转染合成mRNA后肿瘤细胞迁移与侵袭的实时定量检测

摘要

许多上调的基因会促进肿瘤细胞的迁移和侵袭，从而导致预后不良。确定哪些基因调控肿瘤细胞的迁移和侵袭至关重要。本实验方案介绍了一种实时研究基因表达升高对肿瘤细胞迁移和侵袭影响的方法。

摘要

肿瘤细胞具有高度运动性和侵袭性，并表现出异常的基因表达模式。了解基因表达变化如何调控肿瘤细胞的迁移和侵入，对于理解肿瘤细胞浸润邻近健康组织及发生转移的机制至关重要。此前研究表明，通过基因敲低并结合基于阻抗的实时检测技术监测肿瘤细胞的迁移与侵袭，可鉴定出调控这些过程所必需的基因。近期，针对 SARS-CoV-2 的 mRNA 疫苗推动了合成 mRNA 在治疗领域应用的兴趣。本文改进了利用合成 mRNA 的方法，用于研究基因过表达对肿瘤细胞迁移和侵袭的影响。本研究证明，通过转染合成 mRNA 提高基因表达水平，再结合基于阻抗的实时检测，有助于识别能够促进肿瘤细胞迁移和侵袭的基因。本方法学论文详细阐述了评估基因表达改变对肿瘤细胞迁移和侵袭影响的实验流程。

引言

肿瘤细胞的运动性在转移过程中起着至关重要的作用^1,2。肿瘤细胞向邻近及远端健康组织的扩散使癌症治疗变得困难，并导致复发^3,4。因此，了解肿瘤细胞运动性的机制并开发相应的治疗策略至关重要。由于许多肿瘤细胞具有改变的基因表达谱，明确基因表达谱中哪些变化导致肿瘤细胞运动性的改变尤为关键^5,6。

已开发出多种检测方法用于测量细胞迁移 体外某些检测方法由于仅允许在特定时间点进行测量，因此提供的信息有限，而其他方法则能够实时提供关于肿瘤细胞运动性的全面信息⁷尽管许多细胞迁移实验可以在特定时间点或实验终点提供定量结果，但它们无法充分揭示整个实验期间细胞迁移速率的动态变化细节。此外，根据实验设计、细胞类型和细胞数量的不同，可能难以检测细胞迁移速率的潜在变化。再者，对于简单的处理干预，可通过传统迁移实验的简单量化进行分析，但若要研究多种联合处理的复杂效应，则可能需要更精细的定量方法。⁸.

方案

1. mRNA 的合成

注意：进行 mRNA 合成时，所有试剂和设备在使用前必须经过特殊处理以灭活 RNase。有关本实验方案中使用的所有材料、仪器和试剂的详细信息，请参见材料表。

1. DNA线性化
   注意：如先前所述^18,19，将小鼠CrkI和CrkL的cDNA克隆至pFLAG-CMV-5a表达载体中，以在C末端添加FLAG表位标签，并亚克隆至pcDNA3.1/myc-His载体中以引入T7启动子。
   1. 在微量离心管中加入10 µL 10x反应缓冲液、1.5 µL PmeI（10,000单位/mL）和10 µg质粒DNA，用限制性内切酶线性化质粒DNA。加入无核酸酶水，使反应体系总体积达到100 µL。
   2. 轻弹混匀，短暂离心，于37 °C孵育过夜。
   3. 短暂离心后，在反应体系中加入5 µL 10%十二烷基硫酸钠（SDS）和1 µL蛋白酶K（20 mg/mL，RNA级）。轻弹混匀，短暂离心，于50 °C孵育30分钟。
   4. 在通风橱中，向质粒反应体系中加入100 µL酚:氯仿:异戊醇的下层相进行抽提。涡旋振荡，然后在室温下以18,800....

结果

Crk 和 CrkL 蛋白在多种细胞类型的运动性中发挥重要作用，包括神经元²²、T 细胞²³、成纤维细胞^18,19以及多种肿瘤细胞¹³。由于已有报道显示 Crk 和 CrkL 蛋白在胶质母细胞瘤中表达升高^24,25,26，本研究探讨了 Crk 的剪接变体 CrkI 过表达对胶质母细胞瘤细胞迁移的影响。通过电穿孔法将不同浓度的合成 CrkI mRNA 导入 U-118MG 细胞，并检测其蛋白表达水平和细胞迁移能力。在转染后 1 天，以不同浓度的合成 CrkI mRNA 对 U-118MG 胶质母细胞瘤细胞进行电穿孔，导致 FLAG 标签的 CrkI 蛋白表达呈浓.......

讨论

迁移和侵袭是肿瘤细胞的重要特征。测量肿瘤细胞的运动能力并理解调控肿瘤细胞运动能力的潜在机制，可为治疗干预提供关键见解^2,27。目前已开发出多种方法用于研究细胞迁移⁷。利用划痕或培养插件进行的伤口愈合实验是一种简单且常用的方法，可提供间隙闭合的对比图像。单细胞追踪实验则需要通过延时成像对单个细胞进行监测，细胞可通过荧光染料进行标记。伤口愈合实验和单细胞追踪实验均可用于检测细胞的自发运动。

