Summary
Многие повышенные гены стимулируют миграцию и инвазию опухолевых клеток, что приводит к неблагоприятному прогнозу. Определение того, какие гены регулируют миграцию и инвазию опухолевых клеток, имеет решающее значение. Данный протокол представляет собой метод исследования влияния повышенной экспрессии гена на миграцию и инвазию опухолевых клеток в режиме реального времени.
Abstract
Опухолевые клетки очень подвижны и инвазивны и демонстрируют измененные паттерны экспрессии генов. Знания о том, как изменения в экспрессии генов регулируют миграцию и инвазию опухолевых клеток, необходимы для понимания механизмов инфильтрации опухолевых клеток в соседние здоровые ткани и метастазирования. Ранее было продемонстрировано, что нокдаун генов с последующим измерением миграции и инвазии опухолевых клеток в режиме реального времени на основе импеданса позволяет идентифицировать гены, необходимые для миграции и инвазии опухолевых клеток. В последнее время мРНК-вакцины против SARS-CoV-2 вызывают повышенный интерес к использованию синтетических мРНК в терапевтических целях. Здесь метод с использованием синтетической мРНК был пересмотрен для изучения влияния гиперэкспрессии генов на миграцию и инвазию опухолевых клеток. Это исследование демонстрирует, что повышенная экспрессия генов с помощью синтетической трансфекции мРНК с последующим измерением на основе импеданса в режиме реального времени может помочь идентифицировать гены, которые стимулируют миграцию и инвазию опухолевых клеток. В данной методологической работе приводятся важные сведения о процедурах изучения влияния измененной экспрессии генов на миграцию и инвазию опухолевых клеток.
Introduction
Подвижность опухолевых клеток играет решающую роль в метастазировании 1,2. Распространение опухолевых клеток на соседние и отдаленные здоровые ткани затрудняет лечение рака и способствует рецидиву 3,4. Поэтому важно понимать механизмы подвижности опухолевых клеток и разрабатывать соответствующие терапевтические стратегии. Поскольку многие опухолевые клетки имеют измененные профили экспрессии генов, крайне важно понять, какие изменения в профиле экспрессии генов приводят к изменению подвижности опухолевых клеток 5,6.
Было разработано несколько тестов для измерения миграции клеток in vitro. Некоторые анализы предоставляют только ограниченную информацию из-за того, что позволяют проводить измерения только в определенные моменты времени, в то время как другие предоставляют исчерпывающую информацию о подвижности опухолевых клеток в режиме реального времени7. Несмотря на то, что многие из этих анализов подвижности клеток могут дать количественные результаты в данный момент времени или в конечной точке, они не могут предоставить достаточно подробную информацию о динамических изменениях скорости миграции клеток в течение экспериментального периода. Кроме того, может быть трудно изучить потенциальные изменения скорости миграции клеток в зависимости от дизайна эксперимента, типов и количества клеток. Кроме того, эффекты неосложненного лечения могут быть исследованы с помощью простой количественной оценки традиционных анализов подвижности, но для изучения комплексных эффектов различных комбинированных методов лечения может потребоваться более сложная количественная оценка8.
Разработан прибор для контроля электрического тока микротитровой пластины на дне лунки, покрытой микроэлектродами9. Адгезия ячеек к поверхности лунки затрудняет поток электронов, а импеданс коррелирует с количественным и качественным связыванием клеток. Наличие микроэлектродов на дне скважины позволяет измерять адгезию, распространение и пролиферацию клеток. Наличие микроэлектродов под микропористой мембраной верхней камеры позволяет измерять миграцию клеток и инвазию в нижнюю камеру, при этом верхняя камера покрыта белками внеклеточного матрикса (ECM) для обеспечения инвазии10.
Ранее было продемонстрировано, что импедансные измерения миграции и инвазии опухолевых клеток в режиме реального времени позволяют получать данные в режиме реального времени в течение всего эксперимента, а также мгновенные сравнения и количественные оценки в различных экспериментальных условиях11. В этой методической работе нокдаун генов был индуцирован для проверки роли интересующих белков в миграции и инвазии опухолевых клеток. Поскольку полномасштабный эффект нокдауна генов в тестируемых экспериментальных условиях происходил через 3-4 дня после электропорации с малыми интерферирующими РНК (миРНК)8, клетки переделывали после электропорации и повторно собирали через 3 дня для измерения миграции и инвазии опухолевых клеток в режиме реального времени на основе импеданса.
CT10 регулятор киназы (Crk) и Crk-подобный (CrkL) представляют собой адапторные белки, которые опосредуют белок-белковые взаимодействия после различных путей рецептор-киназы факторов роста и нерецепторных путей тирозинкиназы12. Повышенные уровни белков Crk и CrkL способствуют плохому прогнозу при нескольких видах рака человека, включая глиобластому13. Однако неясно, как повышенное содержание белков Crk и CrkL приводит к неблагоприятному прогнозу. Поэтому важно определить влияние гиперэкспрессии Crk и CrkL на функции опухолевых клеток. Ранее было проведено исследование нокдауна генов, чтобы продемонстрировать, что эндогенные уровни белков Crk и CrkL необходимы для миграции и инвазии клеток глиобластомы8. Здесь была разработана модифицированная система анализа для изучения влияния гиперэкспрессии Crk и CrkL на миграцию и инвазию опухолевых клеток.
В последнее время синтез мРНК in vitro и его терапевтическое применение вновь привлекли внимание в связи с разработкой мРНК-вакцин против SARS-CoV-2 (обзор Verbeke et al.14). Кроме того, были достигнуты значительные успехи в использовании синтетической мРНК при раке и других заболеваниях15,16. Электропорация клеток является эффективным методом доставки синтетической мРНК и индуцирования транзиторной генетической модификации (рассмотрено Campillo-Davo et al.17), а использование синтетической мРНК обеспечивает быструю и эффективную экспрессию генов в иммортализированных фибробластах18. Этот метод сочетает в себе гиперэкспрессию генов с использованием синтетической мРНК с клеточным анализом в режиме реального времени для изучения миграции и инвазии опухолевых клеток. Однако экспериментальная схема, используемая для миРНК, не работает с трансфекцией синтетической мРНК, так как уровень экзогенных белков быстро возрастает и постепенно снижается при трансфекции синтетической мРНК18. Поэтому метод был модифицирован для проведения анализа миграции и инвазии клеток в режиме реального времени сразу после трансфекции без дополнительного культивирования клеток.
В этом методологическом документе показано, что сочетание измерений в реальном времени на основе импеданса с трансфекцией опухолевых клеток синтетическими мРНК обеспечивает быстрый и всесторонний анализ влияния регуляции генов на миграцию и инвазию опухолевых клеток. В данной методологической статье подробно описаны процедуры измерения влияния гиперэкспрессии Crk и CrkL на миграцию и инвазию клеток глиобластомы. Изучая концентрационно-зависимое влияние синтетической мРНК на миграцию опухолевых клеток, в статье четко описывается, как повышение уровня белка стимулирует миграцию опухолевых клеток. Кроме того, представлен подход варьирования концентрации геля ECM для оценки влияния изменений экспрессии генов на инвазию опухолевых клеток.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Синтез мРНК
ПРИМЕЧАНИЕ: Для синтеза мРНК все реагенты и оборудование должны быть специально обработаны для инактивации РНКаз перед использованием. Подробные сведения обо всех материалах, инструментах и реагентах, используемых в этом протоколе, см. в таблице материалов .
