Summary
Mange opregulerede gener stimulerer tumorcellemigration og invasion, hvilket fører til dårlig prognose. Det er afgørende at bestemme, hvilke gener der regulerer tumorcellemigration og invasion. Denne protokol præsenterer en metode til at undersøge virkningerne af den øgede ekspression af et gen på migration og invasion af tumorceller i realtid.
Abstract
Tumorceller er meget bevægelige og invasive og viser ændrede genekspressionsmønstre. Viden om, hvordan ændringer i genekspression regulerer tumorcellemigration og invasion, er afgørende for at forstå mekanismerne for tumorcelleinfiltration i nærliggende sundt væv og metastase. Tidligere blev det påvist, at genknockdown efterfulgt af impedansbaseret realtidsmåling af tumorcellemigration og invasion muliggør identifikation af de gener, der kræves til tumorcellemigration og invasion. For nylig har mRNA-vaccinerne mod SARS-CoV-2 øget interessen for at bruge syntetisk mRNA til terapeutiske formål. Her blev metoden ved hjælp af syntetisk mRNA revideret for at studere effekten af genoverekspression på tumorcellemigration og invasion. Denne undersøgelse viser, at forhøjet genekspression med syntetisk mRNA-transfektion efterfulgt af impedansbaseret realtidsmåling kan hjælpe med at identificere de gener, der stimulerer tumorcellemigration og invasion. Dette metodepapir giver vigtige detaljer om procedurerne for undersøgelse af effekten af ændret genekspression på tumorcellemigration og invasion.
Introduction
Tumorcellemotilitet spiller en afgørende rolle i metastase 1,2. Spredningen af tumorceller til nærliggende og fjerntliggende sunde væv gør kræftbehandling vanskelig og bidrager til gentagelse 3,4. Derfor er det vigtigt at forstå mekanismerne for tumorcellemotilitet og udvikle relevante terapeutiske strategier. Da mange tumorceller har ændret genekspressionsprofiler, er det afgørende at forstå, hvilke ændringer i genekspressionsprofilen, der fører til ændret tumorcellemotilitet 5,6.
Flere assays er blevet udviklet til at måle cellemigration in vitro. Nogle analyser giver kun begrænset information på grund af kun at tillade målinger på bestemte tidspunkter, mens andre tilbyder omfattende information om tumorcellemotilitet i realtid7. Selvom mange af disse cellemotilitetsanalyser kan give kvantitative resultater på et givet tidspunkt eller endepunktet, giver de ikke tilstrækkeligt detaljerede oplysninger om dynamiske ændringer i cellemigrationshastigheden i løbet af forsøgsperioden. Derudover kan det være vanskeligt at undersøge potentielle ændringer i cellemigrationshastigheden afhængigt af eksperimentelt design, celletyper og cellenumre. Desuden kan virkningerne af ukomplicerede behandlinger undersøges ved simpel kvantificering af traditionelle motilitetsassays, men mere sofistikeret kvantificering kan være nødvendig for at studere de komplekse virkninger af forskellige kombinerede behandlinger8.
Der er udviklet et instrument til overvågning af den elektriske strøm af en mikrotiterplade, der er godt bunddækket med mikroelektroder9. Vedhæftningen af celler til overfladen af brønden hindrer elektronstrømmen, og impedansen korrelerer med cellernes kvantitative og kvalitative binding. Tilstedeværelsen af mikroelektroderne på brøndbunden muliggør måling af celleadhæsion, spredning og proliferation. Tilstedeværelsen af mikroelektroderne under en mikroporøs membran i det øverste kammer muliggør måling af cellemigration og invasion i det nedre kammer, med det øverste kammer belagt med ekstracellulære matrixproteiner (ECM) for at muliggøre invasion10.
Tidligere blev det demonstreret, at impedansbaserede realtidsmålinger af tumorcellemigration og invasion giver realtidsdata under hele eksperimentet samt øjeblikkelige sammenligninger og kvantificeringer under forskellige eksperimentelle betingelser11. I dette metodepapir blev genknockdown induceret for at teste rollen som proteiner af interesse i tumorcellemigration og invasion. Da en fuldblæst genknockdown-effekt under de testede eksperimentelle betingelser tog 3-4 dage efter elektroporation med små interfererende RNA'er (siRNA'er)8, blev cellerne genudgyldt efter elektroporationen og høstet igen 3 dage senere til impedansbaseret realtidsmåling af tumorcellemigration og invasion.
CT10-regulator af kinase (Crk) og Crk-lignende (CrkL) er adaptorproteiner, der medierer protein-proteininteraktioner nedstrøms for forskellige vækstfaktorreceptorkinaseveje og ikke-receptortyrosinkinaseveje12. Forhøjede niveauer af Crk- og CrkL-proteiner bidrager til dårlig prognose i flere humane kræftformer, herunder glioblastom13. Det er imidlertid uklart, hvordan forhøjede Crk- og CrkL-proteiner fører til en dårlig prognose. Derfor er det vigtigt at definere effekten af Crk og CrkL overekspression på tumorcellefunktioner. Tidligere blev der udført en genknockdown-undersøgelse for at demonstrere, at endogene niveauer af Crk- og CrkL-proteiner er nødvendige for glioblastomcellemigration og invasion8. Her er der udviklet et modificeret analysesystem til at adressere effekten af Crk og CrkL overekspression på tumorcellemigration og invasion.
For nylig har in vitro-syntesen af mRNA og dets terapeutiske anvendelser tiltrukket fornyet opmærksomhed på grund af udviklingen af mRNA-vaccinerne mod SARS-CoV-2 (gennemgået af Verbeke et al.14). Derudover er der gjort bemærkelsesværdige fremskridt i brugen af syntetisk mRNA i kræft og andre sygdomme15,16. Elektroporation af celler er en effektiv metode til at levere syntetisk mRNA og inducere forbigående genetisk modifikation (gennemgået af Campillo-Davo et al.17), og brugen af syntetisk mRNA muliggør hurtig og effektiv genekspression i udødeliggjorte fibroblaster 18. Dette metodepapir kombinerer genoverekspression ved hjælp af syntetisk mRNA med celleanalyser i realtid for at studere tumorcellemigration og invasion. Det eksperimentelle skema, der anvendes til siRNA'er, fungerer imidlertid ikke med syntetisk mRNA-transfektion, da niveauet af eksogene proteiner stiger hurtigt og falder gradvist ved syntetisk mRNA-transfektion18. Derfor er metoden blevet modificeret til at udføre realtidsanalyse af cellemigration og invasion lige efter transfektionen uden yderligere dyrkning af cellerne.
