Summary
Många uppreglerade gener stimulerar tumörcellers migration och invasion, vilket leder till dålig prognos. Att avgöra vilka gener som reglerar tumörcellers migration och invasion är avgörande. Detta protokoll presenterar en metod för att undersöka effekterna av det ökade uttrycket av en gen på migration och invasion av tumörceller i realtid.
Abstract
Tumörceller är mycket rörliga och invasiva och uppvisar förändrade genuttrycksmönster. Kunskap om hur förändringar i genuttryck reglerar tumörcellers migration och invasion är avgörande för att förstå mekanismerna för tumörcellers infiltration i närliggande friska vävnader och metastaser. Tidigare har det visats att genknockdown följt av impedansbaserad realtidsmätning av tumörcellers migration och invasion möjliggör identifiering av de gener som krävs för tumörcellers migration och invasion. På senare tid har mRNA-vaccinerna mot SARS-CoV-2 ökat intresset för att använda syntetiskt mRNA i terapeutiskt syfte. Här reviderades metoden med syntetiskt mRNA för att studera effekten av överuttryck av gener på tumörcellers migration och invasion. Denna studie visar att förhöjt genuttryck med syntetisk mRNA-transfektion följt av impedansbaserad realtidsmätning kan hjälpa till att identifiera de gener som stimulerar tumörcellsmigration och invasion. Denna metodartikel ger viktiga detaljer om procedurerna för att undersöka effekten av förändrat genuttryck på tumörcellsmigration och invasion.
Introduction
Tumörcellernas rörlighet spelar en avgörande roll vid metastasering 1,2. Spridningen av tumörceller till närliggande och avlägsna friska vävnader försvårar cancerbehandling och bidrar till återfall 3,4. Därför är det viktigt att förstå mekanismerna för tumörcellernas rörlighet och utveckla relevanta terapeutiska strategier. Eftersom många tumörceller har förändrade genuttrycksprofiler är det viktigt att förstå vilka förändringar i genuttrycksprofilen som leder till förändrad tumörcellsrörlighet 5,6.
Flera analyser har utvecklats för att mäta cellmigration in vitro. Vissa analyser ger endast begränsad information på grund av att de endast tillåter mätningar vid specifika tidpunkter, medan andra erbjuder omfattande information om tumörcellernas rörlighet i realtid7. Även om många av dessa cellmotilitetsanalyser kan ge kvantitativa resultat vid en given tidpunkt eller slutpunkt, ger de inte tillräckligt detaljerad information om dynamiska förändringar i cellmigrationshastigheten under experimentperioden. Dessutom kan det vara svårt att undersöka potentiella förändringar i cellmigrationshastigheten beroende på experimentell design, celltyper och cellantal. Dessutom kan effekterna av okomplicerade behandlingar undersökas genom enkel kvantifiering av traditionella motilitetsanalyser, men mer sofistikerad kvantifiering kan krävas för att studera de komplexa effekterna av olika kombinerade behandlingar8.
Ett instrument för att övervaka den elektriska strömmen i en mikrotiterplattas botten täckt med mikroelektroderhar utvecklats. Vidhäftningen av celler till brunnens yta hindrar elektronflödet, och impedansen korrelerar med den kvantitativa och kvalitativa bindningen av cellerna. Närvaron av mikroelektroderna på brunnens botten möjliggör mätning av cellvidhäftning, spridning och proliferation. Närvaron av mikroelektroderna under ett mikroporöst membran i den övre kammaren möjliggör mätning av cellmigration och invasion i den nedre kammaren, med den övre kammaren belagd med extracellulära matrisproteiner (ECM) för att möjliggöra invasion10.
Tidigare har det visats att impedansbaserade realtidsmätningar av tumörcellers migration och invasion ger realtidsdata under hela experimentet, såväl som omedelbara jämförelser och kvantifieringar under olika experimentella förhållanden11. I den metodartikeln inducerades genknockdown för att testa vilken roll proteiner av intresse spelar för tumörcellers migration och invasion. Eftersom en fullskalig genknockdown-effekt under de testade experimentella förhållandena tog 3-4 dagar efter elektroporering med små interfererande RNA (siRNA)8, ompläterades cellerna efter elektroporeringen och återskördades 3 dagar senare för impedansbaserad realtidsmätning av tumörcellmigration och invasion.
CT10-regulator av kinas (Crk) och Crk-liknande (CrkL) är adapterproteiner som förmedlar protein-proteininteraktioner nedströms olika tillväxtfaktorreceptorkinasvägar och icke-receptortyrosinkinasvägar12. Förhöjda nivåer av Crk- och CrkL-proteiner bidrar till dålig prognos vid flera humana cancerformer, inklusive glioblastom13. Det är dock oklart hur förhöjda Crk- och CrkL-proteiner leder till en dålig prognos. Därför är det viktigt att definiera effekten av Crk och CrkL-överuttryck på tumörcellsfunktioner. Tidigare har en genknockdown-studie utförts för att visa att endogena nivåer av Crk- och CrkL-proteiner krävs för glioblastomcellmigration och invasion8. Här har ett modifierat analyssystem utvecklats för att ta itu med effekten av Crk- och CrkL-överuttryck på tumörcellsmigration och invasion.
På senare tid har in vitro-syntesen av mRNA och dess terapeutiska tillämpningar fått förnyad uppmärksamhet på grund av utvecklingen av mRNA-vaccinerna mot SARS-CoV-2 (granskad av Verbeke et al.14). Dessutom har anmärkningsvärda framsteg gjorts när det gäller att använda syntetiskt mRNA vid cancer och andra sjukdomar15,16. Elektroporering av celler är en effektiv metod för att leverera syntetiskt mRNA och inducera övergående genetisk modifiering (granskad av Campillo-Davo et al.17), och användningen av syntetiskt mRNA möjliggör snabbt och effektivt genuttryck i odödliga fibroblaster18. Denna metodartikel kombinerar genöveruttryck med hjälp av syntetiskt mRNA med cellanalyser i realtid för att studera tumörcellers migration och invasion. Det experimentella schemat som används för siRNA fungerar dock inte med syntetisk mRNA-transfektion, eftersom nivån av exogena proteiner ökar snabbt och minskar gradvis vid syntetisk mRNA-transfektion18. Därför har metoden modifierats för att utföra realtidsanalys av cellmigration och invasion direkt efter transfektionen utan att ytterligare odla cellerna.
Denna metodartikel visar att en kombination av impedansbaserade realtidsmätningar med transfektion av tumörceller med syntetiska mRNA ger en snabb och omfattande analys av effekterna av genuppreglering på tumörcellers migration och invasion. Denna metodartikel beskriver detaljerade procedurer för att mäta hur glioblastomcellernas migration och invasion påverkas av överuttryck av Crk och CrkL. Genom att undersöka de koncentrationsberoende effekterna av syntetiskt mRNA på tumörcellsmigration beskriver artikeln tydligt hur en ökning av proteinnivåerna stimulerar tumörcellmigration. Dessutom presenteras ett tillvägagångssätt för att variera koncentrationen av ECM-gelen för att bedöma effekterna av förändringar i genuttryck på tumörcellsinvasion.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Syntes av mRNA
OBS: För mRNA-syntesen måste alla reagenser och utrustning specialbehandlas för att inaktivera RNaserna före användning. Se materialtabellen för detaljer om alla material, instrument och reagenser som används i detta protokoll.