- Линеаризация ДНК
ПРИМЕЧАНИЕ: Мышиные кДНК CrkI и CrkL клонировали в вектор экспрессии pFLAG-CMV-5a для добавления эпитопной метки FLAG на С-конце и субклонировали в вектор pcDNA3.1/myc-His для включения промотора T7, как описано ранее18,19.- Добавьте 10 мкл 10-кратного реакционного буфера, 1,5 мкл PmeI (10 000 ед/мл) и 10 мкг плазмидной ДНК в микроцентрифужную пробирку для линеаризации плазмидной ДНК с ферментом рестрикции. Добавьте воду, не содержащую нуклеаз, чтобы довести объем реакции до 100 мкл.
- Перемешайте постукиванием, отжмите и инкубируйте реакционную смесь при 37 °C в течение ночи.
- Отжим и добавьте в реакционную смесь 5 мкл 10% додецилсульфата натрия (SDS) и 1 мкл протеиназы K (20 мг/мл, класс РНК). Перемешайте постукиванием, отжмите и инкубируйте при температуре 50 °C в течение 30 минут.
- Под вытяжным шкафом добавьте 100 мкл донной фазы фенол:хлороформ:изоамиловый спирт в плазмидную реакционную смесь для экстракции. Вихрьте, а затем центрифугируйте при 18 800 × г в течение 5 мин при комнатной температуре. Переместите верхнюю фазу в новую трубку.
- Повторите шаг 1.1.4 с хлороформом:изоамиловым спиртом в соотношении 24:1.
- В новой пробирке доведите объем реакции до 300 мкл, добавив 200 мкл воды, не содержащей нуклеазы, а затем добавьте 30 мкл 3 М ацетата натрия и 600 мкл 100% этанола.
- Перемешайте путем вихряния, а затем поместите при температуре −20 °C на 30-60 мин для осаждения этанола в ДНК.
- Центрифугу при 18 800 × г в течение 20 мин при 4 °C, выбросьте надосадочную жидкость и промойте гранулу 1 мл 70% этилового спирта. Повторите центрифугирование в течение 10 мин, а затем полностью удалите надосадочную жидкость.
- Высушите при открытой крышке в течение 2 минут, добавьте 30 мкл воды, не содержащей нуклеаз, и снова суспендируйте гранулу ДНК.
- Определите концентрацию ДНК с помощью спектрофотометра.
- Проверьте размер и количество линеаризованной ДНК с помощью электрофореза в агарозном геле.
- Синтез РНК с использованием РНК-полимеразы Т7
- Добавьте по 2 мкл 10-кратного транскрипционного буфера, АТФ, ГТФ, УТФ, КТФ и Т7 и 1 мкг линеаризованной ДНК в микроцентрифужную пробирку. Добавьте воду, не содержащую нуклеаз, чтобы довести объем реакции до 20 мкл.
- Перемешайте путем постукивания, отжимите и инкубируйте реакционную смесь при 37 °C в течение 2 ч для синтеза РНК.
- Отжим, добавьте 1 мкл ДНКазы (2 Ед/мкл) и инкубируйте при 37 °C в течение 15 мин, чтобы удалить матричную ДНК.
- Осаждение хлорида лития РНК
- Добавьте в реакционную смесь 10 мкл хлорида лития (7,5 М). Перемешайте постукиванием, отжмите и инкубируйте реакционную смесь при −20 °C в течение 30 мин.
- Центрифугу при 18 800 × г в течение 20 мин при 4 °C, выбросьте надосадочную жидкость и промойте гранулу 500 мкл 70% этанола. Повторите центрифугирование в течение 10 мин, а затем полностью удалите надосадочную жидкость.
- Сушить при открытой крышке в течение 2 минут, добавить 30 мкл воды, не содержащей нуклеаз, и повторно суспендировать гранулу РНК.
- Головка
- Нагрейте образец РНК при 65 °C в течение 10 мин, а затем поместите его на лед для охлаждения.
- Добавьте по 5 мкл 10-кратного укупорочного буфера, 10 мМ ГТФ и 1 мМ (10-кратного) S-аденозилметионина (SAM), по 2 мкл смеси ферментов укупорки и смеси ферментов O-метилтрансферазы и 1,25 мкл ингибитора РНКазы. Перемешайте постукиванием, отжмите и инкубируйте реакционную смесь при 37 °C в течение 1 ч.
- Поли(А) хвостохранилище
- Открутите образец, а затем добавьте 6 мкл воды, не содержащей нуклеаз, 20 мкл 5-кратного буфера E-PAP, 10 мкл 25 мМ MnCl2, 10 мкл 10 мМ АТФ и 4 мкл пищеварного фермента E-PAP poly(A). Перемешайте постукиванием, отжмите и инкубируйте реакционную смесь при 37 °C в течение 2 ч.
- Осаждение хлорида лития и количественное определение синтетической мРНК
- Добавьте 50 мкл хлорида лития (7,5 M) и выполните осаждение хлорида лития, как описано в шагах 1.3.1-1.3.3.
- Измерьте концентрацию мРНК с помощью спектрофотометра.
- Проверьте размер и количество мРНК с помощью формальдегидного (1%-2%), агарозного (1%) гель-электрофореза.
2. Гелевое покрытие внеклеточного матрикса (ECM) пластин для клеточной инвазии и миграции (CIM)
ПРИМЕЧАНИЕ: Пластина для клеточной инвазии и миграции (CIM) представляет собой коммерчески производимую 16-луночную пластину для анализа клеток на основе импеданса в режиме реального времени. Для анализа клеточной инвазии покройте пластины CIM гелем ECM, как описано выше, но с некоторыми модификациями11.
- Достаньте аликвоту гелевого бульона ECM из морозильной камеры и храните его на льду.
- Разбавьте гель ECM (10 мг/мл) до рабочей концентрации (100 мкг/мл), смешав 990 мкл модифицированной орлиной среды (DMEM) Dulbecco (без сыворотки или антибиотиков) с 10 мкл геля ECM в пробирке для микроцентрифуги. Смешайте с помощью осторожного пипетирования.
- Добавьте 60 мкл разбавленного геля ECM в каждую из 16 лунок верхней камеры пластины CIM. Применяют метод обратного пипетирования, избегая образования пузырьков воздуха20,21.
ПРИМЕЧАНИЕ: Оптимизируйте концентрацию геля ECM для каждой клеточной линии. Для клеточных линий глиобластомы для оптимизации использовали гель ECM от 0,1 мкг/мкл до 1 мкг/мкл. - Поместите верхнюю камеру пластины CIM со снятой крышкой пластины на защитный пластиковый лист внутри инкубатора CO2 примерно на 4 часа, чтобы образовался слой геля.