Dette metodepapir viser, at kombination af impedansbaserede realtidsmålinger med transfektion af tumorceller med syntetiske mRNA'er giver en hurtig og omfattende analyse af virkningerne af genopregulering på tumorcellemigration og invasion. Dette metodepapir beskriver detaljerede procedurer til måling af, hvordan migration og invasion af glioblastomceller påvirkes af overekspression af Crk og CrkL. Ved at undersøge de koncentrationsafhængige virkninger af syntetisk mRNA på tumorcellemigration beskriver papiret klart, hvordan en stigning i proteinniveauer stimulerer tumorcellemigration. Derudover præsenteres en tilgang til at variere koncentrationen af ECM-gelen for at vurdere virkningerne af ændringer i genekspression på tumorcelleinvasion.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Syntese af mRNA
BEMÆRK: Til mRNA-syntesen skal alle reagenser og udstyr behandles specielt for at inaktivere RNaserne før brug. Se materialefortegnelsen for detaljer om alle de materialer, instrumenter og reagenser, der anvendes i denne protokol.
- Linearisering af DNA
BEMÆRK: Mus-cDNA'er fra CrkI og CrkL blev klonet ind i pFLAG-CMV-5a-ekspressionsvektoren for at tilføje FLAG-epitopmærket ved C-terminalen og subklonet i pcDNA3.1/myc-his-vektoren for at inkorporere T7-promotoren, som tidligere beskrevet 18,19.- Der tilsættes 10 μL 10x reaktionsbuffer, 1,5 μL PmeI (10.000 enheder/ml) og 10 μg plasmid-DNA til et mikrocentrifugerør for at linearisere plasmid-DNA'et med restriktionsenzymet. Tilsæt nukleasefrit vand for at bringe reaktionsvolumenet til 100 μL.
- Bland ved at banke, dreje ned og inkubere reaktionsblandingen ved 37 °C natten over.
- Spin ned, og tilsæt 5 μL 10% natriumdodecylsulfat (SDS) og 1 μL proteinase K (20 mg / ml, RNA-kvalitet) til reaktionsblandingen. Bland ved at banke, dreje ned og inkubere ved 50 °C i 30 minutter.
- Under damphætten tilsættes 100 μL af den nederste fase af phenol: chloroform: isoamylalkohol til plasmidreaktionsblandingen til ekstraktion. Vortex, og centrifuger derefter ved 18.800 × g i 5 min ved stuetemperatur. Flyt den øverste fase til et nyt rør.
- Trin 1.1.4 gentages med chloroform:isoamylalkohol kl. 24:1.
- I det nye rør bringes reaktionsvolumenet til 300 μL ved at tilsætte 200 μL nukleasefrit vand, og derefter tilsættes 30 μL 3 M natriumacetat og 600 μL 100% ethanol.
- Bland ved hvirvelstrøm, og anbring derefter ved -20 °C i 30-60 minutter til ethanoludfældning af DNA'et.
- Der centrifugeres ved 18.800 × g i 20 minutter ved 4 °C, supernatanten kasseres, og pelletpen skylles med 1 ml 70 % ethanol. Centrifugeringen gentages i 10 min, hvorefter supernatanten fjernes helt.
- Tør med hætten åben i 2 minutter, tilsæt 30 μL nukleasefrit vand, og resuspender DNA-pelleten.
- Bestem DNA-koncentrationen ved hjælp af et spektrofotometer.
- Kontroller størrelsen og mængden af det lineariserede DNA ved hjælp af agarosegelelektroforese.
- RNA-syntese ved anvendelse af T7 RNA-polymerase
- Der tilsættes 2 μL hver af 10x transkriptionsbuffer, ATP, GTP, UTP, CTP og T7 og 1 μg lineært DNA til et mikrocentrifugerør. Tilsæt nukleasefrit vand for at bringe reaktionsvolumenet til 20 μL.
- Bland ved at banke, dreje ned og inkubere reaktionsblandingen ved 37 °C i 2 timer til RNA-syntese.
- Drej ned, tilsæt 1 μL DNase (2 U / μL), og inkuber ved 37 ° C i 15 minutter for at fjerne skabelon-DNA'et.
- Lithiumchloridudfældning af RNA
- Der tilsættes 10 μL lithiumchlorid (7,5 M) til reaktionsblandingen. Bland ved at banke, dreje ned og inkubere reaktionsblandingen ved -20 °C i 30 minutter.
- Der centrifugeres ved 18.800 × g i 20 minutter ved 4 °C, supernatanten kasseres, og pellets skylles med 500 μL 70 % ethanol. Centrifugeringen gentages i 10 min, hvorefter supernatanten fjernes helt.
- Tør med hætten åben i 2 minutter, tilsæt 30 μL nukleasefrit vand, og resuspender RNA-pelleten.
- Udjævningen
- RNA-prøven opvarmes til 65 °C i 10 minutter, og den lægges derefter på is til afkøling.
- Der tilsættes 5 μL hver af 10x capping buffer, 10 mM GTP og 1 mM (10x) S-adenosylmethionin (SAM), 2 μL hver af en capping enzymblanding og O-methyltransferase enzymblanding og 1,25 μL RNase-hæmmer. Reaktionsblandingen blandes ved at banke, drejes ned og inkuberes ved 37 °C i 1 time.
- Poly(A) tailing
- Centrifuger prøven, og tilsæt derefter 6 μL nukleasefrit vand, 20 μL 5x E-PAP-buffer, 10 μL 25 mMMnCl2, 10 μL 10 mM ATP og 4 μL E-PAP poly(A) tailingenzym. Reaktionsblandingen blandes ved at banke, drejes ned og inkuberes ved 37 °C i 2 timer.
- Lithiumchloridudfældning og kvantificering af det syntetiske mRNA
- Der tilsættes 50 μL lithiumchlorid (7,5 M), og der udfældes lithiumchlorid som beskrevet i trin 1.3.1-1.3.3.
- Mål koncentrationen af mRNA'et ved hjælp af et spektrofotometer.
- Kontroller størrelsen og mængden af mRNA ved hjælp af formaldehyd (1% -2%) agarose (1%) gelelektroforese.
2. Ekstracellulær matrix (ECM) gelbelægning af celleinvasions- og migrationspladerne (CIM)
BEMÆRK: En celleinvasions- og migrationsplade (CIM) er en kommercielt fremstillet 16-brøndsplade til impedansbaseret celleanalyse i realtid. Til celleinvasionsanalysen skal CIM-plader belægges med ECM-gel, som tidligere beskrevet, men med nogle modifikationer11.
- Fjern en prøve ECM-gelfond fra fryseren, og opbevar den på is.
- ECM-gelen (10 mg/ml) fortyndes til en arbejdskoncentration (100 μg/ml) ved at blande 990 μL af Dulbeccos modificerede ørnemedium (DMEM) (uden serum eller antibiotika) med 10 μL ECM-gel i et mikrocentrifugerør. Bland ved forsigtig pipettering.
- Der tilsættes 60 μL fortyndet ECM-gel til hvert af de 16 huller i CIM-pladens øverste kammer. Anvend metoden med omvendt pipettering, samtidig med at luftbobler20,21 undgås.
BEMÆRK: Optimer koncentrationen af ECM-gelen for hver cellelinje. Til glioblastomcellelinjer blev 0,1 μg/μL til 1 μg/μL ECM-gel anvendt til optimering. - CIM-pladens øverste kammer med pladedækslet af anbringes på en beskyttende plastplade inde i en CO2 -inkubator i ca. 4 timer for at danne et gellag.