- Linjärisering av DNA
OBS: Mus-cDNA från CrkI och CrkL klonades in i pFLAG-CMV-5a-uttrycksvektorn för att lägga till FLAG-epitoptaggen vid C-terminalen och subklonades till pcDNA3.1/myc-His-vektorn för att införliva T7-promotorn, som tidigare beskrivits 18,19.- Tillsätt 10 μL 10x reaktionsbuffert, 1,5 μL PmeI (10 000 enheter/ml) och 10 μg plasmid-DNA till ett mikrocentrifugrör för att linjärisera plasmid-DNA:t med restriktionsenzymet. Tillsätt nukleasfritt vatten för att få reaktionsvolymen till 100 μL.
- Blanda genom att knacka, centrifugera och inkubera reaktionsblandningen vid 37 °C över natten.
- Centrifugera och tillsätt 5 μl 10 % natriumdodecylsulfat (SDS) och 1 μl proteinas K (20 mg/ml, RNA-kvalitet) till reaktionsblandningen. Blanda genom att knacka, centrifugera och inkubera vid 50 °C i 30 minuter.
- Tillsätt 100 μL av den nedre fasen av fenol:kloroform:isoamylalkohol till plasmidreaktionsblandningen för extraktion under dragskåpet. Virtex och centrifugera sedan vid 18 800 × g i 5 minuter vid rumstemperatur. Flytta den övre fasen till ett nytt rör.
- Upprepa steg 1.1.4 med kloroform:isoamylalkohol vid 24:1.
- I det nya röret ökar reaktionsvolymen till 300 μL genom att tillsätta 200 μL nukleasfritt vatten och tillsätt sedan 30 μL 3 M natriumacetat och 600 μL 100 % etanol.
- Blanda genom virvlning och placera sedan vid −20 °C i 30-60 minuter för etanolutfällning av DNA.
- Centrifugera vid 18 800 × g i 20 minuter vid 4 °C, kassera supernatanten och skölj pelleten med 1 ml 70 % etanol. Upprepa centrifugeringen i 10 minuter och ta sedan bort supernatanten helt.
- Torka med locket öppet i 2 minuter, tillsätt 30 μL nukleasfritt vatten och återsuspendera DNA-pelleten.
- Bestäm DNA-koncentrationen med hjälp av en spektrofotometer.
- Verifiera storleken och kvantiteten av det linjäriserade DNA:t med agarosgelelektrofores.
- RNA-syntes med T7 RNA-polymeras
- Tillsätt 2 μL vardera av 10x transkriptionsbuffert, ATP, GTP, UTP, CTP och T7 och 1 μg av ett linjäriserat DNA till ett mikrocentrifugrör. Tillsätt nukleasfritt vatten för att få reaktionsvolymen till 20 μL.
- Blanda genom att knacka, snurra ner och inkubera reaktionsblandningen vid 37 °C i 2 timmar för RNA-syntes.
- Centrifugera nedåt, tillsätt 1 μl DNas (2 E/μL) och inkubera vid 37 °C i 15 minuter för att avlägsna mall-DNA.
- Litiumkloridutfällning av RNA
- Tillsätt 10 μl litiumklorid (7,5 M) till reaktionsblandningen. Blanda genom att knacka, centrifugera och inkubera reaktionsblandningen vid −20 °C i 30 minuter.
- Centrifugera vid 18 800 × g i 20 minuter vid 4 °C, kassera supernatanten och skölj pelleten med 500 μL 70 % etanol. Upprepa centrifugeringen i 10 minuter och ta sedan bort supernatanten helt.
- Torka med locket öppet i 2 minuter, tillsätt 30 μl nukleasfritt vatten och återsuspendera RNA-pelleten.
- Tak
- Värm RNA-provet vid 65 °C i 10 minuter och lägg det sedan på is för kylning.
- Tillsätt 5 μl vardera av 10x kapsyleringsbuffert, 10 mM GTP och 1 mM (10x) S-adenosylmetionin (SAM), 2 μL vardera av en täckande enzymblandning och O-metyltransferasenzymblandning och 1,25 μL RNashämmare. Blanda genom att knacka, centrifugera och inkubera reaktionsblandningen vid 37 °C i 1 timme.
- Poly(A) svansföring
- Snurra ner provet och tillsätt sedan 6 μl nukleasfritt vatten, 20 μl 5x E-PAP-buffert, 10 μl 25 mM MnCl2, 10 μL 10 mM ATP och 4 μL E-PAP poly(A)-svansenzym. Blanda genom att knacka, centrifugera och inkubera reaktionsblandningen vid 37 °C i 2 timmar.
- Utfällning av litiumklorid och kvantifiering av det syntetiska mRNA:t
- Tillsätt 50 μl litiumklorid (7,5 M) och fäll ut litiumklorid enligt beskrivningen i punkterna 1.3.1–1.3.3.
- Mät koncentrationen av mRNA med en spektrofotometer.
- Kontrollera storleken och mängden mRNA med hjälp av formaldehyd (1%-2%), agaros (1%) gelelektrofores.
2. Extracellulär matris (ECM) gelbeläggning av cellinvasions- och migrationsplattorna (CIM)
OBS: En CIM-platta (cell invasion and migration) är en kommersiellt tillverkad 16-hålsplatta för impedansbaserad cellanalys i realtid. För cellinvasionsanalysen, belägg CIM-plattorna med ECM-gel, som tidigare beskrivits men med vissa modifieringar11.
- Ta ut en alikvot ECM-gelbuljong ur frysen och lägg den på is.
- Späd ECM-gelen (10 mg/ml) till en arbetskoncentration (100 μg/ml) genom att blanda 990 μl Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) (utan serum eller antibiotika) med 10 μL ECM-gel i ett mikrocentrifugrör. Blanda genom att pipettera försiktigt.
- Tillsätt 60 μl utspädd ECM-gel till var och en av de 16 brunnarna i CIM-plattans övre kammare. Använd omvänd pipetteringsmetod samtidigt som du undviker luftbubblor20,21.
OBS: Optimera koncentrationen av ECM-gelen för varje cellinje. För glioblastomcellinjer användes 0,1 μg/μL till 1 μg/μL ECM-gel för optimering. - Placera den övre kammaren på CIM-plattan med plattlocket av på en skyddande plastskiva inuti en CO2 -inkubator i cirka 4 timmar för att bilda ett gelskikt.