ВНИМАНИЕ: Во время покрытия пластины КИМ гелем ВКМ электроды верхней камеры пластины КИМ не должны иметь прямого контакта с руками экспериментатора или поверхностями оборудования, включая шкаф биобезопасности или инкубаторСО2 .
3. Подготовка опухолевых клеток
ПРИМЕЧАНИЕ: Все материалы для клеточных культур должны храниться стерильными. Забор и электропорация опухолевых клеток в шкафу биологической безопасности с использованием соответствующих средств индивидуальной защиты (СИЗ), как описано выше, но с некоторыми модификациями11.
- Культивирование опухолевых клеток
- Культивирование клеток U-118MG в 10 мл ДМЭМ, содержащего 5% фетальной бычьей сыворотки (FBS) и 1% антибиотиков на чашку для культивирования полистирольных тканей размером 100 мм х 20 мм при 37 °C в инкубаторе с 5%СО2 (условия культивирования).
- Истощение сыворотки опухолевых клеток
ПРИМЕЧАНИЕ: Воздействие на клетки хемоаттрактантов, присутствующих в FBS, должно быть сведено к минимуму перед анализом миграции и инвазии клеток с использованием высокой концентрации FBS.- Удалите старую среду и добавьте 10 мл предварительно подогретого DMEM, содержащего 0,5% FBS и 1% антибиотиков на чашку (среда с низким содержанием сыворотки).
- Повторите шаг 3.2.1.
- Инкубируют клетки при 37 °C в инкубаторе с 5%СО2 в течение 4 ч или дольше.
- Забор опухолевых клеток
- Удалите старую среду, добавьте 8 мл предварительно подогретого фосфатно-солевого буфера Dulbecco (DPBS) на чашку, удалите DPBS, добавьте предварительно подогретый 0,05% трипсин-ЭДТА (2 мл/чашка), чтобы покрыть поверхность, и инкубируйте в инкубатореCO2 в течение 30 с.
- Осторожно аспирируйте трипсин-ЭДТА, добавьте среду с низким содержанием сыворотки крови (7 мл/чашку), а затем соберите клетки в центрифужную пробирку объемом 50 мл или 15 мл.
- Аликвотируйте небольшой объем клеток и используйте портативный автоматический счетчик клеток для подсчета клеток.
- Рассчитайте общее количество клеток и необходимый объем на 10 000 клеток/мкл.
- Центрифугируя клетки при 100 × г в течение 5 мин при комнатной температуре, отсасывают надосадочную жидкость, добавляют рассчитанный объем DMEM, содержащий 0,5% FBS (без антибиотиков), и осторожно ресуспендируют клеточную гранулу.
- Переносите 110 мкл клеточной суспензии, содержащей 1,1 миллиона клеток, в микроцентрифужную пробирку для каждой обработки.
- Повторите шаг 3.3.6, чтобы перенести клетки в четыре пробирки микроцентрифуги для четырех различных процедур.
Примечание: Пластина CIM имеет в общей сложности 16 лунок. Спроектируйте четыре различных метода обработки для сравнения таким образом, чтобы для каждой обработки можно было назначить четыре лунки пластины CIM. Используйте электропорированные клетки для следующих экспериментов: вестерн-блоттинг-анализ (0,3 миллиона клеток на 35-миллиметровую чашку для культуры тканей), четыре лунки для анализа миграции клеток в реальном времени (0,1 миллиона клеток/лунка) и четыре лунки для анализа клеточной инвазии в реальном времени (0,1 миллиона клеток/лунка) для каждого лечения. Отрегулируйте количество ячеек, которые необходимо электропорировать, если план эксперимента изменится.
4. Электропорация опухолевых клеток
- Чтобы удалить среду, добавьте 1 мл DPBS в клеточную суспензию в каждой пробирке, открутите клеточную суспензию три раза в течение 10 с каждый раз, поворачивая пробирку на 180° каждые 10 с с помощью мини-центрифуги, и удалите надосадочную жидкость с помощью микропипетки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Важно сформировать компактную, но легко суспендируемую клеточную гранулу. - Добавьте 110 мкл буфера ресуспензии R к клеточной грануле, чтобы получить 0,1 миллиона клеток в 10 мкл.
- Добавьте синтетическую мРНК в клеточную гранулу для получения концентрации 0,2-20 нг/мкл в зависимости от желаемого уровня экспрессии. Осторожно перемешайте и ресуспендируйте гранулы клеток путем постукивания или осторожного пипетирования.
ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте различные концентрации синтетической мРНК, исследуйте экспрессию белка с помощью вестерн-блоттинг-анализа и определяйте концентрацию синтетической мРНК, которая приводит к желаемому уровню экспрессии, чтобы исследовать специфическую корреляцию между экспрессией белка и биологическими эффектами. - Электропорируют 10 мкл клеточной суспензии с помощью электропорационной системы при напряжении 1 350 В в течение 10 мс по три импульса каждый раз.
- Перенесите электропорированные клетки в новую пробирку микроцентрифуги с 1,1 мл DMEM, содержащего 0,5% FBS.
- Повторяйте электропорацию до тех пор, пока остальная часть клеточной суспензии не будет электропорирована. Объедините электропорированные клетки в пробирке микроцентрифуги, чтобы получить 1,1 миллиона клеток в 1,1 мл.
ПРИМЕЧАНИЕ: Электропорационные наконечники на 100 мкл и 10 мкл можно использовать для электропорации большого объема клеток, но электропорационные наконечники на 10 мкл и 100 мкл входят в два отдельных комплекта и приобретаются отдельно. Буфер для ресуспензии R входит в оба комплекта. - После завершения всех соответствующих электропораций аккуратно ресуспендируйте объединенные клетки.
- Распределите 0,3 миллиона клеток в чашку для культивирования тканей из полистирола размером 35 мм x 10 мм с 2 мл DMEM, содержащего 5% FBS, и культивируйте клетки в течение 1 дня в условиях культивирования для приготовления общего клеточного лизата и вестерн-блоттинга.
- Храните остальные электропорированные ячейки при комнатной температуре до тех пор, пока не будет готова система анализа клеток в режиме реального времени.
5. Настройка клеточного анализатора в режиме реального времени, программы и пластин CIM
ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовьте клеточный анализатор в режиме реального времени и две пластины CIM, как описано ранее11.
- Уравновешивание клеточного анализатора в режиме реального времени
- Переместите анализатор клеток в режиме реального времени в инкубаторCO2 за несколько часов до использования, чтобы сбалансировать систему в условиях культивирования.
- Настройка программы анализа
- Откройте программу анализа, дважды щелкнув значок программного обеспечения для анализа клеток в реальном времени на рабочем столе.
- Открыв параметр Настройка шаблона эксперимента по умолчанию, выберите параметр для выполнения трех экспериментов по отдельности.
ПРИМЕЧАНИЕ: Каждая люлька имеет отдельное окно. Существуют различные вкладки для настройки интервала и продолжительности измерений, анализа данных и других условий эксперимента. - Откройте каждую подставку, нажав на вкладку «Номер ».
