuneyi atın.
5. İnokulumun hazırlanması
- 10 mL steril triptik soya suyu ile 50 mL'lik bir tüp hazırlayın. Taze bir agar tabağı S. aureus alın ve birkaç koloniyi et suyuna aktarmak için bir çubuk kullanın. 150 rpm'de 37 °C'de 18 saat boyunca inkübe edin.
- 3 dakika boyunca 4.000 x g'de santrifüj. Süpernatantı çıkarın ve hücre peletini 10 mL steril PBS içinde yeniden askıya alın. Hücrelerin yeterli şekilde yıkanmasını sağlamak için iki kez tekrarlayın.
- İnokulumu, steril PBS'de 0,6 OD600'e ayarlayın. Manuel uygulanabilir plaka sayımı yaparak inokulum yükünü onaylayın.
6. Cilt örneklerinin enfeksiyonu
- 400 μL önceden ısıtılmış antibiyotik içermeyen ortam içeren taze bir 24 delikli plaka hazırlayın ve steril forseps kullanarak 24 delikli eklere ekleyin.
- Ortamı cilt örneklerinden çıkarın, 500 μL steril PBS ile yıkayın ve yıkamayı çıkarın. Numuneyi yavaşça kuyucuğun dibine tutmak için steril forseps kullanın.
- Merkezi bir yara flebi yapmak için 4 mm'lik bir punch biyopsisi kullanın, 1-2 mm'lik kaba bir derinliğe kadar delin. Daha sonra, yara kapağının üst tabakasını çıkarmak için 15 bıçaklı bir neşter ve steril dişli allis doku forseps kullanın. Yara boyutlarındaki değişkenlik enfeksiyonun sonucunu ve son nokta koloni oluşturan birimleri (CFU) etkileyebilir.
- Tüm numuneler yaralandıktan sonra, steril forseps kullanarak 24 delikli eklere aktarın. Pipet, bakteri inokulunun 15 μL'sini yara yatağına sokar. Daha sonra, nemlendirilmiş% 5 CO 2 doku inkübatöründe 37 ° C'de24 saat boyunca inkübe edin.
- Daha uzun inkübasyon süreleri gerekiyorsa, ortamı çıkarın ve her 24 saatte bir taze ortamla değiştirin ve aynı koşullarda inkübe edin.
7. Bakteri yükünün belirlenmesi
- Ortamları kuyucukların dibinden çıkarın. Steril forsepslerde, her numuneyi 1 mL steril PBS ile doldurulmuş ayrı bir 50 mL tüpe aktarın.
- Numunenin yüzeyini homojenize etmek için ince uçlu bir homojenizatör kullanın. Yara yatağının homojenizatörün ucu ile doğrudan temas halinde olmasına dikkat edin.
- Her numuneyi orta/yüksek frekansta 35 sn homojenize edin. Homojenizatör, bakteri yükünün numaralandırılmasına izin vermek için bakterileri yara yatağının yüzeyinden ayırır.
- Tüm numuneler işlendikten sonra, pipetlemeden önce sırayla her numuneyi vorteksleyin. Bu, bakteriyel homojenatın karıştırılmasını sağlamak içindir.
- Pipet, 180 μL steril PBS içeren 96 delikli bir plakanın karşılık gelen kuyucuğuna 20 μL vortekslenmiş homojenat.
- Her numune homojenatını 1 x 10−7'ye kadar seri olarak seyreltin ve seyreltilmiş homojenatın 10 μL'lik pipetini triptik soya agar plakasına üçlü olarak seyreltin.
- Agar plakasını 37 °C'de 18 saat boyunca inkübe edin. Ardından, her örnek için CFU'yu belirlemek üzere koloni sayısını sayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Yara enfeksiyonu modelini kurmadan önce cildi sterilize etmek için bir yolun belirlenmesi zordu. Buradaki zorluk, farklı cilt katmanlarına zarar vermeden cildi sterilize etmekte yatıyordu, bu da enfeksiyonun sonucunda istenmeyen sonuçlara yol açabilir. Uygun bir sterilizasyon rejimini tanımlamak için, Tablo 1'de belirtildiği gibi, farklı süreler boyunca farklı tedaviler denenmiştir. Kontaminasyon, cilt örneklerini korumak için kullanılan MK ortamında 48 saat sonra bulanıklık gelişimi olarak kaydedildi. Doku bütünlüğü histoloji ile izlendi ve ardından tedaviden hemen sonra hematoksilin ve eozin (H&E) ile boyandı (Şekil 1). Klor dioksit ile 30 dakikalık bir tedavi, doku bütünlüğünü korurken cilt dokusunu tekrar üretilebilir şekilde sterilize etmede en etkili olduğunu kanıtladı.