VARNING: Under beläggningen av CIM-plattan med ECM-gel bör elektroderna i CIM-plattans övre kammare inte ha direkt kontakt med experimentatorns händer eller utrustningens ytor, inklusive biosäkerhetsskåpet eller CO2 -inkubatorn.
3. Beredning av tumörcellerna
OBS: Allt cellodlingsmaterial måste hållas sterilt. Skörda och elektroporera tumörcellerna under ett biologiskt säkerhetsskåp med lämplig personlig skyddsutrustning (PPE), som tidigare beskrivits men med vissa modifieringar11.
- Odling av tumörcellerna
- Odling U-118MG-celler i 10 ml DMEM innehållande 5 % fetalt bovint serum (FBS) och 1 % antibiotika per 100 mm x 20 mm polystyrenvävnadsodlingsskål vid 37 °C i en 5 % CO2 -inkubator (odlingsbetingelse).
- Serumutarmning av tumörcellerna
OBS: Cellernas exponering för de kemoattraherande medel som finns i FBS måste minimeras före cellmigrerings- och invasionsanalyserna genom att använda en hög koncentration av FBS.- Ta bort det gamla mediet och tillsätt 10 ml förvärmt DMEM som innehåller 0,5 % FBS och 1 % antibiotika per maträtt (medium med låg serumhalt).
- Upprepa steg 3.2.1.
- Inkubera cellerna vid 37 °C i en 5 % CO2 -inkubator i 4 timmar eller längre.
- Skörd av tumörcellerna
- Ta bort det gamla mediet, tillsätt 8 ml förvärmd Dulbeccos fosfatbuffrad saltlösning (DPBS) per skål, ta bort DPBS, tillsätt förvärmd 0.05 % trypsin-EDTA (2 ml/skål) för att täcka ytan och inkubera i CO 2-inkubatorn i 30 s.
- Aspirera trypsin-EDTA försiktigt, tillsätt medium med låg serumhalt (7 ml/skål) och samla sedan cellerna i ett 50 ml eller 15 ml centrifugrör.
- Alikvotera en liten volym celler och använd en handhållen automatiserad cellräknare för att räkna cellerna.
- Beräkna det totala antalet celler och erforderlig volym för 10 000 celler/μL.
- Snurra ner cellerna genom att centrifugera dem vid 100 × g i 5 minuter vid rumstemperatur, aspirera supernatanten, tillsätt den beräknade volymen DMEM innehållande 0,5 % FBS (utan antibiotika) och återsuspendera försiktigt cellpelleten.
- Överför 110 μl av cellsuspensionen, som innehåller 1,1 miljoner celler, till ett mikrocentrifugrör för varje behandling.
- Upprepa steg 3.3.6 för att överföra cellerna till fyra mikrocentrifugrör för fyra olika behandlingar.
OBS: En CIM-platta har totalt 16 brunnar. Designa fyra olika behandlingar för jämförelse så att fyra brunnar på CIM-plattan kan tilldelas för varje behandling. Använd de elektroporerade cellerna för följande experiment: western blot-analyser (0,3 miljoner celler per 35 mm vävnadsodlingsskål), fyra brunnar med cellmigrationsanalyser i realtid (0,1 miljoner celler/brunn) och fyra brunnar med cellinvasionsanalyser i realtid (0,1 miljoner celler/brunn) för varje behandling. Justera antalet celler som behöver elektroporeras om den experimentella designen ändras.
4. Elektroporering av tumörcellerna
- För att avlägsna mediet, tillsätt 1 ml DPBS till cellsuspensionen i varje rör, snurra ner cellsuspensionen tre gånger i 10 s varje gång medan du roterar röret 180° var 10:e sekund med hjälp av en minicentrifug och ta bort supernatanten med en mikropipett.
OBS: Det är viktigt att bilda en kompakt men lätt återupplivbar cellpellet. - Tillsätt 110 μl resuspensionsbuffert R till cellpelleten för att erhålla 0,1 miljoner celler i 10 μL.
- Tillsätt syntetiskt mRNA till cellpelleten för att erhålla en koncentration på 0,2-20 ng/μL beroende på önskad uttrycksnivå. Blanda och återsuspendera cellpelleten försiktigt genom att knacka eller försiktigt pipettera.
OBS: Använd olika koncentrationer av syntetiskt mRNA, undersök proteinuttrycket med hjälp av western blot-analys och bestäm koncentrationen av syntetiskt mRNA som leder till önskad uttrycksnivå för att undersöka den specifika korrelationen mellan proteinuttrycket och biologiska effekter. - Elektroporate 10 μL av cellsuspensionen med ett elektroporeringssystem vid 1 350 V i 10 ms med tre pulser varje gång.
- Överför de elektroporerade cellerna till ett nytt mikrocentrifugrör med 1,1 ml DMEM innehållande 0,5 % FBS.
- Upprepa elektroporeringen tills resten av cellsuspensionen är elektroporerad. Kombinera de elektroporerade cellerna i mikrocentrifugröret för att få 1,1 miljoner celler i 1,1 ml.
OBS: Både 100 μL och 10 μL elektroporeringsspetsar kan användas för att elektroporera en stor volym celler, men elektroporeringsspetsarna för 10 μL och 100 μL ingår i två separata kit och måste köpas separat. Resuspensionsbuffert R ingår i båda satserna. - När du har slutfört alla respektive elektroporationer, återsuspendera försiktigt de poolade cellerna.
- Platta 0,3 miljoner celler i en 35 mm x 10 mm polystyrenvävnadsodlingsskål med 2 ml DMEM innehållande 5 % FBS, och odla cellerna i 1 dag under odlingsbetingelserna för total celllysatberedning och western blot-analyser.
- Förvara resten av de elektroporerade cellerna i rumstemperatur tills cellanalyssystemet i realtid är klart.
5. Ställa in cellanalysatorn i realtid, programmet och CIM-plattorna
OBS: Förbered cellanalysatorn i realtid och två CIM-plattor, som tidigare beskrivits11.
- Jämvikt av cellanalysatorn i realtid
- Flytta cellanalysatorn i realtid till en CO2 -inkubator flera timmar före användning för att jämställa systemet under odlingsförhållandena.
- Ställa in analysprogrammet
- Öppna analysprogrammet genom att dubbelklicka på ikonen för cellanalysprogrammet i realtid på skrivbordet.
- När alternativet Standardinställning av experimentmönster är öppet väljer du alternativet för att köra tre experiment separat.
OBS: Varje vagga har ett separat fönster. Det finns olika flikar för att ställa in mätintervall och varaktighet, dataanalys och andra experimentella förhållanden. - Öppna varje vagga genom att klicka på fliken Nummer .
- Klicka på fliken Experimentanteckningar , välj den mapp som data ska sparas i och ange namnet på experimentet.
- Klicka på fliken Layout , ställ in fyrdubbla brunnar för varje behandlingstillstånd genom att välja fyra brunnar åt gången och ange provinformationen och klicka sedan på Använd.
- Klicka på fliken Schema | Lägg till ett steg för att ställa in tvåstegsläget för cellimpedansmätningarna. Klicka sedan på Verkställ för att ställa in det första steget.