FORSIGTIG: Under belægningen af CIM-pladen med ECM-gel bør elektroderne i CIM-pladens øverste kammer ikke have direkte kontakt med eksperimentatorens hænder eller udstyrets overflader, herunder biosikkerhedsskabet eller CO2 -inkubatoren.
3. Forberedelse af tumorcellerne
BEMÆRK: Alle cellekulturmaterialer skal holdes sterile. Høst og elektroporat tumorcellerne under et biologisk sikkerhedsskab med passende personlige værnemidler (PPE), som tidligere beskrevet, men med nogle ændringer11.
- Kultur af tumorcellerne
- Dyrkning U-118MG celler i 10 ml DMEM indeholdende 5% føtalt bovint serum (FBS) og 1% antibiotika pr. 100 mm x 20 mm polystyrenvævskulturskål ved 37 ° C i en 5% CO2 inkubator (kultur tilstand).
- Serumudtømning af tumorcellerne
BEMÆRK: Eksponeringen af cellerne for kemoattractanterne, der er til stede i FBS, skal minimeres før cellemigrations- og invasionsassays ved hjælp af en høj koncentration af FBS.- Fjern det gamle medium, og tilsæt 10 ml forvarmet DMEM indeholdende 0,5% FBS og 1% antibiotika pr. Skål (lavserummedium).
- Gentag trin 3.2.1.
- Cellerne inkuberes ved 37 °C i en 5% CO2 inkubator i 4 timer eller længere.
- Høstning af tumorcellerne
- Fjern det gamle medium, tilsæt 8 ml forvarmet Dulbeccos fosfatbufferede saltvand (DPBS) pr. Skål, fjern DPBS, tilsæt forvarmet 0,05% trypsin-EDTA (2 ml / skål) for at dække overfladen og inkuber i CO2 -inkubatoren i 30 s.
- Opsug trypsin-EDTA omhyggeligt, tilsæt medium med lavt serumindhold (7 ml / skål), og saml derefter celler i et 50 ml eller 15 ml centrifugerør.
- Aliquot et lille volumen celler, og brug en håndholdt automatiseret celletæller til at tælle cellerne.
- Beregn det samlede antal celler og det krævede volumen for 10.000 celler / μL.
- Centrifuger cellerne ned ved at centrifugere dem ved 100 × g i 5 minutter ved stuetemperatur, aspirer supernatanten, tilsæt det beregnede volumen DMEM indeholdende 0,5% FBS (uden antibiotika), og resuspender forsigtigt cellepelleten.
- Der overføres 110 μL af cellesuspensionen, der indeholder 1,1 millioner celler, til et mikrocentrifugerør for hver behandling.
- Gentag trin 3.3.6 for at overføre cellerne til fire mikrocentrifugeglas til fire forskellige behandlinger.
BEMÆRK: En CIM-plade har i alt 16 brønde. Design fire forskellige behandlinger til sammenligning, så fire brønde i CIM-pladen kan tildeles til hver behandling. Brug de elektroporerede celler til følgende eksperimenter: western blot-analyser (0,3 millioner celler pr. 35 mm vævskulturskål), fire brønde med realtidscellemigrationsassays (0,1 millioner celler / brønd) og fire brønde med realtidscelleinvasionsassays (0,1 millioner celler / brønd) til hver behandling. Juster antallet af celler, der skal elektroporeres, hvis det eksperimentelle design ændres.
4. Elektroporation af tumorcellerne
- For at fjerne substratet tilsættes 1 ml DPBS til cellesuspensionen i hvert glas, cellesuspensionen drejes ned tre gange i 10 s hver gang, mens glasset roteres 180° hver 10. sek. ved hjælp af en minicentrifuge, og supernatanten fjernes ved hjælp af en mikropipette.
BEMÆRK: Det er vigtigt at danne en kompakt, men let resuspenderbar cellepellet. - Tilsæt 110 μL resuspensionsbuffer R til cellepelleten for at opnå 0,1 millioner celler i 10 μL.
- Tilsæt syntetisk mRNA til cellepelleten for at opnå en koncentration på 0,2-20 ng / μL afhængigt af det ønskede ekspressionsniveau. Bland og resuspender cellepillen forsigtigt ved at banke eller forsigtigt pipettere.
BEMÆRK: Brug forskellige koncentrationer af syntetisk mRNA, undersøg proteinekspressionen ved hjælp af western blot-analyse, og bestem koncentrationen af syntetisk mRNA, der fører til det ønskede ekspressionsniveau for at undersøge den specifikke sammenhæng mellem proteinekspressionen og biologiske effekter. - Elektroporat 10 μL af cellesuspensionen med et elektroporationssystem ved 1.350 V i 10 ms med tre impulser hver gang.
- Overfør de elektroporerede celler til et nyt mikrocentrifugerør med 1,1 ml DMEM indeholdende 0,5% FBS.
- Elektroporationen gentages, indtil resten af cellesuspensionen er elektroporeret. Kombiner de elektroporerede celler i mikrocentrifugerøret for at opnå 1,1 millioner celler i 1,1 ml.
BEMÆRK: Både 100 μL og 10 μL elektroporationsspidser kan bruges til elektroporation af et stort volumen celler, men elektroporationsspidserne til 10 μL og 100 μL er inkluderet i to separate sæt og skal købes separat. Resuspensionsbuffer R er inkluderet i begge sæt. - Når alle de respektive elektroporationer er afsluttet, resuspenderes de poolede celler forsigtigt.
- Plade 0,3 millioner celler i en 35 mm x 10 mm polystyrenvævskulturskål med 2 ml DMEM indeholdende 5% FBS, og dyrk cellerne i 1 dag under dyrkningsbetingelsen for total cellelysatpræparation og western blot-analyser.
- Opbevar resten af de elektroporerede celler ved stuetemperatur, indtil celleanalysesystemet i realtid er klar.
5. Opsætning af realtidscelleanalysatoren, programmet og CIM-pladerne
BEMÆRK: Klargør realtidscelleanalysatoren og to CIM-plader som tidligere beskrevet11.
- Ligevægt af realtidscelleanalysatoren
- Flyt realtidscelleanalysatoren til en CO2 -inkubator flere timer før brug for at afbalancere systemet under dyrkningstilstanden.
- Opsætning af analyseprogrammet
- Åbn analyseprogrammet ved at dobbeltklikke på ikonet for realtidscelleanalysesoftware på skrivebordet.
- Når indstillingen Standardopsætning af eksperimentmønster er åben, skal du vælge indstillingen for at køre tre eksperimenter separat.
BEMÆRK: Hver holder har et separat vindue. Der er forskellige faner til opsætning af måleinterval og varighed, dataanalyse og andre eksperimentelle betingelser. - Åbn hver holder ved at klikke på fanen Nummer .
- Klik på fanen Eksperimentnoter , vælg den mappe, som dataene skal gemmes i, og indtast navnet på eksperimentet.
- Klik på fanen Layout , opsæt firdobbelte brønde for hver behandlingstilstand ved at vælge fire brønde ad gangen og indtaste prøveoplysningerne, og klik derefter på Anvend.