Deney düzeneğinde, yaralı steril doku, hava-sıvı arayüzünde 24 kuyucuklu bir ekin apikal odasına yerleştirilir (Şekil 2A). İki farklı yaralama tekniği denenmiştir: dokunun bir punch biyopsi aleti ile yaralandığı ve yaralı dokunun üst tabakasının 15 bıçaklı neşter ve steril dişli allis doku forsepslerinin bir kombinasyonu kullanılarak çıkarıldığı bir flep çıkarma tekniği ve dokunun sadece bir punch biyopsi aleti ile yaralandığı bir çizik tekniği. Çizik modeli, 24 saat sonra daha yüksek bir ortalama CFU sayısına sahip olmasına rağmen, sonuçlar değişkendi. Flep çıkarma tekniği daha tutarlı sonuçlar vermiştir (Şekil 2C). 48 saat sonra, yaralı dokudan inokuluma kıyasla yaklaşık 100 kat daha fazla bakteriyel CFU geri kazanıldı (Şekil 2D). Bunun başarılı bir enfeksiyonu gösterdiği düşünülüyordu. Enfeksiyondan 48 saat sonra yara yatağında beyaz bir film doku üzerinde belirgindi (Şekil 2B). Enfekte dokunun gram boyalı histoloji bölümleri yara yatağında S. aureus hücrelerinin varlığını gösterdi (Şekil 2E,F). Enfekte olmayan dokunun gram boyalı histoloji bölümleri karşılaştırıcı olarak verilmiştir (Şekil 2G,H).
Bir kuzunun kafasından, 100cm2'lik bir bölüme (10 cm x 10 cm) gerçekçi bir şekilde erişilebilir. Her bir deri yamasının dairesel 8 mm çapında bir punch biyopsisi kullanılarak alından delindiği göz önüne alındığında, haftada bir kuzunun alnından yaklaşık 100 cilt yaması elde edilebilir. Daha fazla kuzu başı tedarik etmek, haftada elde edilebilecek cilt örneklerinin sayısını orantılı olarak arttırır. Bu nedenle, prosedürün nispeten yüksek verim olduğu iddia edilmektedir. Bu çalışma için haftada rutin olarak 24 cilt örneği alındı. Çeşitli kuzuların kafalarından gelen deri, potansiyel donörün donör değişkenliğini hesaba katmak için biyolojik kopyalar olarak işlendi. Cilt yamalarının hazırlanması sırasında (adım 3.1-3.8), ana zaman tüketimi, klor dioksit çözeltisindeki cilt örneklerinin 30 dakikalık inkübasyonu ve epilasyon kremi tedavisi için 2 x 35 dakikalık beklemedir. 24 cilt yamasını oluşturmak için punch biyopsisinin kullanılması yaklaşık 15 dakika sürer. Bu kez, cilt yamalarının sayısı artırılırsa doğrusal olarak ölçeklendirilecekti.
| Dezenfektan | 10 Dk | 30 Dk | 60 Dk |
| %1 üst düzey medikal yüzey dezenfektanı | F | P | P |
| %1 çok amaçlı dezenfektan | F | F | P |
| % 3 povidon | F | F | F |
| % 5 povidon | F | P | P |
| %10 povidon | F | P | P |
| %70 etanol | F | P | P |
| UV | F | F | F |
| % 0.55 hipoklorit | F | P | P |
| 200 ppm klor dioksit | F | P | P |
Tablo 1: Taze kuzu derisinin sterilizasyonu. Her cilt örneği belirtilen süre boyunca dezenfektanda bırakıldı. F, ortamda bakteriyel kontaminasyon bulunan dokuyu sterilize etmedeki başarısızlığı ifade eder. P, ortamda bakteriyel kontaminasyon bulunmadan geçişi gösterir.