- Перейдите на вкладку Заметки об эксперименте, выберите папку, в которую будут сохранены данные, и введите название эксперимента .
- Перейдите на вкладку Layout (Компоновка ), настройте quadruplicate well для каждого условия обработки, выбрав четыре лунки за раз и введя информацию об образце, а затем нажмите Apply (Применить).
- Нажмите на вкладку «Расписание » | Добавьте шаг для настройки двухэтапного режима измерения импеданса ячейки. Затем нажмите « Применить », чтобы настроить первый шаг.
- Нажмите « Добавить шаг» еще раз, введите 10 минут для интервала и 48 часов для длительности миграции и вторжения, а затем нажмите «Применить », чтобы настроить второй шаг.
ПРИМЕЧАНИЕ: На первом этапе выполняется однократное измерение базовой линии (одно сканирование с интервалом 1 минута). На втором этапе измеряется импеданс ячейки для эксперимента (например, 289 разверток с интервалом 10 мин в течение 48 ч) на люльке. Отрегулируйте интервал и продолжительность в зависимости от плана эксперимента. - Перейдите к следующей подставке и настройте ее, повторив шаги 5.2.3-5.2.7.
- Подготовка пластин CIM
- За час до начала измерения импеданса клеток заполните лунки нижней камеры планшета CIM 160 мкл DMEM, содержащего 10% сыворотки или другие хемоаттрактанты.
- Соедините верхнюю камеру, содержащую лунки с гелевым покрытием ECM (для инвазии) или без покрытия (для миграции), с нижней камерой.
- Добавьте 50 мкл среды с низким содержанием сыворотки в лунки верхней камеры КИМ-планшета для анализа миграции клеток и поместите КИМ-планшет в колыбель системы.
- Перейдите на вкладку « Сообщение » и убедитесь, что отображается сообщение «Подключения в порядке ». Теперь пластина CIM готова к эксперименту.
- Предварительно инкубируйте собранную пластину CIM в инкубатореCO2 в течение 30-60 минут перед анализом клеток в режиме реального времени, чтобы акклиматизировать планшет CIM к условиям культуры.
6. Анализ клеток и экспорт данных в режиме реального времени
ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните считывание базовых данных, заполнение ячеек, измерение импеданса ячеек и экспорт данных, как описано ранее11.
- Базовое чтение
ПРИМЕЧАНИЕ: Базовая линия должна быть прочитана после того, как пластина CIM будет акклиматизирована, и до того, как ячейки будут добавлены в лунки верхней камеры.- Нажмите кнопку «Пуск» для каждой подставки. Когда появится окно Сохранить как, сохраните экспериментальный файл, чтобы выполнить чтение базового плана.
- Посев клеток
- Извлеките пластину CIM из подставки и поместите ее в шкаф биобезопасности на держателе пластины.
- Добавьте 100 мкл (содержащих 100 000 ячеек) электропорированных ячеек в лунки верхней камеры пластины CIM в соответствии с программой в блоке управления. Применяйте метод обратного пипетирования, избегая пузырьков воздуха.
- Оставьте пластину CIM под шкафом биобезопасности на 30 минут при комнатной температуре, чтобы убедиться, что клетки равномерно распределяются по дну лунки.
- Измерение импеданса ячейки
- Переместите полностью собранную пластину CIM обратно на соответствующую подставку. Нажмите кнопку «Пуск » на базовой станции, чтобы начать измерение импеданса ячейки для второго шага.
- Перейдите на вкладку «График », затем нажмите кнопку « Добавить все » и установите флажки « Среднее » и «STD DEV », чтобы визуализировать данные в режиме реального времени.
ПРИМЕЧАНИЕ: Опцией построения графиков по умолчанию является Время для оси X и Индекс ячейки для оси Y. В разделе Plot Selection (Выбор графика ) пользователь может выбрать альтернативные параметры для оси Y: Normalized Cell Index (Нормализованный индекс ячейки) или Delta Cell Index (Индекс дельта-ячейки). После того, как будет сделана окончательная проверка, эксперимент будет завершен, и результаты будут сохранены автоматически.
- Экспорт данных для анализа
- Перейдите на вкладку «График» и установите флажки «Среднее» и «Стандартное отклонение», чтобы скопировать данные для каждой скважины в отдельности.
- Щелкните правой кнопкой мыши на области графика и выберите Копировать данные в формате списка.
- Откройте пустой файл электронной таблицы, вставьте данные и сохраните файл.
- Вернитесь в программу анализа, перейдите на вкладку « Пластина » для каждой подставки и выберите «Отпустить », чтобы закрыть эксперимент для колыбели.
- Вернитесь к файлу электронной таблицы и настройте время необработанных данных таким образом, чтобы время начала на втором шаге стало фактическим временем начала измерения.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Белки Crk и CrkL играют важную роль в подвижности многих типов клеток, включая нейроны22, Т-клетки23, фибробласты 18,19 и различные опухолевые клетки13. Поскольку сообщалось о повышенном уровне белков Crk и CrkL при глиобластоме24,25,26, в этой работе изучалось влияние гиперэкспрессии CrkI, варианта сплайсинга Crk, на миграцию клеток глиобластомы. Клетки U-118MG электропорировали с различными концентрациями синтетической мРНК CrkI и анализировали на уровень белка и миграцию клеток. Электропорация клеток глиобластомы U-118MG с различными концентрациями синтетической мРНК CrkI приводила к концентрационно-зависимому увеличению FLAG-меченого белка CrkI через 1 сутки после трансфекции (рис. 1A). В то время как 0,2 нг/мкл и 2 нг/мкл мРНК приводили к неопределяемой или умеренной экспрессии экзогенного белка CrkI, 20 нг/мкл мРНК приводили к гораздо более высокому уровню экспрессии, чем эндогенный белок CrkI.
Результаты анализа клеточной миграции с использованием системы клеточного анализа в реальном времени показали, что электропорация мРНК CrkI 0,2 нг/мкл или 2 нг/мкл не оказывает существенного влияния на миграцию клеток. Тем не менее, электропорация мРНК CrkI 20 нг/мкл привела к явной стимуляции миграции клеток, при этом большее количество клеток мигрировало между 2 и 13 часами (рис. 1B). Сравнение уровня белка CrkI с клеточной миграцией показало, что миграция клеток глиобластомы стимулировалась повышением уровня белка CrkI. По-видимому, уровень белка CrkI должен быть выше определенного порога, чтобы вызвать существенную стимуляцию миграции клеток. Если бы миграция клеток измерялась различными способами для подсчета или наблюдения за мигрировавшими клетками в определенные моменты времени, возможно, потребовалось бы гораздо больше усилий для выявления такого рода изменений в миграции клеток.