- Klicka på Lägg till ett steg igen, ange 10 min för intervallet och 48 h för varaktigheten för migrering och invasion och klicka på Verkställ för att ställa in det andra steget.
OBS: Det första steget tar en engångsbaslinjemätning (ett svep med 1 minuts intervall). Det andra steget mäter cellimpedansen för experimentet (till exempel 289 svep med ett 10 minuters intervall i 48 timmar) vid vaggan. Justera intervall och varaktighet beroende på experimentell design. - Gå till nästa vagga och ställ in den genom att upprepa steg 5.2.3-5.2.7.
- Förberedelse av CIM-plattorna
- En timme innan mätningen av cellimpedansen startar, fyll brunnarna i CIM-plattans nedre kammare med 160 μL DMEM innehållande 10 % serum eller andra kemoattraherande medel.
- Montera den övre kammaren som innehåller ECM-gelbelagda brunnar (för invasion) eller obelagda brunnar (för migration) med den nedre kammaren.
- Tillsätt 50 μl medium med låg serumhalt till brunnarna i CIM-plattans övre kammare för cellmigrationsanalysen och placera CIM-plattan i systemets vagga.
- Klicka på fliken Meddelande och se till att meddelandet Anslutningar ok visas. CIM-plattan är nu redo för experimentet.
- Förinkubera den monterade CIM-plattan i CO2 -inkubatorn i 30-60 minuter före cellanalysen i realtid för att acklimatisera CIM-plattan till odlingsförhållandena.
6. Cellanalys och dataexport i realtid
OBS: Utför en baslinjeavläsning, cellsådd, cellimpedansmätning och dataexport enligt beskrivningen tidigare11.
- Baslinje läsning
OBS: Baslinjen bör läsas efter att CIM-plattan har acklimatiserats och innan cellerna läggs till brunnarna i den övre kammaren.- Klicka på Start-knappen för varje vagga. När fönstret Spara som visas sparar du experimentfilen för att utföra baslinjeläsningen.
- Cell-sådd
- Ta bort CIM-plattan från vaggan och placera den i biosäkerhetsskåpet på platthållaren.
- Tillsätt 100 μL (innehållande 100 000 celler) elektroporerade celler till brunnarna i CIM-plattans övre kammare enligt programmet i styrenheten. Använd den omvända pipetteringsmetoden samtidigt som du undviker luftbubblor.
- Lämna CIM-plattan under biosäkerhetsskåpet i 30 minuter i rumstemperatur för att se till att cellerna sprids jämnt på brunnens botten.
- Mätning av cellimpedans
- Flytta tillbaka den färdigmonterade CIM-plattan till respektive vagga. Klicka på vaggans startknapp för att påbörja cellimpedansmätningen för det andra steget.
- Klicka på fliken Plottning , klicka sedan på knappen Lägg till alla och välj rutorna Genomsnitt och STD DEV för att visualisera data i realtid.
Standardalternativet för plottning är Tid för x-axeln och Cellindex för y-axeln. Avsnittet Plottval låter användaren välja alternativa alternativ för y-axeln: Normaliserat cellindex eller Delta cellindex. När det sista svepet är gjort är experimentet klart och resultaten sparas automatiskt.
- Export av data för analys
- Klicka på fliken Plot och välj rutorna Average och STD DEV för att kopiera data för varje brunn individuellt.
- Högerklicka på ritytan och välj Kopiera data i listformat.
- Öppna en tom kalkylbladsfil, klistra in data och spara sedan filen.
- Gå tillbaka till analysprogrammet, klicka på fliken Platta för varje vagga och välj Släpp för att stänga experimentet för vaggan.
- Gå tillbaka till kalkylbladsfilen och justera tiden för rådata så att starttiden i det andra steget blir den faktiska starttiden för mätningen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Crk- och CrkL-proteiner spelar viktiga roller i motiliteten hos många celltyper, inklusive neuroner22, T-celler23, fibroblaster 18,19 och en mängd olika tumörceller13. Eftersom Crk- och CrkL-proteiner har rapporterats vara förhöjda i glioblastom24,25,26, studerades effekterna av överuttryck av CrkI, en skarvvariant av Crk, på glioblastomcellmigrationen i detta arbete. U-118MG-celler elektroporerades med olika koncentrationer av syntetiskt CrkI-mRNA och analyserades med avseende på proteinnivåer och cellmigration. Elektroporeringen av U-118MG glioblastomceller med varierande koncentrationer av syntetiskt CrkI-mRNA resulterade i en koncentrationsberoende ökning av FLAG-märkt CrkI-protein 1 dag efter transfektion (Figur 1A). Medan 0,2 ng/μL och 2 ng/μL mRNA ledde till ett odetekterbart eller blygsamt uttryck av det exogena CrkI-proteinet, resulterade 20 ng/μL mRNA i en mycket högre uttrycksnivå än det endogena CrkI-proteinet.
Resultaten från cellmigrationsanalysen med hjälp av realtidscellanalyssystemet indikerade att elektroporeringen med 0,2 ng/μL eller 2 ng/μL CrkI mRNA inte påverkade cellmigrationen nämnvärt. Elektroporering med 20 ng/μL CrkI mRNA ledde dock till en tydlig stimulering av cellmigrationen, med fler celler som migrerade mellan 2 timmar och 13 timmar (Figur 1B). Jämförelsen mellan CrkI-proteinnivån och cellmigrationen visade att glioblastomcellernas migration stimulerades av ökningen av CrkI-proteinnivån. Det verkar som om CrkI-proteinnivån bör vara högre än en viss tröskel för att orsaka en betydande stimulering av cellmigrationen. Om cellmigrationen hade mätts på olika sätt för att räkna eller observera de migrerade cellerna vid specifika tidpunkter, skulle det kanske ha krävts mycket mer ansträngning för att identifiera denna typ av förändring i cellmigrationen.
För att studera hur CrkL-överuttryck påverkar glioblastomcellinvasion genom ECM-gelskikt med olika koncentrationer av ECM-proteiner, elektroporerades U-118MG-celler med syntetiskt CrkL-mRNA och analyserades med avseende på proteinnivåer och cellinvasion genom ett ECM-gellager. Elektroporeringen av U-118MG glioblastomceller med syntetiskt CrkL-mRNA ledde till ett robust uttryck av FLAG-märkt CrkL-protein 1 dag efter transfektion (Figur 2A). När koncentrationen av ECM-proteiner ökade, avtog invasionen av kontrollcellerna (Figur 2B). CrkL-överuttryckande celler visade också en ECM-gelkoncentrationsberoende minskning av cellinvasionen (Figur 2C). Jämförelsen mellan kontrollcellerna och CrkL-överuttryckande celler vid olika ECM-gelkoncentrationer indikerade att CrkL-överuttryck i allmänhet stimulerade cellinvasion genom ECM-gelskiktet (Figur 2D-G). Skillnaden mellan de två cellpopulationerna blev dock uppenbar vid olika tidpunkter beroende på ECM-gelkoncentrationen.