Şekil 1: 100x büyütmede dezenfektanlarla (H & E lekesi) tedavi edilen enfekte olmamış ex vivo küçükbaş cildin histolojisi. (A) PBS'de 30 dakikalık tedavi ile cilt örneğini kontrol edin. Bazı epidermal dökülmeler görülebilir, ancak epidermis bozulmaz. (B) Küçükbaş hayvan derisi 30 dakika boyunca %1 yüksek seviyeli tıbbi yüzey dezenfektanı ile muamele edilir. Epidermal dökülme (siyah ok) ve stratum granulosumda (mavi ok) bir miktar bozulma. (C) Küçükbaş hayvan derisi 30 dakika boyunca %5 povidon ile tedavi edilir. Dokuya orta derecede hasar burada görülebilir, stratum korneumun (siyah ok) epidermal dökülmesi ile. Altta yatan epidermal tabakalarda minimal bozulma vardır. (D) Küçükbaş hayvan derisi 30 dakika boyunca %10 povidon ile tedavi edilir. Epidermisin üst katmanları, dökülme (siyah ok) ve incelme (yeşil ok) kanıtı ile hasar görmüştür. (E) Küçükbaş hayvan derisi 30 dakika boyunca %2 çok amaçlı dezenfektan ile muamele edilir. Önemli epidermal dökülme (siyah ok) ve stratum korneumun (kırmızı ok) tamamen yok edilmesi ile numunede ciddi hasar görülebilir. (F) Küçükbaş hayvan derisi 30 dakika boyunca 200 ppm klor dioksit ile muamele edilir. Bazı epidermal dökülmeler görülebilir, ancak epidermis sağlamdır. (G) Küçükbaş hayvan derisi 30 dakika boyunca %0,6 hipoklorit ile muamele edilir. Epidermiste ciddi hasar, yüksek düzeyde epidermal dökülme (siyah ok) ve epidermisin yer yer yok edilmesi (kırmızı ok) ile mevcuttur. (H) Küçükbaş hayvan derisi 30 dakika boyunca %70 etanol ile muamele edilir. Epidermiste hasar, önemli epidermal dökülme (siyah ok) ile görülebilir. Ölçek çubuğu 200 μm'dir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Resim 2: S. aureus ile enfekte olmuş Ex vivo küçükbaş deri. (A) Deney düzeneğinin şeması. (B) Enfeksiyondan önce ex vivo küçükbaş cildin resimleri (sol resim) ve 48 saatlik enfeksiyon sonrası (sağ görüntü). Enfekte olmayan dokuda bulunmayan enfekte dokuda 48 saatlik inkübasyondan sonra mevcut olan beyaz filme dikkat edin. (C) Farklı yaralama yöntemlerinin homojenizasyondan sonra nihai koloni oluşturma birimi (CFU) sayıları üzerindeki etkisinin test edilmesi. Flap çıkarılması (n = 6) ve çizik (n = 9) 24 saat boyunca S. aureus ile enfekte olmuştur. Hata çubukları standart sapmayı gösterir. p değerinin 0,0001 < gösterir. (D) Homojenizasyonu takiben inkübasyon sürelerinin CFU sayıları üzerindeki etkisinin test edilmesi. 24 saat inkübasyon (n = 6) ve 48 saat inkübasyon (n = 12). Hata çubukları standart sapmayı gösterir. p değerinin 0,0001 < gösterir. (E,F) 100x büyütmede modifiye edilmiş bir Gram boyası (E) ile 48 saatlik enfeksiyon sonrası enfekte küçükbaş derinin histopatolojik analizinin temsili görüntüleri (200 μm'lik ölçek çubuğu). Kutu, 1.000x büyütmede (50 μm'lik ölçek çubuğu) (F) olarak büyütülen alanı gösterir. Siyah oklar bakterileri gösterir. (G,H) 100x büyütmede modifiye edilmiş bir gGram boyası (G) ile 48 saatlik bir periyodu (kontrol) takiben enfekte olmamış küçükbaş cildin histopatolojik analizinin temsili görüntüleri (200 μm'lik ölçek çubuğu). Kutu, 1.000x büyütmede (50 μm'lik ölçek çubuğu) (H) olarak büyütülen alanı gösterir. İstatistiksel analiz tek yönlü ANOVA olarak gerçekleştirilmiştir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Antimikrobiyallerin geliştirilmesi, yaklaşık 1 milyar dolara mal olduğu ve tamamlanması yaklaşık 15 yıl sürdüğü tahmin edilen önemli ama pahalı bir girişimdir. Antimikrobiyal ilaç keşfinin ve antimikrobiyal ilaç etkinliğinin klinik öncesi çalışmalarının% 90'ından fazlası, akademik araştırmacılar ve tipik olarak 50'den az çalışanı olan küçük ve orta ölçekli şirketler tarafından yürütülmektedir22. Bu ekipler finansal olarak çok kısıtlıdır, bu da translasyonel araştırmanın sonraki aşamalarında kurşun moleküllerinin başarısızlığını felaket hale getirir. Antimikrobiyal dirençteki artış, yeni antimikrobiyallerin gelişimini geride bırakıyor ve bu da antimikrobiyal araştırmalara zaten sınırlı olan yatırımı sorumlu bir şekilde yönetme ihtiyacını daha da yoğunlaştırıyor23.
İn vivo ve in vitro laboratuvar kültürleri arasındaki bakteriyel fizyolojideki eşitsizlik, kurşun tanımlama aşamasında isabetlerin antimikrobiyal etkinliğinin abartılmasına neden olma eğilimindedir. Bu tür bir abartı, çevirinin sonraki aşamalarında görülen yüksek yıpranma oranlarına katkıda bulunur. Bakterileri in vivo enfeksiyonlar sırasında bulunan daha iyi taklit eden bir fizyolojiye sahip in vitro antimikrobiyal etkinlik test platformlarının mevcudiyeti, antimikrobiyal etkinliğin daha doğru bir şekilde tahmin edilmesini sağlayacak ve araştırmacılara pahalı ve sıkı bir şekilde düzenlenmiş hayvan denemelerine güvenmeden kurşun optimizasyonu konusunda daha fazla kontrol sağlayacaktır. Bu tür modeller, çevirinin sonraki aşamalarında yıpranma oranlarını da azaltacak ve antimikrobiyal ilaç keşfini yatırım için daha cazip hale getirecektir.
Burada açıklanan bu küçükbaş hayvan deri enfeksiyonu modeli, araştırmacılara preklinik aşamalarda ortaya çıkan topikal antimikrobiyal formülasyonların etkinliğini test etmek için enfekte bir yaranın fizyolojik olarak ilgili in vitro modelini sağlayacak yararlı bir araçtır. Bilimsel literatürde tanımlanan ex vivo enfeksiyon modellerinin çoğunluğunun aksine 10,15,24,25,26,27,28, bu modelde ex vivo dokuya maruz kalan patojenlere enfeksiyon sırasında kültür ortamı takviyesi yapılmamaktadır. Patojen proliferasyonu ve ardından enfeksiyon, organizmanın dokuya zarar verme yeteneğine bağlıdır. Bu nedenle, bu modeldeki patojen fizyolojisi, geleneksel mikrobiyolojik kültürlere kıyasla in vivo enfeksiyonlar sırasındakiyle daha yakından ilişkilidir. Bu modelden, inkübasyondan sonra dokudan alınan CFU'ların sayısına göre değerlendirildiği gibi, yüksek oranda tekrarlanabilir bir enfeksiyon elde edilir.