Чтобы изучить, как гиперэкспрессия CrkL влияет на клеточную инвазию глиобластомы через слои геля ECM с различными концентрациями белков ECM, клетки U-118MG электропорировали синтетической мРНК CrkL и анализировали с точки зрения уровней белка и клеточной инвазии через слой геля ECM. Электропорация клеток глиобластомы U-118MG с синтетической мРНК CrkL приводила к устойчивой экспрессии FLAG-меченого белка CrkL через 1 день после трансфекции (рис. 2A). По мере увеличения концентрации белков ECM инвазия в контрольные клетки замедлялась (рис. 2B). Клетки с гиперэкспрессией CrkL также показали зависимое от концентрации геля ECM снижение клеточной инвазии (рис. 2C). Сравнение контрольных клеток и клеток с гиперэкспрессией CrkL при различных концентрациях геля ECM показало, что гиперэкспрессия CrkL в целом стимулировала клеточную инвазию через слой геля ECM (рис. 2D-G). Однако разница между двумя клеточными популяциями стала очевидной в разные моменты времени в зависимости от концентрации геля ECM.
Для геля ECM в дозе 0,1 мкг/мкл опосредованная гиперэкспрессией CrkL стимуляция клеточной инвазии была очевидна между 8 и 20 ч (рис. 2D), но разница в клеточной инвазии была незначительной через 32 ч. Для геля ECM 0,2 мкг/мкл разница в клеточной инвазии с гиперэкспрессией CrkL и без нее всегда была минимальной (рис. 2E). Для геля ECM 0,5 мкг/мкл разница в клеточной инвазии была очевидна между 24 и 36 ч (рис. 2F). Для геля ECM с концентрацией 1 мкг/мкл эффект гиперэкспрессии CrkL на клеточную инвазию стал слабо выражен через 48 ч (рис. 2G). Полученные результаты свидетельствуют о том, что окно для обнаружения различий между контрольными клетками и клетками, экспрессирующими CrkL, смещается на более позднее время по мере увеличения концентрации геля ECM. Результаты также свидетельствуют о том, что на две клеточные популяции дифференцированно влияло увеличение концентрации геля ECM в разные моменты времени. Например, через 12 ч клетки, экспрессирующие CrkL-сверхэкспрессию, показали значительно более высокую инвазию только при концентрации 0,1 мкг/мкл геля ECM (рис. 2H). Тем не менее, через 24 ч клетки, экспрессирующие CrkL, показали несколько более высокую или аналогичную инвазию при протестированных концентрациях геля ECM (рис. 2I). Таким образом, важно исследовать как зависящие от времени, так и зависящие от концентрации геля ECM различия в клеточной инвазии, чтобы получить всестороннее представление о различиях между двумя клеточными популяциями с гиперэкспрессией CrkL и без нее. Эти результаты показывают, что сочетание транзиторной гиперэкспрессии с использованием синтетической мРНК с анализом клеток в реальном времени на основе импеданса предоставляет мощный инструмент для анализа потенциальной корреляции между гиперэкспрессией генов и миграцией и инвазией опухолевых клеток. Изучение эффектов вариаций концентрации в синтетической мРНК и геле ECM позволит получить более точную и подробную информацию.
Рисунок 1: Влияние гиперэкспрессии CrkI на миграцию клеток глиобластомы. Клетки U-118MG электропорировали с указанными концентрациями (нг/мкл) мРНК CrkI , меченной FLAG. (А) Для вестерн-блоттинг-анализа электропорированные клетки культивировали в течение 1 дня перед приготовлением общего клеточного лизата. Сравнивали уровни белка при трансфекции синтетической мРНК CrkI . Антитела к Crk и CrkL использовались для обнаружения как эндогенных, так и меченых FLAG белков, а также для сравнения соотношения между эндогенными белками и белками, меченными FLAG. Винкулин и α-тубулин использовали в качестве контроля нагрузки. (B) Для анализа миграции клеток электропорированные клетки наносили на КИМ-планшет без дальнейшего культивирования. Для каждой пробы были получены значения индекса ячейки из четырех лунок и приведены их средние значения ± SD. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Влияние гиперэкспрессии CrkL на клеточную инвазию глиобластомы. Клетки U-118MG электропорировали мРНК CrkL, не содержащейнуклеаз, или мРНК CrkL, меченной FLAG. (А) Для вестерн-блоттинг-анализа электропорированные клетки культивировали в течение 1 дня перед приготовлением общего клеточного лизата. Сравнивали уровни белка при трансфекции синтетической мРНК CrkL. Антитела к Crk и CrkL использовались для обнаружения как эндогенных, так и меченых FLAG белков, а также для сравнения соотношения между эндогенными белками и белками, меченными FLAG. Винкулин и α-тубулин использовали в качестве контроля нагрузки. (Б-Г) Для анализа клеточной инвазии электропорированные клетки наносили на пластину CIM с гелевым покрытием ECM без дальнейшего культивирования. Для каждой пробы были получены значения индекса ячейки из четырех лунок и приведены их средние значения ± SD. (B) Сравнивали данные клеточной инвазии контрольных клеток с различными концентрациями геля ECM. (C) Сравнивали данные клеточной инвазии клеток с гиперэкспрессией CrkL с различными концентрациями геля ECM. (Д-Г) Сравнивали данные клеточной инвазии между контрольными клетками и клетками с гиперэкспрессией CrkL для указанной концентрации геля ECM. (H) Сравнение клеточной инвазии через 12 ч между контрольными клетками и клетками, экспрессирующими CrkL. (I) Сравнение клеточной инвазии через 24 ч между контрольными клетками и клетками с гиперэкспрессией CrkL. Сокращения: ECM = внеклеточный матрикс; CIM = клеточная инвазия и миграция. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Схематические диаграммы экспериментальных процедур после нокдауна или гиперэкспрессии генов . (A) Экспериментальная процедура клеточного анализа в реальном времени после трансфекции миРНК. Поскольку для индуцирования полного нокдауна гена после трансфекции миРНК в экспериментальных условиях требуется 3-4 дня, клетки переделывали и культивировали в течение 3 дней после электропорации, прежде чем они были готовы к клеточному анализу в режиме реального времени. (B) Экспериментальная процедура анализа клеток в режиме реального времени после трансфекции синтетической мРНК. Поскольку экспрессия белка при трансфекции синтетической мРНК происходит быстро, электропорированные клетки были использованы для анализа клеток в режиме реального времени в тот же день. Обратите внимание на разницу между двумя экспериментальными процедурами; В то время как анализ клеток в реальном времени проводился через 3 дня после электропорации на нокдаун генов с использованием миРНК, анализ клеток в реальном времени проводился сразу после электропорации на предмет гиперэкспрессии генов синтетической мРНК. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Миграция и инвазия являются важными особенностями опухолевых клеток. Измерение подвижности опухолевых клеток и понимание основного механизма, контролирующего подвижность опухолевых клеток, дают критически важное представление о терапевтических вмешательствах 2,27. Для изучения миграции клеток было разработано несколько методов7. Ранозаживляющий анализ с использованием царапин или вкладышей для посева является простым и часто используемым методом, который позволяет получить контрастные изображения закрытия промежутков. Анализ отслеживания отдельных клеток требует мониторинга отдельных клеток с помощью покадровой визуализации, для которой клетки могут быть помечены флуоресцентными красителями. Как анализ заживления ран, так и анализ отслеживания отдельных клеток измеряют спонтанное движение клеток.