- Klik på fanen Planlæg | Tilføj et trin for at konfigurere totrinstilstanden for celleimpedansmålingerne. Klik derefter på Anvend for at konfigurere det første trin.
- Klik på Tilføj et trin igen, indtast 10 minutter for intervallet og 48 timer for varigheden for migration og invasion, og klik på Anvend for at konfigurere det andet trin.
BEMÆRK: Det første trin tager en engangsmåling af baseline (et sweep med et interval på 1 min). Det andet trin måler celleimpedansen for eksperimentet (for eksempel 289 fejninger med et interval på 10 minutter i 48 timer) ved holderen. Juster intervallet og varigheden afhængigt af det eksperimentelle design. - Gå til næste holder, og sæt den op ved at gentage trin 5.2.3-5.2.7.
- Klargøring af CIM-pladerne
- En time før celleimpedansmålingen starter, fyldes hullerne i CIM-pladens nedre kammer med 160 μL DMEM indeholdende 10% serum eller andre kemoattractanter.
- Saml det øverste kammer, der indeholder ECM-gelbelagte brønde (til invasion) eller ubelagte brønde (til migration) med det nederste kammer.
- Der tilsættes 50 μL substrat med lavt serumindhold til hullerne i CIM-pladens øverste kammer til cellemigrationsassayet, og CIM-pladen anbringes i systemets vugge.
- Klik på fanen Meddelelse , og sørg for, at meddelelsen Forbindelser ok vises. CIM-pladen er nu klar til eksperimentet.
- Preinkuber den samlede CIM-plade i CO2 -inkubatoren i 30-60 minutter før realtidscelleanalysen for at akklimatisere CIM-pladen til kulturtilstanden.
6. Celleanalyse i realtid og dataeksport
BEMÆRK: Udfør en baseline-aflæsning, celleseedning, celleimpedansmåling og dataeksport som tidligere beskrevet11.
- Baseline læsning
BEMÆRK: Baseline skal aflæses, efter at CIM-pladen er akklimatiseret, og før cellerne tilsættes hullerne i det øverste kammer.- Klik på Start-knappen for hver holder. Når vinduet Gem som vises, skal du gemme den eksperimentelle fil for at udføre grundlinjelæsningen.
- Celle såning
- Fjern CIM-pladen fra holderen, og læg den i biosikkerhedsskabet på pladeholderen.
- Der tilsættes 100 μL (indeholdende 100.000 celler) elektroporerede celler til hullerne i CIM-pladens øverste kammer i henhold til programmet i styreenheden. Anvend den omvendte pipetteringsmetode, samtidig med at du undgår luftbobler.
- Lad CIM-pladen stå under biosikkerhedsskabet i 30 minutter ved stuetemperatur for at sikre, at cellerne spredes jævnt på brøndbunden.
- Måling af celleimpedans
- Flyt den fuldt monterede CIM-plade tilbage til den respektive holder. Klik på knappen Start for holderen for at starte celleimpedansmålingen i det andet trin.
- Klik på fanen Plot , klik derefter på Tilføj alle knappen, og vælg felterne Gennemsnit og STD DEV for at visualisere dataene i realtid.
BEMÆRK: Standardindstillingen for afbildning er Tid for x-aksen og Celleindeks for y-aksen. Afsnittet Valg af plot giver brugeren mulighed for at vælge alternative indstillinger for y-aksen: Normaliseret celleindeks eller Delta celleindeks. Når den endelige fejning er foretaget, er eksperimentet afsluttet, og resultaterne gemmes automatisk.
- Eksport af data til analyse
- Klik på fanen Afbildning , og vælg felterne Gennemsnit og STD DEV for at kopiere dataene for hver brønd individuelt.
- Højreklik på plotområdet, og vælg Kopier data i listeformat.
- Åbn en tom regnearksfil, indsæt dataene, og gem derefter filen.
- Gå tilbage til analyseprogrammet, klik på fanen Plade for hver holder, og vælg Slip for at lukke eksperimentet for holderen.
- Gå tilbage til regnearksfilen, og juster tidspunktet for de rå data, så starttidspunktet på det andet trin bliver det faktiske starttidspunkt for målingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Crk- og CrkL-proteiner spiller vigtige roller i motiliteten af mange celletyper, herunder neuroner22, T-celler23, fibroblaster 18,19 og en række tumorceller13. Da Crk- og CrkL-proteiner er rapporteret at være forhøjet i glioblastom24,25,26, blev virkningerne af overekspression af CrkI, en splejsningsvariant af Crk, på glioblastomcellemigration undersøgt i dette arbejde. U-118MG-celler blev elektroporeret med forskellige koncentrationer af syntetisk CrkI mRNA og analyseret for proteinniveauer og cellemigration. Elektroporationen af U-118MG glioblastomceller med varierende koncentrationer af syntetisk CrkI mRNA resulterede i en koncentrationsafhængig stigning i FLAG-mærket CrkI-protein 1 dag efter transfektion (figur 1A). Mens 0,2 ng/μL og 2 ng/μL mRNA førte til en uopdagelig eller beskeden ekspression af det eksogene CrkI-protein, resulterede 20 ng/μL mRNA i et meget højere ekspressionsniveau end det endogene CrkI-protein.
Resultaterne fra cellemigrationsanalysen ved hjælp af realtidscelleanalysesystemet indikerede, at elektroporationen med 0,2 ng / μL eller 2 ng / μL CrkI mRNA ikke i høj grad påvirkede cellemigrationen. Imidlertid førte elektroporation med 20 ng / μL CrkI mRNA til en klar stimulering af cellemigration, hvor flere celler migrerede mellem 2 timer og 13 timer (figur 1B). Sammenligningen mellem CrkI-proteinniveauet og cellemigrationen afslørede, at glioblastomcellemigration blev stimuleret af stigningen i CrkI-proteinniveauet. Det ser ud til, at CrkI-proteinniveauet skulle være højere end en vis tærskel for at forårsage en betydelig stimulering af cellemigration. Hvis cellemigrationen var blevet målt på forskellige måder for at tælle eller observere de migrerede celler på bestemte tidspunkter, kunne det have været nødvendigt med en meget større indsats for at identificere denne form for ændring i cellemigration.
For at undersøge, hvordan CrkL-overekspression påvirker glioblastomcelleinvasion gennem ECM-gellag med forskellige koncentrationer af ECM-proteiner, blev U-118MG-celler elektroporeret med syntetisk CrkL mRNA og analyseret med hensyn til proteinniveauerne og celleinvasionen gennem et ECM-gellag. Elektroporationen af U-118MG glioblastomceller med syntetisk CrkL mRNA førte til en robust ekspression af FLAG-mærket CrkL-protein 1 dag efter transfektion (figur 2A). Da koncentrationen af ECM-proteiner steg, blev invasionen af kontrolcellerne langsommere (figur 2B). CrkL-overekspressive celler viste også et ECM-gelkoncentrationsafhængigt fald i celleinvasion (figur 2C). Sammenligningen mellem kontrol- og CrkL-overekspressionsceller ved forskellige ECM-gelkoncentrationer indikerede, at CrkL-overekspression generelt stimulerede celleinvasion gennem ECM-gellaget (figur 2D-G). Forskellen mellem de to cellepopulationer blev imidlertid tydelig på forskellige tidspunkter afhængigt af ECM-gelkoncentrationen.