İnsan derisi eşdeğerlerinin ve insan ve domuz ex vivo yara modellerinin bolluğu ile bu modelde küçükbaş doku kullanımının yüzeysel olarak bir sınırlama olduğu iddia edilebilir. Bununla birlikte, koyunlar in vivo29,30,31 enfeksiyon modeli olarak kullanılan büyük hayvan grubu arasındadır. Dahası, koyunlar immünoloji araştırmalarında ve aşı geliştirmede insanlar için vekil olarak kullanılmıştır, bu da bağışıklık tepkilerinin insanlarınkine benzer olduğunu göstermektedir32. Yara iyileşmesi sırasındaki doku onarım süreci, koyun ve insanlar da dahil olmak üzere büyük memelilerde benzerdir 33,34 ve koyunlarda başarıyla gösterilen yara iyileşmesini iyileştirmeye yönelik müdahaleler, insanlara çeviri için önerilmiştir35,36,37. Bu nedenle, bu yara modelinde ex vivo küçükbaş cildin kullanımı bir sınırlama değildir. Ayrıca, bu küçükbaş hayvan modelinin aşağıdaki nedenlerden dolayı insan veya domuz derisi içeren modellere güvenilir bir alternatif olduğu düşünülebilir. İnsan derisinin mevcudiyeti sınırlıdır ve mevcut olduğunda değişken kalitededir38. Doku mühendisliği insan epidermisi ve canlı cilt eşdeğerleri, doku fizyolojisinde tekrarlanabilirliği sağlamak için kültürleme koşullarında iyileştirmeler gerektirir39. Domuz derisi insan derisinden daha erişilebilir olmasına rağmen, yaygın olarak bulunan domuz derisi, mezbahadaki karkas işlemenin bir parçası olarak haşlanır ve bu da epidermis10'u ortadan kaldırır. Deneyimlere göre, haşlanmamış domuz derisi mezbahalardan daha az kolayca bulunabilir.
Burada açıklanan protokol boyunca, modelin başarısını sağlayan kritik adımlar vardır. En kritik adım, hasattan sonra dokunun sterilizasyonunu içerir. Klor dioksit çözeltisi doku örnekleri ile karıştırılmalı ve dokuyu yeterince dezenfekte etmek ve kirleticileri gidermek için 30 dakikalık bir temas süresine izin verilmelidir. Ayrıca, bu deneyi kurarken, yanlış kullanım veya dezenfektanlar ve antibiyotik ortamları ile etkisiz tedavi nedeniyle bulanıklık veya mantar kontaminasyonu oluşabilir. Böyle bir durumda, bulanıklık geliştiren örnekler atılmalıdır. Bulanıklık ve kontaminasyon gelişimini azaltmak için, inkübatörün sık sık sterilizasyonu, filtre uçlarının kullanılması ve numunelerle birlikte kullanılan aletlerin ve kapların tam sterilizasyonu ile laboratuvar ortamı temiz tutulmalıdır. Protokoldeki bir diğer kritik adım, dokuyu sarmak için 4 mm'lik biyopsi punchının kullanılmasıdır. Bu aletin kullanımı, protokolün tekrarlanabilirliğini ve tekrarlanabilirliğini sağlamak için benzer büyüklükte yara yataklarına izin verir. Yara yatağı boyutundaki değişkenlik son nokta CFU'sunu etkiler. Doku flebinin yeterli şekilde çıkarılması durumunda, sonuçlar çok daha tutarlıdır. Son nokta CFU sayımının bütünlüğü ile ilişkili bir diğer kritik adım, bakteri hücrelerini serbest bırakmak için ince uçlu homojenizatörün kullanılmasıdır. Homojenizatör ucunun konumunun, numuneden numuneye CFU sayımı üzerinde bir etkisi olduğu görülmüştür; uç doğrudan yara yatağına doğru bir şekilde yerleştirildiğinde, numuneden numuneye çok daha az değişkenlik görülmüştür.
Bununla birlikte, burada önerilen model sınırlamasız değildir. Bu modelin tüm ex vivo çalışmalara özgü sınırlamaları vardır (yani, aktif vasküler akış eksikliği, enfeksiyon ilerlemesini modüle edebilen kommensal mikrobiyotanın yokluğu ve bağışıklık hücrelerinin yokluğu). Ex vivo yara modeli aktif bağışıklık hücrelerini içermediğinden, bu hücrelerin varlığında in vivo enfeksiyon ilerlemesinin ex vivo modellerde gözlenenden farklı olabileceği söylenebilir. Ne olursa olsun, ex vivo modeller, bağlanma için bir doku yüzeyi ve bakteriler için bir besin kaynağı sağlar ve formülasyonlara 3D difüzyon bariyeri sunar, bu da antimikrobiyal etkinliğin geleneksel mikrobiyoloji kültür tekniklerinden daha doğru bir şekilde değerlendirilmesini sağlar.