För 0,1 μg/μL ECM-gelen var den CrkL-överuttrycksmedierade stimuleringen av cellinvasion tydlig mellan 8 timmar och 20 timmar (Figur 2D), men skillnaden i cellinvasion var försumbar efter 32 timmar. För 0,2 μg/μL ECM-gelen var skillnaden i cellinvasion med och utan CrkL-överuttryck minimal hela tiden (Figur 2E). För 0,5 μg/μL ECM-gelen var skillnaden i cellinvasion tydlig mellan 24 timmar och 36 timmar (Figur 2F). För ECM-gelen på 1 μg/μL blev CrkL-överuttryckseffekten på cellinvasionen något uppenbar efter 48 timmar (figur 2G). Resultaten tyder på att fönstret för att detektera skillnaden mellan kontrollcellerna och CrkL-överuttryckande celler förskjuts till senare tidpunkter när koncentrationen av ECM-gelen ökar. Resultaten tyder också på att de två cellpopulationerna påverkades olika av ökningen av ECM-gelkoncentrationen vid olika tidpunkter. Till exempel, vid 12 timmar visade de CrkL-överuttryckande cellerna betydligt högre invasion endast vid 0,1 μg/μL ECM-gel (Figur 2H). Men efter 24 timmar visade de CrkL-överuttryckande cellerna en något högre eller liknande invasion vid de testade ECM-gelkoncentrationerna (Figur 2I). Därför är det viktigt att undersöka både de tidsberoende och ECM-gelkoncentrationsberoende skillnaderna i cellinvasion för att få en heltäckande bild av skillnaderna mellan de två cellpopulationerna med och utan CrkL-överuttryck. Dessa resultat visar att en kombination av transient överuttryck med hjälp av syntetiskt mRNA med impedansbaserade cellanalyser i realtid ger ett kraftfullt verktyg för att analysera den potentiella korrelationen mellan genöveruttryck och tumörcellsmigration och invasion. Att undersöka effekterna av koncentrationsvariationer i det syntetiska mRNA- och ECM-gelen skulle ge mer exakt och detaljerad information.
Figur 1: Effekterna av CrkI-överuttryck på glioblastomcellmigration. U-118MG-celler elektroporerades med de angivna koncentrationerna (ng/μL) av FLAG-taggat CrkI-mRNA . (A) För western blot-analyserna odlades de elektroporerade cellerna under 1 dag före det totala celllysatpreparatet. Proteinnivåerna vid transfektion med syntetiskt CrkI-mRNA jämfördes. Anti-Crk- och anti-CrkL-antikroppar användes för att detektera både de endogena och de FLAG-märkta proteinerna och för att jämföra förhållandet mellan de endogena proteinerna och FLAG-märkta proteiner. Vinculin och α-tubulin användes som laddningskontroller. (B) För cellmigrationsanalyserna pläterades de elektroporerade cellerna på en CIM-platta utan ytterligare odling. Cellindexvärden erhölls från fyra brunnar för varje prov, och deras medelvärde ± SD-värden visas. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Effekter av CrkL-överuttryck på glioblastomcellinvasion. U-118MG-celler elektroporerades med nukleasfrittH2O eller 20 ng/μL FLAG-märkt CrkL-mRNA. (A) För western blot-analyserna odlades de elektroporerade cellerna under 1 dag före det totala celllysatpreparatet. Proteinnivåerna vid transfektion med syntetiskt CrkL-mRNA jämfördes. Anti-Crk- och anti-CrkL-antikroppar användes för att detektera både de endogena och de FLAG-märkta proteinerna och för att jämföra förhållandet mellan de endogena proteinerna och FLAG-märkta proteiner. Vinculin och α-tubulin användes som laddningskontroller. (B-G) För cellinvasionsanalysen pläterades de elektroporerade cellerna på en CIM-platta med en ECM-gelbeläggning utan ytterligare odling. Cellindexvärdena erhölls från fyra brunnar för varje prov, och deras medelvärde ± SD-värden visas. (B) Cellinvasionsdata från kontrollcellerna med olika ECM-gelkoncentrationer jämfördes. (C) Cellinvasionsdata från de CrkL-överuttryckande cellerna med olika ECM-gelkoncentrationer jämfördes. (D-G) Cellinvasionsdata mellan kontrollcellerna och CrkL-överuttryckande celler jämfördes med avseende på den indikerade ECM-gelkoncentrationen. (H) En jämförelse av cellinvasionen vid 12 timmar mellan kontrollcellerna och CrkL-överuttryckande celler. (I) En jämförelse av cellinvasionen vid 24 timmar mellan kontrollcellerna och CrkL-överuttryckande celler. Förkortningar: ECM = extracellulär matris; CIM = cellinvasion och migration. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Schematiska diagram över de experimentella procedurerna efter genknockdown eller genöveruttryck . A) Det experimentella förfarandet för cellanalys i realtid efter siRNA-transfektionen. Eftersom det krävs 3-4 dagar för att inducera fullständig genknockdown efter siRNA-transfektion under de experimentella förhållandena, ompläterades cellerna och odlades i 3 dagar efter elektroporeringen innan de var redo för cellanalyser i realtid. B) Experimentell metod för cellanalys i realtid efter syntetisk mRNA-transfektion. Eftersom proteinuttrycket från syntetisk mRNA-transfektion är snabbt användes de elektroporerade cellerna för cellanalyser i realtid samma dag. Notera skillnaden mellan de två experimentella procedurerna; medan cellanalys i realtid utfördes 3 dagar efter elektroporationen för genknockdown med hjälp av siRNA, utfördes cellanalys i realtid direkt efter elektroporationen för genöveruttryck med syntetiskt mRNA. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Migration och invasion är viktiga egenskaper hos tumörceller. Att mäta tumörcellers rörlighet och förstå den underliggande mekanismen som styr tumörcellernas rörlighet ger viktiga insikter om terapeutiska interventioner 2,27. Flera metoder har utvecklats för att studera cellmigration7. Sårläkningsanalysen med repor eller odlingsinsatser är en enkel och ofta använd metod som ger kontrasterande bilder av spaltförslutning. Den individuella cellspårningsanalysen kräver övervakning av enskilda celler med time-lapse-avbildning, för vilken cellerna kan märkas med fluorescerande färgämnen. Både sårläkningsanalysen och den individuella cellspårningsanalysen mäter cellernas spontana rörelse.