For 0,1 μg/μL ECM-gelen var CrkL-overekspressionsmedieret stimulering af celleinvasion tydelig mellem 8 timer og 20 timer (figur 2D), men forskellen i celleinvasion var ubetydelig efter 32 timer. For 0,2 μg/μL ECM-gelen var forskellen i celleinvasion med og uden CrkL-overekspression til enhver tid minimal (figur 2E). For 0,5 μg/μL ECM-gelen var forskellen i celleinvasion tydelig mellem 24 timer og 36 timer (figur 2F). For 1 μg/μL ECM-gelen blev CrkL-overekspressionseffekten på celleinvasionen let tydelig ved 48 timer (figur 2G). Resultaterne tyder på, at vinduet til at detektere forskellen mellem kontrol- og CrkL-overekspressionscellerne skifter til senere tidspunkter, efterhånden som koncentrationen af ECM-gelen stiger. Resultaterne tyder også på, at de to cellepopulationer blev forskelligt påvirket af stigningen i ECM-gelkoncentrationen på forskellige tidspunkter. For eksempel viste CrkL-overekspressionscellerne ved 12 timer kun signifikant højere invasion ved 0,1 μg / μL ECM-gel (figur 2H). Ved 24 timer viste CrkL-overekspressionscellerne imidlertid en lidt højere eller lignende invasion ved de testede ECM-gelkoncentrationer (figur 2I). Derfor er det vigtigt at undersøge både de tidsafhængige og ECM gelkoncentrationsafhængige forskelle i celleinvasion for at få et samlet overblik over forskellene mellem de to cellepopulationer med og uden CrkL-overekspression. Disse resultater viser, at kombination af forbigående overekspression ved hjælp af syntetisk mRNA med impedansbaserede realtidscelleanalyser giver et kraftfuldt værktøj til at analysere den potentielle sammenhæng mellem genoverekspression og tumorcellemigration og invasion. Undersøgelse af virkningerne af koncentrationsvariationer i syntetisk mRNA og ECM-gel ville give mere nøjagtige og detaljerede oplysninger.
Figur 1: Virkningerne af CrkI-overekspression på glioblastomcellemigration. U-118MG-celler blev elektroporeret med de angivne koncentrationer (ng / μL) af FLAG-mærket CrkI mRNA. (A) Til western blot-analyserne blev de elektroporerede celler dyrket i 1 dag før det totale cellelysatpræparat. Proteinniveauerne ved transfektion med syntetisk CrkI mRNA blev sammenlignet. Anti-CRK- og anti-CrkL-antistoffer blev brugt til at detektere både de endogene og de FLAG-mærkede proteiner og til at sammenligne forholdet mellem de endogene proteiner og FLAG-mærkede proteiner. Vinculin og α-tubulin blev brugt som belastningskontrol. (B) Til cellemigrationsanalyserne blev de elektroporerede celler belagt på en CIM-plade uden yderligere dyrkning. Celleindeksværdier blev opnået fra fire brønde for hver prøve, og deres gennemsnitlige ± SD-værdier vises. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Virkninger af CrkL-overekspression på glioblastomcelleinvasion. U-118MG-celler blev elektroporeret med nukleasefriH2Oeller 20 ng/μL FLAG-mærket CrkL mRNA. (A) Til western blot-analyserne blev de elektroporerede celler dyrket i 1 dag før det totale cellelysatpræparat. Proteinniveauerne ved transfektion med syntetisk CrkL mRNA blev sammenlignet. Anti-CRK- og anti-CrkL-antistoffer blev brugt til at detektere både de endogene og de FLAG-mærkede proteiner og til at sammenligne forholdet mellem de endogene proteiner og FLAG-mærkede proteiner. Vinculin og α-tubulin blev brugt som belastningskontrol. (B-G) Til celleinvasionsanalysen blev de elektroporerede celler belagt på en CIM-plade med en ECM-gelbelægning uden yderligere dyrkning. Celleindeksværdierne blev opnået fra fire brønde for hver prøve, og deres gennemsnitlige ± SD-værdier vises. (B) Celleinvasionsdataene fra kontrolcellerne med forskellige ECM-gelkoncentrationer blev sammenlignet. (C) Celleinvasionsdataene fra CrkL-overekspressive celler med forskellige ECM-gelkoncentrationer blev sammenlignet. (D-G) Celleinvasionsdataene mellem kontrol- og CrkL-overekspressionscellerne blev sammenlignet for den indikerede ECM-gelkoncentration. (H) En sammenligning af celleinvasionen ved 12 timer mellem kontrol- og CrkL-overekspressionscellerne. (I) En sammenligning af celleinvasionen ved 24 timer mellem kontrol- og CrkL-overekspressionscellerne. Forkortelser: ECM = ekstracellulær matrix; CIM = celleinvasion og migration. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Skematiske diagrammer over de eksperimentelle procedurer efter genknockdown eller genoverekspression . (A) Den eksperimentelle procedure for realtidscelleanalysen efter siRNA-transfektionen. Da det tager 3-4 dage at inducere fuldstændig genknockdown efter siRNA-transfektion under de eksperimentelle betingelser, blev cellerne genbelagt og dyrket i 3 dage efter elektroporationen, før de var klar til celleanalyser i realtid. (B) Den eksperimentelle procedure for realtidscelleanalyse efter syntetisk mRNA-transfektion. Da proteinekspressionen fra syntetisk mRNA-transfektion er hurtig, blev de elektroporerede celler brugt til celleanalyser i realtid samme dag. Bemærk forskellen mellem de to eksperimentelle procedurer; mens celleanalyse i realtid blev udført 3 dage efter elektroporationen for genknockdown ved hjælp af siRNA'er, blev celleanalyse i realtid udført lige efter elektroporationen for genoverekspression med syntetisk mRNA. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Migration og invasion er vigtige træk ved tumorceller. Måling af tumorcellernes bevægelighed og forståelse af den underliggende mekanisme, der styrer tumorcellemotilitet, giver kritisk indsigt i terapeutiske interventioner 2,27. Der er udviklet flere metoder til at studere cellemigration7. Sårhelingsanalysen ved hjælp af ridser eller kulturindsatser er en enkel og ofte anvendt metode, der giver kontrasterende billeder af hullukning. Det individuelle cellesporingsassay kræver overvågning af individuelle celler med time-lapse-billeddannelse, for hvilke cellerne kan mærkes med fluorescerende farvestoffer. Både sårhelingsanalysen og den individuelle cellesporingsanalyse måler cellernes spontane bevægelse.