Modelin önemli bir avantajı, dokunun insan tüketimi için yetiştirilen kuzulardan elde edilmesidir. Daha spesifik olarak, model genellikle atılan kuzuların kafalarından cildi yeniden amaçlar. Ayrıca, model yüksek verime sahiptir ve uygun maliyetli, hızlı ve tekrarlanabilir karşılaştırmalı çalışmalar sağlar. Bu modelin mevcudiyetinin, daha insancıl araştırma uygulamalarını kolaylaştıran üç R'nin ilkeleri doğrultusunda translasyonel araştırma için yetiştirilen hayvanlara olan ihtiyacı azaltacağı ve rafine edeceği iddia edilebilir. Burada açıklanan model örnek patojen olarak S. aureus'u içermesine rağmen, model diğer bakteriler, mantarlar ve virüsler de dahil olmak üzere diğer mikroorganizmalarla birlikte kullanılabilir, böylece modelin sağladığı ilaç geliştirme kapsamını genişletir. Bu modelin kullanımının, araştırmacılara klinik öncesi aşamalarda ilaç tasarımı ve formülasyonu üzerinde daha fazla kontrol sağlayarak cilt enfeksiyonları için çok ihtiyaç duyulan antibiyotiklerin hızlı bir şekilde çevrilmesini sağlayacağı öngörülebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur
Acknowledgments
Yazarlar EPSRC'ye (EP/R513313/1) finansman için teşekkür eder. Yazarlar ayrıca Calow, Chesterfield'daki R.B Elliot ve Son Mezbaha'ya, kuzu başlarını sağladıkları ve projenin ilk aşamalarında bu kadar uzlaşmacı oldukları için, Kasia Emery'ye bu protokolün geliştirilmesi boyunca verdiği destek için ve Sheffield Üniversitesi Enfeksiyon, Bağışıklık ve Kardiyovasküler Hastalıklar Bölümü'nden Fiona Wright'a histoloji örneklerini işledikleri ve bu proje boyunca inanılmaz derecede yardımcı oldukları için teşekkür etmek istiyorlar.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24 Well Companion Plate | SLS | 353504 | |
| 4 mm Biopsy Punch | Williams Medical | D7484 | |
| 50 ml centrifuge tubes | Fisher Scientific | 10788561 | |
| 8 mm Biopsy Punch | Williams Medical | D7488 | |
| Amphotericin B solution, sterile | Sigma | A2942 | |
| Colour Pro Style Cordless Hair Clipper | Wahl | 9639-2117X | Hair Clippers |
| Dual Oven Incubator | SLS | OVe1020 | Sterilising oven |
| Epidermal growth factor | SLS | E5036-200UG | |
| Ethanol | Honeywell | 458600-2.5L | |
| F12 HAM | Sigma | N4888 | |
| Foetal bovine serum | Labtech International | CA-115/500 | |
| Forceps | Fisher Scientific | 15307805 | |
| Hair Removal Cream | Veet | Not applicable | |
| Heracell VIOS 160i | Thermo Scientific | 15373212 | Tissue culture incubator |
| Heraeus Megafuge 16R | VWR | 521-2242 | Centrifuge |
| Homogenizer 220, Handheld | Fisher Scientific | 15575809 | |
| Homogenizer 220, plastic blending cones | Fisher Scientific | 15585819 | |
| Insert Individual 24 well 0.4um membrane | VWR International | 353095 | |
| Insulin, recombinant Human | SLS | 91077C-1G | |
| Medium 199 (MK media) | Sigma | M0393 | |
| Microplate, cell culture Costar 96 well | Fisher Scientific | 10687551 | |
| Multitron | Infors | Not applicable | Bacterial incubator |
| PBS tablets | Sigma | P4417-100TAB | |
| Penicillin-Streptomycin | SLS | P0781 | |
| Plate seals | Fisher Scientific | ESI-B-100 | |
| Safe 2020 | Fisher Scientific | 1284804 | Class II microbiology safety cabinet |
| Scalpel blade number 15 | Fisher Scientific | O305 | |
| Scalpel Swann Morton | Fisher Scientific | 11849002 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma | S5761-1KG | |
| Toothed Allis Tissue Forceps | Rocialle | RSPU500-322 | |
| Tryptic Soy Agar | Merck Life Science UK Limited | 14432-500G-F | |
| Tryptic Soy Broth | Merck Life Science UK Limited | 41298-500G-F | |
| Vimoba Tablets | Quip Labs | VMTAB75BX |
References
- Claeys, K. C., et al. Novel application of published risk factors for methicillin-resistant S. aureus in acute bacterial skin and skin structure infections. International Journal of Antimicrobial Agents. 51 (1), 43-46 (2018).