С помощью покадровой визуализации и интенсивной обработки данных после запроса оба анализа могут обеспечить количественное сравнение образцов28. Однако эти анализы не подходят для изучения клеточной инвазии через слой белка ECM. В отличие от этого, анализы трансвелл-миграции и инвазии измеряют направленную миграцию клеток через трансвелл-вставку с белковым слоем ECM или без него. Тем не менее, непрерывный мониторинг с помощью этих анализов невозможен, потому что мигрировавшие клетки должны быть собраны в определенный момент времени, и трансвелл не может быть использован снова. Все эти анализы требуют значительного времени и усилий для обработки данных или для практических экспериментов по сбору и подсчету клеток, что приводит к потенциальным вариациям, связанным с оператором. Самой большой проблемой для этих анализов является проведение сложных количественных сравнений между несколькими комбинированными методами лечения в различные моменты времени.
Использование системы клеточного анализа в режиме реального времени, представленной в этой работе, позволяет проводить количественный, непрерывный и всесторонний мониторинг для измерения миграции и инвазии клеток, и эта система имеет много преимуществ по сравнению с другими простыми анализами подвижности клеток, которые дают результаты в ограниченные, фиксированные моменты времени. Как и в случае с другими анализами, экспериментальные условия клеточного анализа в реальном времени должны быть оптимизированы для каждой клеточной линии, поскольку на миграцию и инвазию различных клеточных линий может по-разному влиять количество клеток. Кроме того, скорость клеточной инвазии снижается по мере увеличения концентрации геля ECM (рис. 2B, C). Поэтому рекомендуется тестировать различные концентрации геля ECM и сравнивать влияние изменений экспрессии генов на клеточную инвазию при этих различных концентрациях геля ECM.
С помощью системы анализа клеток в режиме реального времени оптимизация проста и понятна, поскольку система анализа генерирует данные в режиме реального времени без ручного труда. Система анализа определяет, как быстро клетки мигрируют или вторгаются и когда они достигают максимального уровня миграции или инвазии клеток. Получение этой информации о подвижности клеток позволяет проводить детальный сравнительный анализ между различными группами лечения, что может быть сделано просто с помощью встроенных функций программы. Кроме того, чувствительность системы анализа в режиме реального времени позволяет идентифицировать и количественно оценивать тонкие изменения в клеточной миграции и инвазии с помощью экспрессии генов, зависящей от концентрации, как показано на рисунке 1 и рисунке 2.
Ранее была представлена подробная процедура измерения миграции и инвазии опухолевых клеток после нокдауна генов с использованием системы анализа клеток в реальном времени на основе импеданса. Поскольку нокдаун генов занимает 3-4 дня после электропорации клеток миРНК, клетки были повторно покрыты после электропорации. Электропорированные клетки культивировали в течение 3 дней, прежде чем они были повторно собраны для клеточного анализа в режиме реального времени, что делает весь эксперимент двухэтапным процессом: электропорация на 1-й день и клеточный анализ в реальном времени на 4-й день, как показано на рисунке 3. Напротив, экспрессия генов при электропорации клеток с синтетической мРНК происходит быстро и эффективно, так как покадровый анализ фибробластов, электропорированных синтетической мРНК для GFP, показал сильный сигнал GFP через 5 ч после трансфекции; Интенсивность флуоресценции достигала максимума около 24 ч, после чего наблюдалось постепенное снижение сигнала флуоресценции18.
Кроме того, в этой работе клетки U-118MG показали устойчивую экспрессию экзогенного белка при электропорации с синтетической мРНК для CrkI (рис. 1A) и для CrkL (рис. 2A), что согласуется с предыдущими наблюдениями8. Поэтому анализ клеток в режиме реального времени целесообразно проводить сразу после электропорации. Некоторые шаги для анализа клеток в режиме реального времени должны быть выполнены до сбора клеток для электропорации. Весь эксперимент представляет собой одноэтапный процесс, включающий электропорацию и анализ клеток в режиме реального времени в первый день. Система анализа клеток в реальном времени на основе импеданса широко используется для изучения миграции и инвазии опухолевых клеток в различных солидных опухолевых клетках, включая рак молочной железы29, колоректальный рак 30, меланому 31, рак яичников 32, плоскоклеточный рак головы и шеи 33, почечно-клеточную карциному 34, карциному поджелудочной железы 35, гепатоцеллюлярную карциному36 и клетки немелкоклеточного рака легкого10. Таким образом, комбинированное использование гиперэкспрессии генов с помощью мРНК или нокдауна генов с помощью миРНК делает измерение миграции и инвазии клеток в режиме реального времени более полезным и применимым.
Ограничением этого протокола является то, что этот метод требует диссоциации и забора клеток непосредственно перед измерением миграции и инвазии клеток. Ферментативная и механическая обработка во время диссоциации, сбора урожая и ресуспензии может повлиять на анализ37. Кроме того, может наблюдаться задержка миграции клеток, пока клетки восстанавливаются после ферментативной и механической обработки. Этот метод может быть неподходящим, если клетки легко повреждаются трипсинизацией или другими механическими воздействиями во время диссоциации и сбора отдельных клеток или требуют длительного времени восстановления после этих манипуляций. Это ограничение также относится к анализу трансвелловой миграции, который является еще одним методом измерения направленной миграции клеток. Кроме того, электропорация после подготовки клеток может сделать клетки более уязвимыми к повреждению38. Поэтому важно оптимизировать условия электропорации для каждой клеточной линии, а также провести электропорацию контрольных ячеек для более точных сравнений.
Рекомендуемые параметры для электропорации приведены на домашней странице производителя для электропорации (см. сноску в таблице материалов). Использование последовательных и минимально повреждающих экспериментальных условий во время диссоциации и ресуспензии клеток имеет решающее значение для получения воспроизводимых результатов. Кроме того, корреляция количества мРНК, уровня белка и подвижности клеток имеет решающее значение для различения специфических и неспецифических эффектов трансфекции мРНК. В этой работе было замечено, что если концентрация мРНК превышает определенный уровень, она неспецифически ингибирует клеточные функции, включая миграцию клеток и инвазию (данные не показаны). Поэтому важно титровать концентрацию мРНК. Кроме того, очень важно проводить анализ клеток в режиме реального времени, когда экспрессия белка находится на пиковом уровне, поскольку экспрессия белка является транзиторной при трансфекции мРНК. Как и в случае с другими анализами подвижности клеток, результаты этого клеточного анализа в режиме реального времени могут быть искажены пролиферацией клеток во время миграции. Поэтому рекомендуется дополнительно провести анализ клеточной пролиферации, чтобы понять влияние клеточной пролиферации на результаты клеточной миграции и инвазии.