Ved hjælp af time-lapse-billeddannelse og intensiv databehandling efter rekvisitionen kan begge assays give kvantitative sammenligninger mellem prøver28. Disse analyser er imidlertid ikke egnede til at studere celleinvasion gennem et ECM-proteinlag. I modsætning hertil måler transwellmigrations- og invasionsassays rettet cellemigration gennem en transwell-indsatsmembran med eller uden et ECM-proteinlag. Imidlertid er kontinuerlig overvågning ikke mulig med disse assays, fordi de migrerede celler skal indsamles på et givet tidspunkt, og transbrønden ikke kan bruges igen. Alle disse analyser kræver betydelig tid og kræfter til databehandling eller til praktiske eksperimenter for at indsamle og tælle cellerne, hvilket resulterer i potentielle operatørrelaterede variationer. Den største udfordring for disse analyser er at foretage sofistikerede kvantitative sammenligninger mellem flere, kombinerede behandlinger på forskellige tidspunkter.
Brugen af realtidscelleanalysesystemet, der præsenteres i dette arbejde, giver mulighed for kvantitativ, kontinuerlig og omfattende overvågning til måling af cellemigration og invasion, og dette system har mange fordele i forhold til andre enkle cellemotilitetsassays, som giver resultater på begrænsede, faste tidspunkter. Som med andre analyser skal de eksperimentelle betingelser for realtidscelleanalyserne optimeres for hver cellelinje, da migration og invasion af forskellige cellelinjer kan påvirkes forskelligt af cellenummeret. Desuden falder celleinvasionshastigheden, når koncentrationen af ECM-gelen stiger (figur 2B, C). Derfor anbefales det at teste forskellige ECM-gelkoncentrationer og sammenligne virkningerne af genekspressionsændringer på celleinvasion under disse forskellige ECM-gelkoncentrationer.
Med celleanalysesystemet i realtid er optimering let og ligetil, da analysesystemet producerer data i realtid uden praktisk tid. Assaysystemet identificerer, hvor hurtigt cellerne migrerer eller invaderer, og hvornår de når det maksimale cellemigrations- eller invasionsniveau. Indhentning af disse oplysninger om cellemotilitet muliggør detaljerede komparative analyser blandt forskellige behandlingsgrupper, hvilket kan gøres ved blot at bruge programmets indbyggede funktioner. Desuden muliggør følsomheden af realtidsanalysesystemet identifikation og kvantificering af subtile ændringer i cellemigration og invasion ved koncentrationsafhængig genekspression, som vist i figur 1 og figur 2.
Tidligere blev der tilvejebragt en detaljeret procedure til måling af tumorcellemigration og invasion efter genknockdown ved hjælp af det impedansbaserede realtidscelleanalysesystem. Da genknockdown tager 3-4 dage efter, at cellerne er elektroporeret med siRNA'er, blev cellerne genbelagt efter elektroporation. De elektroporerede celler blev dyrket i 3 dage, før de blev høstet igen til realtidscelleanalyserne, hvilket gjorde hele eksperimentet til en totrinsproces: elektroporation på dag 1 og celleanalyse i realtid på dag 4, som vist i figur 3. I modsætning hertil er genekspression ved elektroporation af celler med syntetisk mRNA hurtig og effektiv, da time-lapse-analysen af fibroblaster elektroporeret med syntetisk mRNA til GFP viste et stærkt GFP-signal 5 timer efter transfektion; Fluorescensintensiteten nåede et maksimum omkring 24 timer, hvorefter der var et gradvist fald i fluorescenssignalet18.
Derudover viste U-118MG-cellerne i dette arbejde robust ekspression af det eksogene protein, når de blev elektroporeret med syntetisk mRNA for CrkI (figur 1A) og for CrkL (figur 2A), i overensstemmelse med tidligere observationer8. Derfor er det hensigtsmæssigt at udføre celleanalyser i realtid lige efter elektroporation. Nogle af trinene til celleanalyse i realtid skal udføres, før cellerne høstes til elektroporation. Hele eksperimentet er en et-trins proces, der involverer elektroporation og celleanalyse i realtid på dag 1. Det impedansbaserede realtidscelleanalysesystem er blevet brugt i vid udstrækning til at studere tumorcellemigration og invasion i forskellige faste tumorceller, herunder brystkræft29, kolorektal cancer 30, melanom 31, kræft i æggestokkene 32, pladekræft i hoved og hals 33, renalcellekarcinom 34, bugspytkirtelkarcinom 35, hepatocellulært karcinom 36 og ikke-småcellet lungekræftceller 10. Derfor gør den kombinerede anvendelse af genoverekspression ved hjælp af mRNA eller genknockdown ved hjælp af siRNA'er realtidsmåling af cellemigration og invasion mere nyttig og anvendelig.
Begrænsningen ved denne protokol er, at denne metode kræver dissociering og høstning af celler lige før måling af cellemigration og invasion. De enzymatiske og mekaniske behandlinger under dissociation, høst og resuspension kan påvirke analysen37. Derudover kan der være en forsinkelse i cellemigration, mens cellerne kommer sig efter de enzymatiske og mekaniske behandlinger. Denne metode er muligvis ikke hensigtsmæssig, hvis cellerne let beskadiges ved trypsinisering eller andre mekaniske behandlinger under enkeltcelledissociation og indsamling eller kræver en lang restitutionstid efter disse manipulationer. Denne begrænsning gælder også for transwell-migrationsassayet, som er en anden metode til måling af rettet cellemigration. Desuden kan elektroporationen efter celleforberedelse gøre cellerne mere sårbare over for skader38. Derfor er det vigtigt at optimere betingelserne for elektroporation for hver cellelinje og også at elektroporate kontrolcellerne for mere nøjagtige sammenligninger.
Producentens hjemmeside for elektroporationssystemet indeholder de anbefalede parametre for elektroporation (se fodnoten i materialetabellen). Brug af konsistente og minimalt skadelige eksperimentelle betingelser under celledissociation og resuspension er afgørende for at opnå reproducerbare resultater. Desuden er korrelering af mængden af mRNA, proteinniveauet og cellemotiliteten afgørende for at skelne mellem de specifikke og uspecifikke virkninger af mRNA-transfektion. I dette arbejde blev det observeret, at hvis mRNA-koncentrationen oversteg et bestemt niveau, hæmmede den uspecifikt cellulære funktioner, herunder cellemigration og invasion (data ikke vist). Derfor er det vigtigt at titrere koncentrationen af mRNA. Derudover er det afgørende at udføre celleanalysen i realtid, når proteinekspressionen er på sit højeste niveau, da proteinekspression er forbigående med mRNA-transfektion. Som med andre cellemotilitetsanalyser kan resultaterne af denne celleanalyse i realtid forvirres af spredning af celler under migration. Derfor anbefales det yderligere at udføre et celleproliferationsassay for at forstå indflydelsen af celleproliferation på cellemigrations- og invasionsresultaterne.