- Rahim, K., et al.
- Guest, J. F., Fuller, G. W., Vowden, P. Costs and outcomes in evaluating management of unhealed surgical wounds in the community in clinical practice in the UK: A cohort study. BMJ Open. 8 (12), 022591 (2018).
- Sen, C. K., et al. Human skin wounds: A major and snowballing threat to public health and the economy. Wound Repair and Regeneration. 17 (6), 763-771 (2009).
- Wilcox, M. H., Dryden, M. Update on the epidemiology of healthcare-acquired bacterial infections: Focus on complicated skin and skin structure infections. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 76, Supplement 4 (2021).
- Han, G., Ceilley, R. Chronic wound healing: A review of current management and treatments. Advances in Therapy. 34 (3), 599-610 (2017).
- Percival, S. L., Hill, K. E., Malic, S., Thomas, D. W., Williams, D. W. Antimicrobial tolerance and the significance of persister cells in recalcitrant chronic wound biofilms. Wound Repair and Regeneration. 19 (1), 1-9 (2011).
- Dheman, N., et al. An analysis of antibacterial drug development trends in the United States, 1980-2019. Clinical Infectious Diseases. 73 (11), 4444-4450 (2021).
- MacNeil, S., Shepherd, J., Smith, L. Production of tissue-engineered skin and oral mucosa for clinical and experimental use. Methods in Molecular Biology. 695, 129-153 (2011).
- Yang, Q., et al. Development of a novel ex vivo porcine skin explant model for the assessment of mature bacterial biofilms. Wound Repair and Regeneration. 21 (5), 704-714 (2013).
- Malachowa, N., Kobayashi, S. D., Lovaglio, J., Deleo, F. R. Mouse model of Staphylococcus aureus skin infection. Methods in Molecular Biology. 1031, 109-116 (2013).
- Brandenburg, K. S., Calderon, D. F., Kierski, P. R., Czuprynski, C. J., Mcanulty, J. F. Novel murine model for delayed wound healing using a biological wound dressing with Pseudomonas aeruginosa biofilms. Microbial Pathogenesis. 122, 30-38 (2018).
- Bledsoe, M. J., Grizzle, W. E. The use of human tissues for research: What investigators need to know. Alternatives to Laboratory Animals. , (2022).
- Danso, M. O., Berkers, T., Mieremet, A., Hausil, F., Bouwstra, J. A. An ex vivo human skin model for studying skin barrier repair. Experimental Dermatology. 24 (1), 48-54 (2015).
- Torres, J. P., et al. Ex vivo murine skin model for B. burgdorferi biofilm. Antibiotics. 9 (9), 1-18 (2020).
- Zhao, G., et al. Delayed wound healing in diabetic (db/db) mice with Pseudomonas aeruginosa biofilm challenge: A model for the study of chronic wounds. Wound Repair and Regeneration. 18 (5), 467-477 (2010).
- Schierle, C. F., Dela Garza, M., Mustoe, T. A., Galiano, R. D. Staphylococcal biofilms impair wound healing by delaying reepithelialization in a murine cutaneous wound model. Wound Repair and Regeneration. 17 (3), 354-359 (2009).
- Trøstrup, H., et al. Pseudomonas aeruginosa biofilm aggravates skin inflammatory response in BALB/c mice in a novel chronic wound model. Wound Repair and Regeneration. 21 (2), 292-299 (2013).