Известно, что уровни белков Crk и CrkL повышены при некоторых типах рака человека. Поскольку экспрессия Crk и CrkL коррелирует с различными функциями опухолевых клеток, а их чрезмерная экспрессия способствует неблагоприятному прогнозу, Crk и CrkL были предложены в качестве терапевтических мишеней для лечения рака13. Ранее нокдаун генов индуцировался в клетках глиобластомы, чтобы продемонстрировать, что миграция и инвазия клеток глиобластомы являются надежными маркерами активности Crk и CrkL. В настоящем исследовании представлен подход к систематической экспрессии генов для индуцирования гиперэкспрессии Crk и CrkL с использованием синтетической мРНК. С помощью системы клеточного анализа в реальном времени была получена тесная корреляция между уровнями белков Crk и CrkL и миграцией и инвазией клеток глиобластомы. Полученные результаты также подтверждают гипотезу о том, что Crk и CrkL играют важную роль в миграции и инвазии клеток глиобластомы. Вместе с предыдущим описанием методов11 это исследование обеспечивает концептуальный подход для изучения потенциальной корреляции между изменениями в экспрессии генов и миграцией и инвазией опухолевых клеток.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
У авторов нет конфликта интересов, который можно было бы раскрыть.
Acknowledgments
Авторы благодарят Центр медицинского письма при Children's Mercy Kansas City за редактирование этой рукописи. Эта работа была поддержана Фондом Натали A.R.T. (Т..) и грантом Консультативного совета партнеров MCA от Детской больницы Милосердия (CMH) и Онкологического центра Университета Канзаса (KUCC) (Т..).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AlphaImager HP | ProteinSimple | 92-13823-00 | Agarose gel imaging system |
| α-Tubulin antibody | Sigma | T9026 | Used to detect α-tubulin protein (dilution 1:3,000) |
| CIM-plate 16 | Agilent Technologies, Inc | 5665825001 | Cell invasion and migration plates |
| Crk antibody | BD Biosciences | 610035 | Used to detect CrkI and CrkII proteins (dilution 1:1,500) |
| CrkL antibody | Santa Cruz | sc-319 | Used to detect CrkL protein (dilution 1:1,500) |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) | ATCC | 302002 | Cell culture medium |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) | Corning | 21-031-CV | Buffer used to wash cells |
| Fetal bovine serum (FBS) | Hyclone | SH30910.03 | Culture medium supplement |
| Heracell VIOS 160i CO2 incubator | Thermo Scientific | 51030285 | CO2 incubator |
| IRDye 800CW goat anti-mouse IgG secondary antibody | Li-Cor | 926-32210 | Secondary antibody for Western blot analysis (dilution 1:10,000) |
| IRDye 800CW goat anti-rabbit IgG secondary antibody | Li-Cor | 926-32211 | Secondary antibody for Western blot analysis (dilution 1:10,000) |
| Lithium chloride | Invitrogen | AM9480 | Used for RNA precipitation |
| Matrigel matrix | Corning | 354234 | Extracellular matrix (ECM) gel |
| MEGAscript T7 transcription kit | Invitrogen | AM1334 | Used for RNA synthesis |
| Millennium RNA markers | Invitrogen | AM7150 | Used for formaldehyde agarose gel electrophoresis |
| Mini centrifuge | ISC BioExpress | C1301P-ISC | Used to spin down cells |
| Mouse brain QUICK-Clone cDNA | TaKaRa | 637301 | Source of genes (inserts) for cloning |
| NanoQuant | Tecan | M200PRO | Nucleic acid quantification system |
| Neon electroporation system | ThermoFisher Scientific | MPK5000 | Electroporation system1 |
| Neon transfection system 10 µL kit | ThermoFisher Scientific | MPK1025 | Electroporation kit |
| Neon transfection system 100 µL kit | ThermoFisher Scientific | MPK10096 | Electroporation kit |
| NorthernMax denaturing gel buffer | Invitrogen | AM8676 | Used for formaldehyde agarose gel electrophoresis |
| NorthernMax formaldehyde load dye | Invitrogen | AM8552 | Used for formaldehyde agarose gel electrophoresis |
| NorthernMax running buffer | Invitrogen | AM8671 | Used for formaldehyde agarose gel electrophoresis |
| Nuclease-free water | Teknova | W3331 | Used for various reactions during mRNA synthesis |
| Odyssey CLx Imager | Li-Cor | Imager for Western blot analysis | |
| pcDNA3.1/myc-His | Invitrogen | V80020 | The vector into which inserts (mouse CrkI and CrkL cDNAs) were cloned |
| pFLAG-CMV-5a | Millipore Sigma | E7523 | Source of the FLAG epitope tag |
| Phenol:chloroform:isoamyl alcohol | Sigma | P2069 | Used for DNA extraction |
| PmeI | New England BioLabs | R0560L | Used to linearize the plasmids for mRNA synthesis |
| Poly(A) tailing kit | Invitrogen | AM1350 | Used for poly(A) tail reaction |
| Polystyrene tissue culture dish (100 x 20 mm style) | Corning | 353003 | Used for culturing cells before transfection |
| Polystyrene tissue culture dish (35 x 10 mm style) | Corning | 353001 | Used for culturing transfected cells |
| Proteinase K | Invitrogen | 25530049 | Used to remove protein in the reaction mixture |
| Purifier Axiom Class II, Type C1 | Labconco Corporation | 304410001 | Biosafety cabinet for sterile handling of cells |
| Resuspension Buffer R | ThermoFisher Scientific | A buffer included in the electroporation kits, MPK1025 and MPK10096. The buffer is used to resupend cells before electroporation, and its composition is proprietary information. | |
| RNaseZap | Invitrogen | AM9780 | RNA decontamination solution |
| Scepter | Millipore | C85360 | Handheld automated cell counter |
| ScriptCap 2'-O-methyltransferase kit | Cellscript | C-SCMT0625 | Used for capping reaction |
| ScriptCap m7G capping system | Cellscript | C-SCCE0625 | Used for capping reaction |
| Sodium dodecyl sulfate solution | Invitrogen | 15553-035 | Detergent used for the proteinase K reaction |
| Sorvall Legend XT centrifuge | Thermo Scientific | 75004532 | Benchtop centrifuge to spin down cells |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25300-054 | Used for dissociation of cells |
| U-118MG | ATCC | HTB15 | An adherent cell line derived from a human glioblastoma patient |
| Vinculin antibody | Sigma | V9131 | Used to detect vinculin protein (dilution 1:100,000) |
| xCELLigence RTCA DP | Agilent Technologies, Inc | 380601050 | Instrument used for real-time cell analysis |
| 1Electroporation parameters and other related information for various cell lines are available on the manufacturer's homepage (https://www.thermofisher.com/us/en/home/life-science/cell-culture/transfection/neon-transfection-system/neon-transfection-system-cell-line-data.html?). |
References
- Palmer, T. D., Ashby, W. J., Lewis, J. D., Zijlstra, A. Targeting tumor cell motility to prevent metastasis. Advanced Drug Delivery Reviews. 63 (8), 568-581 (2011).
- Eccles, S. A., Box, C., Court, W. Cell migration/invasion assays and their application in cancer drug discovery. Biotechnology Annual Review. 11, 391-421 (2005).
- Kluiver, T. A., Alieva, M., van Vuurden, D. G., Wehrens, E. J., Rios, A. C. Invaders exposed: Understanding and targeting tumor cell invasion in diffuse intrinsic pontine glioma. Frontiers in Oncology. 10, 92 (2020).