Med hjälp av time-lapse-avbildning och intensiv databehandling efter rekvisition kan båda analyserna ge kvantitativa jämförelser mellan prover28. Dessa analyser är dock inte lämpliga för att studera cellinvasion genom ett ECM-proteinlager. Däremot mäter transwell-migrations- och invasionsanalyserna riktad cellmigration genom ett transwell-membran med eller utan ett ECM-proteinlager. Kontinuerlig övervakning är dock inte möjlig med dessa analyser eftersom de migrerade cellerna måste samlas in vid en given tidpunkt och transbrunnen inte kan användas igen. Alla dessa analyser kräver betydande tid och ansträngning för databehandling eller för praktiska experiment för att samla in och räkna cellerna, vilket resulterar i potentiella operatörsrelaterade variationer. Den största utmaningen för dessa analyser är att göra sofistikerade kvantitativa jämförelser mellan flera kombinerade behandlingar vid olika tidpunkter.
Användningen av det cellanalyssystem i realtid som presenteras i detta arbete möjliggör kvantitativ, kontinuerlig och omfattande övervakning för att mäta cellmigration och invasion, och detta system har många fördelar jämfört med andra enkla cellmotilitetsanalyser, som ger resultat vid begränsade, fasta tidpunkter. Som med andra analyser måste de experimentella betingelserna för cellanalyserna i realtid optimeras för varje cellinje, eftersom migrationen och invasionen av olika cellinjer kan påverkas olika av cellantalet. Dessutom minskar graden av cellinvasion när koncentrationen av ECM-gelen ökar (Figur 2B,C). Därför rekommenderas det att testa olika ECM-gelkoncentrationer och jämföra effekterna av genuttrycksförändringar på cellinvasion under dessa olika ECM-gelkoncentrationer.
Med cellanalyssystemet i realtid är optimeringen enkel och okomplicerad, eftersom analyssystemet producerar data i realtid utan praktisk tid. Analyssystemet identifierar hur snart cellerna migrerar eller invaderar och när de når den maximala cellmigrationen eller invasionsnivån. Att få denna information om cellrörlighet möjliggör detaljerade jämförande analyser mellan olika behandlingsgrupper, vilket kan göras helt enkelt genom att använda programmets inbyggda funktioner. Dessutom möjliggör känsligheten hos realtidsanalyssystemet identifiering och kvantifiering av subtila förändringar i cellmigration och invasion genom koncentrationsberoende genuttryck, vilket visas i figur 1 och figur 2.
Tidigare tillhandahölls en detaljerad procedur för att mäta tumörcellers migration och invasion efter genknockdown med hjälp av det impedansbaserade cellanalyssystemet i realtid. Eftersom genknockdown tar 3-4 dagar efter att cellerna elektroporerats med siRNA, återpläterades cellerna efter elektroporering. De elektroporerade cellerna odlades i 3 dagar innan de återskördades för cellanalyserna i realtid, vilket gjorde hela experimentet till en tvåstegsprocess: elektroporering på dag 1 och cellanalys i realtid på dag 4, som visas i figur 3. Däremot är genuttrycket vid elektroporering av celler med syntetiskt mRNA snabbt och effektivt, eftersom time-lapse-analysen av fibroblaster elektroporerade med syntetiskt mRNA för GFP visade en stark GFP-signal 5 timmar efter transfektion; Fluorescensintensiteten nådde ett maximum runt 24 timmar, varefter det skedde en gradvis minskning av fluorescenssignalen18.
Dessutom, i detta arbete, visade U-118MG-cellerna robust uttryck av det exogena proteinet när de elektroporerades med syntetiskt mRNA för CrkI (Figur 1A) och för CrkL (Figur 2A), i överensstämmelse med tidigare observationer8. Därför är det lämpligt att utföra cellanalyserna i realtid direkt efter elektroporering. Några av stegen för cellanalys i realtid bör utföras innan cellerna skördas för elektroporering. Hela experimentet är en enstegsprocess som involverar elektroporering och cellanalys i realtid dag 1. Det impedansbaserade realtidscellanalyssystemet har använts i stor utsträckning för att studera tumörcellsmigration och invasion i olika solida tumörceller, inklusive bröstcancer29, kolorektal cancer 30, melanom 31, äggstockscancer 32, skivepitelcancer i huvud och hals 33, njurcancer 34, pankreascancer 35, hepatocellulärt karcinom 36 och icke-småcelliga lungcancerceller 10. Den kombinerade användningen av överuttryck av gener med hjälp av mRNA eller genknockdown med hjälp av siRNA gör därför realtidsmätningen av cellmigration och invasion mer användbar och tillämpbar.
Begränsningen med detta protokoll är att denna metod kräver dissociering och skörd av celler precis före mätningen av cellmigrationen och invasionen. De enzymatiska och mekaniska behandlingarna under dissociation, skörd och resuspension kan påverka analysen37. Dessutom kan det finnas en fördröjning i cellmigrationen medan cellerna återhämtar sig från de enzymatiska och mekaniska behandlingarna. Denna metod kanske inte är lämplig om cellerna lätt skadas av trypsinisering eller andra mekaniska behandlingar under encellsdissociation och insamling eller kräver en lång återhämtningstid efter dessa manipulationer. Denna begränsning gäller även för transwell-migrationsanalysen, som är en annan metod för att mäta riktad cellmigration. Dessutom kan elektroporeringen efter cellpreparation göra cellerna mer sårbara för skador38. Därför är det viktigt att optimera förutsättningarna för elektroporering för varje cellinje och även att elektroporera kontrollcellerna för mer exakta jämförelser.
Tillverkarens hemsida för elektroporeringssystemet tillhandahåller de rekommenderade parametrarna för elektroporering (se fotnoten i materialtabellen). Att använda konsekventa och minimalt skadliga experimentella förhållanden under celldissociation och resuspension är avgörande för att uppnå reproducerbara resultat. Dessutom är korrelering av mängden mRNA, proteinnivån och cellens rörlighet avgörande för att skilja mellan de specifika och ospecifika effekterna av mRNA-transfektion. I detta arbete observerades att om mRNA-koncentrationen översteg en viss nivå, hämmade det ospecifikt cellulära funktioner, inklusive cellmigration och invasion (data visas inte). Därför är det viktigt att titrera koncentrationen av mRNA. Dessutom är det viktigt att utföra cellanalysen i realtid när proteinuttrycket är på toppnivå, eftersom proteinuttrycket är övergående med mRNA-transfektion. Som med andra cellmotilitetsanalyser kan resultaten av denna cellanalys i realtid förväxlas av cellernas spridning under migrationen. Därför rekommenderas det att dessutom utföra en cellproliferationsanalys för att förstå hur cellproliferation påverkar cellmigrationen och invasionsresultaten.
Proteinnivåerna av Crk och CrkL är kända för att vara förhöjda i vissa typer av mänskliga cancerformer. Eftersom uttrycket av Crk och CrkL korrelerar med olika tumörcellsfunktioner och deras överuttryck bidrar till dålig prognos, har Crk och CrkL föreslagits som terapeutiska mål för cancerbehandling13. Tidigare inducerades genknockdown i glioblastomceller för att visa att glioblastomcellers migration och invasion är robusta markörer för Crk- och CrkL-aktivitet. Den aktuella studien ger en systematisk genuttrycksmetod för att inducera överuttryck av Crk och CrkL med hjälp av syntetiskt mRNA. En nära korrelation erhölls mellan proteinnivåerna av Crk och CrkL och glioblastomcellernas migration och invasion med hjälp av cellanalyssystemet i realtid. Resultaten stöder ytterligare hypotesen att Crk och CrkL spelar viktiga roller i glioblastomcellernas migration och invasion. Tillsammans med den tidigare metodartikeln11 ger denna studie en proof-of-concept-metod för att undersöka en potentiell korrelation mellan förändringar i genuttryck och tumörcellsmigration och invasion.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga intressekonflikter att redovisa.