Proteinniveauerne af Crk og CrkL er kendt for at være forhøjet i nogle typer af humane kræftformer. Da ekspressionen af Crk og CrkL korrelerer med forskellige tumorcellefunktioner, og deres overekspression bidrager til dårlig prognose, er Crk og CrkL blevet foreslået som terapeutiske mål for kræftbehandling13. Tidligere blev genknockdown induceret i glioblastomceller for at demonstrere, at glioblastomcellemigration og invasion er robuste markører for Crk- og CrkL-aktivitet. Den aktuelle undersøgelse giver en systematisk genekspressionstilgang til at inducere overekspression af Crk og CrkL ved hjælp af syntetisk mRNA. En tæt korrelation blev opnået mellem proteinniveauerne af Crk og CrkL og glioblastomcellemigration og invasion ved hjælp af realtidscelleanalysesystemet. Resultaterne understøtter yderligere hypotesen om, at Crk og CrkL spiller væsentlige roller i glioblastomcellemigration og invasion. Sammen med det tidligere metodepapir11 giver denne undersøgelse en proof-of-concept-tilgang til undersøgelse af en potentiel sammenhæng mellem ændringer i genekspression og tumorcellemigration og invasion.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter at oplyse.
Acknowledgments
Forfatterne takker Medical Writing Center ved Children's Mercy Kansas City for at redigere dette manuskript. Dette arbejde blev støttet af Natalies A.R.T. Foundation (til T.P.) og af et MCA Partners Advisory Board-tilskud fra Children's Mercy Hospital (CMH) og University of Kansas Cancer Center (KUCC) (til T.P.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AlphaImager HP | ProteinSimple | 92-13823-00 | Agarose gel imaging system |
| α-Tubulin antibody | Sigma | T9026 | Used to detect α-tubulin protein (dilution 1:3,000) |
| CIM-plate 16 | Agilent Technologies, Inc | 5665825001 | Cell invasion and migration plates |
| Crk antibody | BD Biosciences | 610035 | Used to detect CrkI and CrkII proteins (dilution 1:1,500) |
| CrkL antibody | Santa Cruz | sc-319 | Used to detect CrkL protein (dilution 1:1,500) |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) | ATCC | 302002 | Cell culture medium |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) | Corning | 21-031-CV | Buffer used to wash cells |
| Fetal bovine serum (FBS) | Hyclone | SH30910.03 | Culture medium supplement |
| Heracell VIOS 160i CO2 incubator | Thermo Scientific | 51030285 | CO2 incubator |
| IRDye 800CW goat anti-mouse IgG secondary antibody | Li-Cor | 926-32210 | Secondary antibody for Western blot analysis (dilution 1:10,000) |
| IRDye 800CW goat anti-rabbit IgG secondary antibody | Li-Cor | 926-32211 | Secondary antibody for Western blot analysis (dilution 1:10,000) |
| Lithium chloride | Invitrogen | AM9480 | Used for RNA precipitation |
| Matrigel matrix | Corning | 354234 | Extracellular matrix (ECM) gel |
| MEGAscript T7 transcription kit | Invitrogen | AM1334 | Used for RNA synthesis |
| Millennium RNA markers | Invitrogen | AM7150 | Used for formaldehyde agarose gel electrophoresis |
| Mini centrifuge | ISC BioExpress | C1301P-ISC | Used to spin down cells |
| Mouse brain QUICK-Clone cDNA | TaKaRa | 637301 | Source of genes (inserts) for cloning |
| NanoQuant | Tecan | M200PRO | Nucleic acid quantification system |
| Neon electroporation system | ThermoFisher Scientific | MPK5000 | Electroporation system1 |
| Neon transfection system 10 µL kit | ThermoFisher Scientific | MPK1025 | Electroporation kit |
| Neon transfection system 100 µL kit | ThermoFisher Scientific | MPK10096 | Electroporation kit |
| NorthernMax denaturing gel buffer | Invitrogen | AM8676 | Used for formaldehyde agarose gel electrophoresis |
| NorthernMax formaldehyde load dye | Invitrogen | AM8552 | Used for formaldehyde agarose gel electrophoresis |
| NorthernMax running buffer | Invitrogen | AM8671 | Used for formaldehyde agarose gel electrophoresis |
| Nuclease-free water | Teknova | W3331 | Used for various reactions during mRNA synthesis |
| Odyssey CLx Imager | Li-Cor | Imager for Western blot analysis | |
| pcDNA3.1/myc-His | Invitrogen | V80020 | The vector into which inserts (mouse CrkI and CrkL cDNAs) were cloned |
| pFLAG-CMV-5a | Millipore Sigma | E7523 | Source of the FLAG epitope tag |
| Phenol:chloroform:isoamyl alcohol | Sigma | P2069 | Used for DNA extraction |
| PmeI | New England BioLabs | R0560L | Used to linearize the plasmids for mRNA synthesis |
| Poly(A) tailing kit | Invitrogen | AM1350 | Used for poly(A) tail reaction |
| Polystyrene tissue culture dish (100 x 20 mm style) | Corning | 353003 | Used for culturing cells before transfection |
| Polystyrene tissue culture dish (35 x 10 mm style) | Corning | 353001 | Used for culturing transfected cells |
| Proteinase K | Invitrogen | 25530049 | Used to remove protein in the reaction mixture |
| Purifier Axiom Class II, Type C1 | Labconco Corporation | 304410001 | Biosafety cabinet for sterile handling of cells |
| Resuspension Buffer R | ThermoFisher Scientific | A buffer included in the electroporation kits, MPK1025 and MPK10096. The buffer is used to resupend cells before electroporation, and its composition is proprietary information. | |
| RNaseZap | Invitrogen | AM9780 | RNA decontamination solution |
| Scepter | Millipore | C85360 | Handheld automated cell counter |
| ScriptCap 2'-O-methyltransferase kit | Cellscript | C-SCMT0625 | Used for capping reaction |
| ScriptCap m7G capping system | Cellscript | C-SCCE0625 | Used for capping reaction |
| Sodium dodecyl sulfate solution | Invitrogen | 15553-035 | Detergent used for the proteinase K reaction |
| Sorvall Legend XT centrifuge | Thermo Scientific | 75004532 | Benchtop centrifuge to spin down cells |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25300-054 | Used for dissociation of cells |
| U-118MG | ATCC | HTB15 | An adherent cell line derived from a human glioblastoma patient |
| Vinculin antibody | Sigma | V9131 | Used to detect vinculin protein (dilution 1:100,000) |
| xCELLigence RTCA DP | Agilent Technologies, Inc | 380601050 | Instrument used for real-time cell analysis |
| 1Electroporation parameters and other related information for various cell lines are available on the manufacturer's homepage (https://www.thermofisher.com/us/en/home/life-science/cell-culture/transfection/neon-transfection-system/neon-transfection-system-cell-line-data.html?). |
References
- Palmer, T. D., Ashby, W. J., Lewis, J. D., Zijlstra, A. Targeting tumor cell motility to prevent metastasis. Advanced Drug Delivery Reviews. 63 (8), 568-581 (2011).
- Eccles, S. A., Box, C., Court, W. Cell migration/invasion assays and their application in cancer drug discovery. Biotechnology Annual Review. 11, 391-421 (2005).
- Kluiver, T. A., Alieva, M., van Vuurden, D. G., Wehrens, E. J., Rios, A. C. Invaders exposed: Understanding and targeting tumor cell invasion in diffuse intrinsic pontine glioma. Frontiers in Oncology. 10, 92 (2020).