- Thompson, M. G., et al. Evaluation of gallium citrate formulations against a multidrug-resistant strain of Klebsiella pneumoniae in a murine wound model of infection. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 59 (10), 6484-6493 (2015).
- Maboni, G., et al. A novel 3D skin explant model to study anaerobic bacterial infection. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 404 (2017).
- Macneil, S. Progress and opportunities for tissue-engineered skin. Nature. 445 (7130), 874-880 (2007).
- Theuretzbacher, U., Outterson, K., Engel, A., Karlén, A. The global preclinical antibacterial pipeline. Nature Reviews Microbiology. 18 (5), 275-285 (2019).
- Miethke, M., et al. Towards the sustainable discovery and development of new antibiotics. Nature Reviews Chemistry. 5 (10), 726-749 (2021).
- Guedes, G. M. M., et al. Ex situ model of biofilm-associated wounds: Providing a host-like environment for the study of Staphylococcus aureus and Pseudomonas aeruginosa biofilms. Journal of Applied Microbiology. 131 (3), 1487-1497 (2021).
- Johnson, C. J., et al. Augmenting the activity of chlorhexidine for decolonization of Candida auris from porcine skin. Journal of Fungi. 7 (10), 804 (2021).
- Horton, M. V., et al. Candida auris Forms High-Burden Biofilms in Skin Niche Conditions and on Porcine Skin. mSphere. 5 (1), 00910-00919 (2020).
- Ashrafi, M., et al. Validation of biofilm formation on human skin wound models and demonstration of clinically translatable bacteria-specific volatile signatures. Scientific Reports. 8, 1-16 (2018).
- Brackman, G., Coenye, T. In vitro and in vivo biofilm wound models and their application. Advances in Experimental Medicine and Biology. 897, 15-32 (2016).
- Rumbaugh, K. P., Carty, N. L. In Vivo Models of Biofilm Infection. Biofilm Infections. , Springer. New York, NY. 267-290 (2011).
- Boase, S., Valentine, R., Singhal, D., Tan, L. W., Wormald, P. J. A sheep model to investigate the role of fungal biofilms in sinusitis: Fungal and bacterial synergy. International Forum of Allergy & Rhinology. 1 (5), 340-347 (2011).
- Williams, D. L., et al. Experimental model of biofilm implant-related osteomyelitis to test combination biomaterials using biofilms as initial inocula. Journal of Biomedical Materials Research. Part A. 100 (7), 1888-1900 (2012).
- Scheerlinck, J. P. Y., Snibson, K. J., Bowles, V. M., Sutton, P. Biomedical applications of sheep models: From asthma to vaccines. Trends in Biotechnology. 26 (5), 259-266 (2008).
- Metcalfe, A. D., Ferguson, M. W. J. Tissue engineering of replacement skin: The crossroads of biomaterials, wound healing, embryonic development, stem cells and regeneration. Journal of the Royal Society Interface. 4 (14), 413-417 (2007).
- Kazemi-Darabadi, S., Sarrafzadeh-Rezaei, F., Farshid, A. A., Dalir-Naghadeh, B. Allogenous skin fibroblast transplantation enhances excisional wound healing following alloxan diabetes in sheep, a randomized controlled trial. International Journal of Surgery. 12 (8), 751-756 (2014).
- Martinello, T., et al. Allogeneic mesenchymal stem cells improve the wound healing process of sheep skin. BMC Veterinary Research. 14 (1), 1-9 (2018).
- Roberts, C. D., Windsor, P. A. Innovative pain management solutions in animals may provide improved wound pain reduction during debridement in humans: An opinion informed by veterinary literature. International Wound Journal. 16 (4), 968 (2019).
- Mazzone, L., et al. Bioengineering and in utero transplantation of fetal skin in the sheep model: A crucial step towards clinical application in human fetal spina bifida repair. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 14 (1), 58-65 (2020).
- Olkowska, E., Gržinić, G. Skin models for dermal exposure assessment of phthalates. Chemosphere. 295, 133909 (2022).
- Couto, N., et al. Label-free quantitative proteomics and substrate-based mass spectrometry imaging of xenobiotic metabolizing enzymes in ex vivo human skin and a human living skin equivalent model. Drug Metabolism and Disposition. 49 (1), 39-52 (2021).