Acknowledgments
Författarna tackar Medical Writing Center vid Children's Mercy Kansas City för redigeringen av detta manuskript. Detta arbete stöddes av Natalie's A.R.T. Foundation (till T.P.) och av ett MCA Partners Advisory Board-bidrag från Children's Mercy Hospital (CMH) och University of Kansas Cancer Center (KUCC) (till T.P.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AlphaImager HP | ProteinSimple | 92-13823-00 | Agarose gel imaging system |
| α-Tubulin antibody | Sigma | T9026 | Used to detect α-tubulin protein (dilution 1:3,000) |
| CIM-plate 16 | Agilent Technologies, Inc | 5665825001 | Cell invasion and migration plates |
| Crk antibody | BD Biosciences | 610035 | Used to detect CrkI and CrkII proteins (dilution 1:1,500) |
| CrkL antibody | Santa Cruz | sc-319 | Used to detect CrkL protein (dilution 1:1,500) |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) | ATCC | 302002 | Cell culture medium |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) | Corning | 21-031-CV | Buffer used to wash cells |
| Fetal bovine serum (FBS) | Hyclone | SH30910.03 | Culture medium supplement |
| Heracell VIOS 160i CO2 incubator | Thermo Scientific | 51030285 | CO2 incubator |
| IRDye 800CW goat anti-mouse IgG secondary antibody | Li-Cor | 926-32210 | Secondary antibody for Western blot analysis (dilution 1:10,000) |
| IRDye 800CW goat anti-rabbit IgG secondary antibody | Li-Cor | 926-32211 | Secondary antibody for Western blot analysis (dilution 1:10,000) |
| Lithium chloride | Invitrogen | AM9480 | Used for RNA precipitation |
| Matrigel matrix | Corning | 354234 | Extracellular matrix (ECM) gel |
| MEGAscript T7 transcription kit | Invitrogen | AM1334 | Used for RNA synthesis |
| Millennium RNA markers | Invitrogen | AM7150 | Used for formaldehyde agarose gel electrophoresis |
| Mini centrifuge | ISC BioExpress | C1301P-ISC | Used to spin down cells |
| Mouse brain QUICK-Clone cDNA | TaKaRa | 637301 | Source of genes (inserts) for cloning |
| NanoQuant | Tecan | M200PRO | Nucleic acid quantification system |
| Neon electroporation system | ThermoFisher Scientific | MPK5000 | Electroporation system1 |
| Neon transfection system 10 µL kit | ThermoFisher Scientific | MPK1025 | Electroporation kit |
| Neon transfection system 100 µL kit | ThermoFisher Scientific | MPK10096 | Electroporation kit |
| NorthernMax denaturing gel buffer | Invitrogen | AM8676 | Used for formaldehyde agarose gel electrophoresis |
| NorthernMax formaldehyde load dye | Invitrogen | AM8552 | Used for formaldehyde agarose gel electrophoresis |
| NorthernMax running buffer | Invitrogen | AM8671 | Used for formaldehyde agarose gel electrophoresis |
| Nuclease-free water | Teknova | W3331 | Used for various reactions during mRNA synthesis |
| Odyssey CLx Imager | Li-Cor | Imager for Western blot analysis | |
| pcDNA3.1/myc-His | Invitrogen | V80020 | The vector into which inserts (mouse CrkI and CrkL cDNAs) were cloned |
| pFLAG-CMV-5a | Millipore Sigma | E7523 | Source of the FLAG epitope tag |
| Phenol:chloroform:isoamyl alcohol | Sigma | P2069 | Used for DNA extraction |
| PmeI | New England BioLabs | R0560L | Used to linearize the plasmids for mRNA synthesis |
| Poly(A) tailing kit | Invitrogen | AM1350 | Used for poly(A) tail reaction |
| Polystyrene tissue culture dish (100 x 20 mm style) | Corning | 353003 | Used for culturing cells before transfection |
| Polystyrene tissue culture dish (35 x 10 mm style) | Corning | 353001 | Used for culturing transfected cells |
| Proteinase K | Invitrogen | 25530049 | Used to remove protein in the reaction mixture |
| Purifier Axiom Class II, Type C1 | Labconco Corporation | 304410001 | Biosafety cabinet for sterile handling of cells |
| Resuspension Buffer R | ThermoFisher Scientific | A buffer included in the electroporation kits, MPK1025 and MPK10096. The buffer is used to resupend cells before electroporation, and its composition is proprietary information. | |
| RNaseZap | Invitrogen | AM9780 | RNA decontamination solution |
| Scepter | Millipore | C85360 | Handheld automated cell counter |
| ScriptCap 2'-O-methyltransferase kit | Cellscript | C-SCMT0625 | Used for capping reaction |
| ScriptCap m7G capping system | Cellscript | C-SCCE0625 | Used for capping reaction |
| Sodium dodecyl sulfate solution | Invitrogen | 15553-035 | Detergent used for the proteinase K reaction |
| Sorvall Legend XT centrifuge | Thermo Scientific | 75004532 | Benchtop centrifuge to spin down cells |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25300-054 | Used for dissociation of cells |
| U-118MG | ATCC | HTB15 | An adherent cell line derived from a human glioblastoma patient |
| Vinculin antibody | Sigma | V9131 | Used to detect vinculin protein (dilution 1:100,000) |
| xCELLigence RTCA DP | Agilent Technologies, Inc | 380601050 | Instrument used for real-time cell analysis |
| 1Electroporation parameters and other related information for various cell lines are available on the manufacturer's homepage (https://www.thermofisher.com/us/en/home/life-science/cell-culture/transfection/neon-transfection-system/neon-transfection-system-cell-line-data.html?). |
References
- Palmer, T. D., Ashby, W. J., Lewis, J. D., Zijlstra, A. Targeting tumor cell motility to prevent metastasis. Advanced Drug Delivery Reviews. 63 (8), 568-581 (2011).
- Eccles, S. A., Box, C., Court, W. Cell migration/invasion assays and their application in cancer drug discovery. Biotechnology Annual Review. 11, 391-421 (2005).
- Kluiver, T. A., Alieva, M., van Vuurden, D. G., Wehrens, E. J., Rios, A. C. Invaders exposed: Understanding and targeting tumor cell invasion in diffuse intrinsic pontine glioma. Frontiers in Oncology. 10, 92 (2020).