借助延时成像和密集的后续数据处理，这两种检测方法均可实现样本间的定量比较²⁸。然而，这些检测方法不适用于研究细胞穿过细胞外基质（ECM）蛋白层的侵袭过程。相比之下，Transwell迁移与侵袭实验可测量细胞在有或无ECM蛋白层的情况下，穿过Transwell小室膜的定向迁移能力。但这些实验无法实现持续监测，因为需要在特定时间点收集已迁移的细胞，且Transwell装置无法重复使用。所有这些.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
AlphaImager HP	ProteinSimple	92-13823-00	琼脂糖凝胶成像系统
α-微管蛋白抗体	Sigma	T9026	用于检测α-微管蛋白（稀释比例 1:3,000）
CIM-plate 16	Agilent Technologies, Inc	5665825001	细胞侵袭与迁移实验板
Crk 抗体	BD Biosciences	610035	用于检测 CrkI 和 CrkII 蛋白（稀释比例 1:1,500）
CrkL 抗体	Santa Cruz	sc-319	用于检测 CrkL 蛋白（稀释比例 1:1,500）
Dulbecco’s 改良 Eagle’s 培养基 (DMEM)	ATCC	302002	细胞培养基
Dulbecco 磷酸盐缓冲液 (DPBS)	Corning	21-031-CV	用于洗涤细胞的缓冲液
胎牛血清 (FBS)	Hyclone	SH30910.03	培养基添加剂
Heracell VIOS 160i CO2 培养箱	Thermo Scientific	51030285	CO2 培养箱
IRDye 800CW 山羊抗小鼠 IgG 二抗	Li-Cor	926-32210	Western 印迹分析用二抗（稀释比例 1:10,000）
IRDye 800CW 山羊抗兔 IgG 二抗	Li-Cor	926-32211	Western 印迹分析用二抗 （稀释比例 1:10,000）
氯化锂	Invitrogen	AM9480	用于 RNA 沉淀
Matrigel 基质	Corning	354234	细胞外基质 (ECM) 凝胶
MEGAscript T7 转录试剂盒	Invitrogen	AM1334	用于 RNA 合成
Millennium RNA 标记物	Invitrogen	AM7150	用于甲醛琼脂糖凝胶电泳
小型离心机	ISC BioExpress	C1301P-ISC	用于离心收集细胞
小鼠脑 QUICK-Clone cDNA	TaKaRa	637301	克隆用基因（插入片段）来源
NanoQuant	Tecan	M200PRO	核酸定量系统
Neon 电穿孔系统	ThermoFisher Scientific	MPK5000	电穿孔系统1
Neon 转染系统 10 µL 试剂盒	ThermoFisher Scientific	MPK1025	电穿孔试剂盒
Neon 转染系统 100 µL 试剂盒	ThermoFisher Scientific	MPK10096	电穿孔试剂盒
NorthernMax 变性凝胶缓冲液	Invitrogen	AM8676	用于甲醛琼脂糖凝胶电泳
NorthernMax 甲醛上样染料	Invitrogen	AM8552	用于甲醛琼脂糖凝胶电泳
NorthernMax 电泳缓冲液	Invitrogen	AM8671	用于甲醛琼脂糖凝胶电泳
无核酸酶水	Teknova	W3331	用于 mRNA 合成过程中的多种反应
Odyssey CLx 成像仪	Li-Cor		Western 印迹分析成像仪
pcDNA3.1/myc-His	Invitrogen	V80020	插入片段（小鼠 CrkI 和 CrkL cDNA）克隆所用载体
pFLAG-CMV-5a	Millipore Sigma	E7523	FLAG 表位标签来源
苯酚:氯仿:异戊醇	Sigma	P2069	用于 DNA 提取
PmeI	New England BioLabs	R0560L	用于线性化质粒以进行 mRNA 合成
多聚(A)加尾试剂盒	Invitrogen	AM1350	用于多聚(A)加尾反应
聚苯乙烯组织培养皿（100 x 20 mm 规格）	Corning	353003	用于转染前细胞培养
聚苯乙烯组织培养皿（35 x 10 mm 规格）	Corning	353001	用于培养转染后细胞
蛋白酶 K	Invitrogen	25530049	用于去除反应混合物中的蛋白质
Purifier Axiom II 级生物安全柜，C1 型	Labconco Corporation	304410001	用于细胞无菌操作的生物安全柜
重悬缓冲液 R	ThermoFisher Scientific		电穿孔试剂盒（MPK1025 和 MPK10096）中包含的缓冲液，用于电穿孔前重悬细胞，其成分为专有信息。
RNaseZap	Invitrogen	AM9780	RNA 去污染溶液
Scepter	Millipore	C85360	手持式自动细胞计数器
ScriptCap 2'-O-甲基转移酶试剂盒	Cellscript	C-SCMT0625	用于加帽反应
ScriptCap m7G 加帽系统	Cellscript	C-SCCE0625	用于加帽反应
十二烷基硫酸钠溶液	Invitrogen	15553-035	用于蛋白酶 K 反应的去垢剂
Sorvall Legend XT 离心机	Thermo Scientific	75004532	台式离心机，用于离心收集细胞
胰蛋白酶-EDTA	Gibco	25300-054	用于细胞解离
U-118MG	ATCC	HTB15	源自人胶质母细胞瘤患者的贴壁细胞系
连环蛋白抗体	Sigma	V9131	用于检测连环蛋白（vinculin）（稀释比例 1:100,000）
xCELLigence RTCA DP	Agilent Technologies, Inc	380601050	用于实时细胞分析的仪器
1不同细胞系的电穿孔参数及其他相关信息可在制造商官网获取（https://www.thermofisher.com/us/en/home/life-science/cell-culture/transfection/neon-transfection-system/neon-transfection-system-cell-line-data.html?）。