- Xie, Q., Mittal, S., Berens, M. E. Targeting adaptive glioblastoma: An overview of proliferation and invasion. Neuro-Oncology. 16 (12), 1575-1584 (2014).
- Wee, Y., Wang, T., Liu, Y., Li, X., Zhao, M. A pan-cancer study of copy number gain and up-regulation in human oncogenes. Life Sciences. 211, 206-214 (2018).
- Zhao, M., Liu, Y., Qu, H. Expression of epithelial-mesenchymal transition-related genes increases with copy number in multiple cancer types. Oncotarget. 7 (17), 24688-24699 (2016).
- Pijuan, J., et al. In vitro cell migration, invasion, and adhesion assays: From cell imaging to data analysis. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 7, 107 (2019).
- Park, T., Large, N., Curran, T. Quantitative assessment of glioblastoma phenotypes in vitro establishes cell migration as a robust readout of Crk and CrkL activity. The Journal of Biological Chemistry. 296, 100390 (2021).
- Urcan, E., et al. Real-time xCELLigence impedance analysis of the cytotoxicity of dental composite components on human gingival fibroblasts. Dental Materials. 26 (1), 51-58 (2010).
- Limame, R., et al. Comparative analysis of dynamic cell viability, migration and invasion assessments by novel real-time technology and classic endpoint assays. PLoS One. 7 (10), e46536 (2012).
- Mudduluru, G., Large, N., Park, T. Impedance-based real-time measurement of cancer cell migration and invasion. Journal of Visualized Experiments. (158), e60997 (2020).
- Feller, S. M. Crk family adaptors-signalling complex formation and biological roles. Oncogene. 20 (44), 6348-6371 (2001).
- Park, T. Crk and CrkL as therapeutic targets for cancer treatment. Cells. 10 (4), 739 (2021).
- Verbeke, R., Lentacker, I., De Smedt, S. C., Dewitte, H. The dawn of mRNA vaccines: The COVID-19 case. Journal of Controlled Release. 333, 511-520 (2021).
- Heine, A., Juranek, S., Brossart, P. Clinical and immunological effects of mRNA vaccines in malignant diseases. Molecular Cancer. 20 (1), 52 (2021).
- Kwon, H., et al. Emergence of synthetic mRNA: In vitro synthesis of mRNA and its applications in regenerative medicine. Biomaterials. 156, 172-193 (2018).
- Campillo-Davo, D., et al. The ins and outs of messenger RNA electroporation for physical gene delivery in immune cell-based therapy. Pharmaceutics. 13 (3), 396 (2021).
- Park, T., Koptyra, M., Curran, T. Fibroblast growth requires CT10 regulator of kinase (Crk) and Crk-like (CrkL). The Journal of Biological Chemistry. 291 (51), 26273-26290 (2016).
- Park, T. J., Curran, T. Essential roles of Crk and CrkL in fibroblast structure and motility. Oncogene. 33 (43), 5121-5132 (2014).
- Chou, P. P., Jaynes, P. K., King, B. P., Chapman, E., Bailey, J. L. Precision comparison between conventional (method-I) and reverse (method-Ii) pipetting. Clinical Chemistry. 30 (6), 958 (1984).
- Pushparaj, P. N. Revisiting the micropipetting techniques in biomedical sciences: A fundamental prerequisite in good laboratory practice. Bioinformation. 16 (1), 8-12 (2020).
- Park, T. J., Curran, T. Crk and Crk-like play essential overlapping roles downstream of disabled-1 in the Reelin pathway. The Journal of Neuroscience. 28 (50), 13551-13562 (2008).
- Huang, Y., et al. CRK proteins selectively regulate T cell migration into inflamed tissues. The Journal of Clinical Investigation. 125 (3), 1019-1032 (2015).
- Wang, L., et al. Signaling adaptor protein Crk is indispensable for malignant feature of glioblastoma cell line KMG4. Biochemical and Biophysical Research Communications. 362 (4), 976-981 (2007).
- Kumar, S., et al. Reciprocal regulation of Abl kinase by Crk Y251 and Abi1 controls invasive phenotypes in glioblastoma. Oncotarget. 6 (35), 37792-37807 (2015).
- Kumar, S., et al. Crk tyrosine phosphorylation regulates PDGF-BB-inducible Src activation and breast tumorigenicity and metastasis. Molecular Cancer Research. 16 (1), 173-183 (2018).
- Raudenska, M., et al. Engine shutdown: Migrastatic strategies and prevention of metastases. Trends in Cancer. 9 (4), 293-308 (2023).
- Decaestecker, C., Debeir, O., Van Ham, P., Kiss, R. Can anti-migratory drugs be screened in vitro? A review of 2D and 3D assays for the quantitative analysis of cell migration. Medicinal Research Reviews. 27 (2), 149-176 (2007).
- Farasani, A., Darbre, P. D. Long-term exposure to triclosan increases migration and invasion of human breast epithelial cells in vitro. Journal of Applied Toxicology. 41 (7), 1115-1126 (2021).
- Hanusova, V., Skalova, L., Kralova, V., Matouskova, P. The effect of flubendazole on adhesion and migration in SW480 and SW620 colon cancer cells. Anti-Cancer Agents in Medicinal Chemistry. 18 (6), 837-846 (2018).
- Lago-Baameiro, N., et al. PARK7/DJ-1 inhibition decreases invasion and proliferation of uveal melanoma cells. Tumori. 109 (1), 47-53 (2023).
- Escalona, R. M., et al. Knock down of TIMP-2 by siRNA and CRISPR/Cas9 mediates diverse cellular reprogramming of metastasis and chemosensitivity in ovarian cancer. Cancer Cell International. 22 (1), 422 (2022).
- Mosca, L., et al. Effects of S-adenosyl-L-methionine on the invasion and migration of head and neck squamous cancer cells and analysis of the underlying mechanisms. International Journal of Oncology. 56 (5), 1212-1224 (2020).
- Zhao, Q., et al. VEGI174 protein and its functional domain peptides exert antitumour effects on renal cell carcinoma. International Journal of Oncology. 54 (1), 390-398 (2019).
- Witte, D., et al. TGF-beta1-induced cell migration in pancreatic carcinoma cells is RAC1 and NOX4-dependent and requires RAC1 and NOX4-dependent activation of p38 MAPK. Oncology Reports. 38 (6), 3693-3701 (2017).
- Bui, L. C., et al. Regulation of aquaporin 3 expression by the AhR pathway is critical to cell migration. Toxicological Sciences. 149 (1), 158-166 (2016).
- Tsuji, K., et al. Effects of different cell-detaching methods on the viability and cell surface antigen expression of synovial mesenchymal stem cells. Cell Transplantation. 26 (6), 1089-1102 (2017).
- Frandsen, S. K., McNeil, A. K., Novak, I., McNeil, P. L., Gehl, J. Difference in membrane repair capacity between cancer cell lines and a normal cell line. The Journal of Membrane Biology. 249 (4), 569-576 (2016).