- Xie, Q., Mittal, S., Berens, M. E. Targeting adaptive glioblastoma: An overview of proliferation and invasion. Neuro-Oncology. 16 (12), 1575-1584 (2014).
- Wee, Y., Wang, T., Liu, Y., Li, X., Zhao, M. A pan-cancer study of copy number gain and up-regulation in human oncogenes. Life Sciences. 211, 206-214 (2018).
- Zhao, M., Liu, Y., Qu, H. Expression of epithelial-mesenchymal transition-related genes increases with copy number in multiple cancer types. Oncotarget. 7 (17), 24688-24699 (2016).
- Pijuan, J., et al. In vitro cell migration, invasion, and adhesion assays: From cell imaging to data analysis. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 7, 107 (2019).
- Park, T., Large, N., Curran, T. Quantitative assessment of glioblastoma phenotypes in vitro establishes cell migration as a robust readout of Crk and CrkL activity. The Journal of Biological Chemistry. 296, 100390 (2021).
- Urcan, E., et al. Real-time xCELLigence impedance analysis of the cytotoxicity of dental composite components on human gingival fibroblasts. Dental Materials. 26 (1), 51-58 (2010).
- Limame, R., et al. Comparative analysis of dynamic cell viability, migration and invasion assessments by novel real-time technology and classic endpoint assays. PLoS One. 7 (10), e46536 (2012).
- Mudduluru, G., Large, N., Park, T. Impedance-based real-time measurement of cancer cell migration and invasion. Journal of Visualized Experiments. (158), e60997 (2020).
- Feller, S. M. Crk family adaptors-signalling complex formation and biological roles. Oncogene. 20 (44), 6348-6371 (2001).
- Park, T. Crk and CrkL as therapeutic targets for cancer treatment. Cells. 10 (4), 739 (2021).
- Verbeke, R., Lentacker, I., De Smedt, S. C., Dewitte, H. The dawn of mRNA vaccines: The COVID-19 case. Journal of Controlled Release. 333, 511-520 (2021).
- Heine, A., Juranek, S., Brossart, P. Clinical and immunological effects of mRNA vaccines in malignant diseases. Molecular Cancer. 20 (1), 52 (2021).
- Kwon, H., et al. Emergence of synthetic mRNA: In vitro synthesis of mRNA and its applications in regenerative medicine. Biomaterials. 156, 172-193 (2018).
- Campillo-Davo, D., et al. The ins and outs of messenger RNA electroporation for physical gene delivery in immune cell-based therapy. Pharmaceutics. 13 (3), 396 (2021).
- Park, T., Koptyra, M., Curran, T. Fibroblast growth requires CT10 regulator of kinase (Crk) and Crk-like (CrkL). The Journal of Biological Chemistry. 291 (51), 26273-26290 (2016).
- Park, T. J., Curran, T. Essential roles of Crk and CrkL in fibroblast structure and motility. Oncogene. 33 (43), 5121-5132 (2014).
- Chou, P. P., Jaynes, P. K., King, B. P., Chapman, E., Bailey, J. L. Precision comparison between conventional (method-I) and reverse (method-Ii) pipetting. Clinical Chemistry. 30 (6), 958 (1984).
- Pushparaj, P. N. Revisiting the micropipetting techniques in biomedical sciences: A fundamental prerequisite in good laboratory practice. Bioinformation. 16 (1), 8-12 (2020).
- Park, T. J., Curran, T. Crk and Crk-like play essential overlapping roles downstream of disabled-1 in the Reelin pathway. The Journal of Neuroscience. 28 (50), 13551-13562 (2008).
- Huang, Y., et al. CRK proteins selectively regulate T cell migration into inflamed tissues. The Journal of Clinical Investigation. 125 (3), 1019-1032 (2015).
- Wang, L., et al. Signaling adaptor protein Crk is indispensable for malignant feature of glioblastoma cell line KMG4. Biochemical and Biophysical Research Communications. 362 (4), 976-981 (2007).
- Kumar, S., et al. Reciprocal regulation of Abl kinase by Crk Y251 and Abi1 controls invasive phenotypes in glioblastoma. Oncotarget. 6 (35), 37792-37807 (2015).
- Kumar, S., et al. Crk tyrosine phosphorylation regulates PDGF-BB-inducible Src activation and breast tumorigenicity and metastasis. Molecular Cancer Research. 16 (1), 173-183 (2018).
- Raudenska, M., et al. Engine shutdown: Migrastatic strategies and prevention of metastases. Trends in Cancer. 9 (4), 293-308 (2023).
- Decaestecker, C., Debeir, O., Van Ham, P., Kiss, R. Can anti-migratory drugs be screened in vitro? A review of 2D and 3D assays for the quantitative analysis of cell migration. Medicinal Research Reviews. 27 (2), 149-176 (2007).
- Farasani, A., Darbre, P. D. Long-term exposure to triclosan increases migration and invasion of human breast epithelial cells in vitro. Journal of Applied Toxicology. 41 (7), 1115-1126 (2021).
- Hanusova, V., Skalova, L., Kralova, V., Matouskova, P. The effect of flubendazole on adhesion and migration in SW480 and SW620 colon cancer cells. Anti-Cancer Agents in Medicinal Chemistry. 18 (6), 837-846 (2018).
- Lago-Baameiro, N., et al. PARK7/DJ-1 inhibition decreases invasion and proliferation of uveal melanoma cells. Tumori. 109 (1), 47-53 (2023).
- Escalona, R. M., et al. Knock down of TIMP-2 by siRNA and CRISPR/Cas9 mediates diverse cellular reprogramming of metastasis and chemosensitivity in ovarian cancer. Cancer Cell International. 22 (1), 422 (2022).
- Mosca, L., et al. Effects of S-adenosyl-L-methionine on the invasion and migration of head and neck squamous cancer cells and analysis of the underlying mechanisms. International Journal of Oncology. 56 (5), 1212-1224 (2020).
- Zhao, Q., et al. VEGI174 protein and its functional domain peptides exert antitumour effects on renal cell carcinoma. International Journal of Oncology. 54 (1), 390-398 (2019).
- Witte, D., et al. TGF-beta1-induced cell migration in pancreatic carcinoma cells is RAC1 and NOX4-dependent and requires RAC1 and NOX4-dependent activation of p38 MAPK. Oncology Reports. 38 (6), 3693-3701 (2017).
- Bui, L. C., et al. Regulation of aquaporin 3 expression by the AhR pathway is critical to cell migration. Toxicological Sciences. 149 (1), 158-166 (2016).
- Tsuji, K., et al. Effects of different cell-detaching methods on the viability and cell surface antigen expression of synovial mesenchymal stem cells. Cell Transplantation. 26 (6), 1089-1102 (2017).
- Frandsen, S. K., McNeil, A. K., Novak, I., McNeil, P. L., Gehl, J. Difference in membrane repair capacity between cancer cell lines and a normal cell line. The Journal of Membrane Biology. 249 (4), 569-576 (2016).