- Xie, Q., Mittal, S., Berens, M. E. Targeting adaptive glioblastoma: An overview of proliferation and invasion. Neuro-Oncology. 16 (12), 1575-1584 (2014).
- Wee, Y., Wang, T., Liu, Y., Li, X., Zhao, M. A pan-cancer study of copy number gain and up-regulation in human oncogenes. Life Sciences. 211, 206-214 (2018).
- Zhao, M., Liu, Y., Qu, H. Expression of epithelial-mesenchymal transition-related genes increases with copy number in multiple cancer types. Oncotarget. 7 (17), 24688-24699 (2016).
- Pijuan, J., et al. In vitro cell migration, invasion, and adhesion assays: From cell imaging to data analysis. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 7, 107 (2019).
- Park, T., Large, N., Curran, T. Quantitative assessment of glioblastoma phenotypes in vitro establishes cell migration as a robust readout of Crk and CrkL activity. The Journal of Biological Chemistry. 296, 100390 (2021).
- Urcan, E., et al. Real-time xCELLigence impedance analysis of the cytotoxicity of dental composite components on human gingival fibroblasts. Dental Materials. 26 (1), 51-58 (2010).
- Limame, R., et al. Comparative analysis of dynamic cell viability, migration and invasion assessments by novel real-time technology and classic endpoint assays. PLoS One. 7 (10), e46536 (2012).
- Mudduluru, G., Large, N., Park, T. Impedance-based real-time measurement of cancer cell migration and invasion. Journal of Visualized Experiments. (158), e60997 (2020).
- Feller, S. M. Crk family adaptors-signalling complex formation and biological roles. Oncogene. 20 (44), 6348-6371 (2001).
- Park, T. Crk and CrkL as therapeutic targets for cancer treatment. Cells. 10 (4), 739 (2021).
- Verbeke, R., Lentacker, I., De Smedt, S. C., Dewitte, H. The dawn of mRNA vaccines: The COVID-19 case. Journal of Controlled Release. 333, 511-520 (2021).
- Heine, A., Juranek, S., Brossart, P. Clinical and immunological effects of mRNA vaccines in malignant diseases. Molecular Cancer. 20 (1), 52 (2021).
- Kwon, H., et al. Emergence of synthetic mRNA: In vitro synthesis of mRNA and its applications in regenerative medicine. Biomaterials. 156, 172-193 (2018).
- Campillo-Davo, D., et al. The ins and outs of messenger RNA electroporation for physical gene delivery in immune cell-based therapy. Pharmaceutics. 13 (3), 396 (2021).
- Park, T., Koptyra, M., Curran, T. Fibroblast growth requires CT10 regulator of kinase (Crk) and Crk-like (CrkL). The Journal of Biological Chemistry. 291 (51), 26273-26290 (2016).
- Park, T. J., Curran, T. Essential roles of Crk and CrkL in fibroblast structure and motility. Oncogene. 33 (43), 5121-5132 (2014).
- Chou, P. P., Jaynes, P. K., King, B. P., Chapman, E., Bailey, J. L. Precision comparison between conventional (method-I) and reverse (method-Ii) pipetting. Clinical Chemistry. 30 (6), 958 (1984).
- Pushparaj, P. N. Revisiting the micropipetting techniques in biomedical sciences: A fundamental prerequisite in good laboratory practice. Bioinformation. 16 (1), 8-12 (2020).
- Park, T. J., Curran, T. Crk and Crk-like play essential overlapping roles downstream of disabled-1 in the Reelin pathway. The Journal of Neuroscience. 28 (50), 13551-13562 (2008).
- Huang, Y., et al. CRK proteins selectively regulate T cell migration into inflamed tissues. The Journal of Clinical Investigation. 125 (3), 1019-1032 (2015).
- Wang, L., et al. Signaling adaptor protein Crk is indispensable for malignant feature of glioblastoma cell line KMG4. Biochemical and Biophysical Research Communications. 362 (4), 976-981 (2007).
- Kumar, S., et al. Reciprocal regulation of Abl kinase by Crk Y251 and Abi1 controls invasive phenotypes in glioblastoma. Oncotarget. 6 (35), 37792-37807 (2015).
- Kumar, S., et al. Crk tyrosine phosphorylation regulates PDGF-BB-inducible Src activation and breast tumorigenicity and metastasis. Molecular Cancer Research. 16 (1), 173-183 (2018).
- Raudenska, M., et al. Engine shutdown: Migrastatic strategies and prevention of metastases. Trends in Cancer. 9 (4), 293-308 (2023).
- Decaestecker, C., Debeir, O., Van Ham, P., Kiss, R. Can anti-migratory drugs be screened in vitro? A review of 2D and 3D assays for the quantitative analysis of cell migration. Medicinal Research Reviews. 27 (2), 149-176 (2007).
- Farasani, A., Darbre, P. D. Long-term exposure to triclosan increases migration and invasion of human breast epithelial cells in vitro. Journal of Applied Toxicology. 41 (7), 1115-1126 (2021).
- Hanusova, V., Skalova, L., Kralova, V., Matouskova, P. The effect of flubendazole on adhesion and migration in SW480 and SW620 colon cancer cells. Anti-Cancer Agents in Medicinal Chemistry. 18 (6), 837-846 (2018).
- Lago-Baameiro, N., et al. PARK7/DJ-1 inhibition decreases invasion and proliferation of uveal melanoma cells. Tumori. 109 (1), 47-53 (2023).
- Escalona, R. M., et al. Knock down of TIMP-2 by siRNA and CRISPR/Cas9 mediates diverse cellular reprogramming of metastasis and chemosensitivity in ovarian cancer. Cancer Cell International. 22 (1), 422 (2022).
- Mosca, L., et al. Effects of S-adenosyl-L-methionine on the invasion and migration of head and neck squamous cancer cells and analysis of the underlying mechanisms. International Journal of Oncology. 56 (5), 1212-1224 (2020).
- Zhao, Q., et al. VEGI174 protein and its functional domain peptides exert antitumour effects on renal cell carcinoma. International Journal of Oncology. 54 (1), 390-398 (2019).
- Witte, D., et al. TGF-beta1-induced cell migration in pancreatic carcinoma cells is RAC1 and NOX4-dependent and requires RAC1 and NOX4-dependent activation of p38 MAPK. Oncology Reports. 38 (6), 3693-3701 (2017).
- Bui, L. C., et al. Regulation of aquaporin 3 expression by the AhR pathway is critical to cell migration. Toxicological Sciences. 149 (1), 158-166 (2016).
- Tsuji, K., et al. Effects of different cell-detaching methods on the viability and cell surface antigen expression of synovial mesenchymal stem cells. Cell Transplantation. 26 (6), 1089-1102 (2017).
- Frandsen, S. K., McNeil, A. K., Novak, I., McNeil, P. L., Gehl, J. Difference in membrane repair capacity between cancer cell lines and a normal cell line. The Journal of Membrane Biology. 249 (4), 569-576 (2016).
