Summary
Muitos genes regulados estimulam a migração e invasão de células tumorais, levando a um prognóstico ruim. Determinar quais genes regulam a migração e invasão de células tumorais é fundamental. Este protocolo apresenta um método para investigar os efeitos do aumento da expressão de um gene sobre a migração e invasão de células tumorais em tempo real.
Abstract
As células tumorais são altamente móveis e invasivas e apresentam padrões alterados de expressão gênica. O conhecimento de como as alterações na expressão gênica regulam a migração e invasão de células tumorais é essencial para a compreensão dos mecanismos de infiltração de células tumorais em tecidos saudáveis vizinhos e metástases. Anteriormente, foi demonstrado que o knockdown gênico seguido da medição em tempo real baseada em impedância da migração e invasão de células tumorais permite a identificação dos genes necessários para a migração e invasão de células tumorais. Recentemente, as vacinas de mRNA contra SARS-CoV-2 aumentaram o interesse em usar mRNA sintético para fins terapêuticos. Aqui, o método usando mRNA sintético foi revisado para estudar o efeito da superexpressão gênica na migração e invasão de células tumorais. Este estudo demonstra que a expressão gênica elevada com transfecção de RNAm sintético seguida de medição em tempo real baseada em impedância pode ajudar a identificar os genes que estimulam a migração e invasão de células tumorais. Este artigo fornece detalhes importantes sobre os procedimentos para examinar o efeito da expressão gênica alterada na migração e invasão de células tumorais.
Introduction
A motilidade das células tumorais desempenha um papel crucial na metástase1,2. A disseminação de células tumorais para tecidos saudáveis vizinhos e remotos dificulta o tratamento do câncer e contribui para arecidiva3,4. Portanto, é essencial compreender os mecanismos de motilidade celular tumoral e desenvolver estratégias terapêuticas relevantes. Como muitas células tumorais apresentam perfis de expressão gênica alterados, é crucial entender quais alterações no perfil de expressão gênica levam à alteração da motilidade das célulastumorais5,6.
Vários ensaios têm sido desenvolvidos para medir a migração celular in vitro. Alguns ensaios fornecem apenas informações limitadas por permitirem apenas medições em momentos específicos, enquanto outros oferecem informações abrangentes sobre a motilidade celular tumoral em tempo real7. Embora muitos desses ensaios de motilidade celular possam fornecer resultados quantitativos em um determinado momento ou no desfecho, eles falham em fornecer informações suficientemente detalhadas sobre mudanças dinâmicas na taxa de migração celular ao longo do período experimental. Além disso, pode ser difícil examinar possíveis mudanças na taxa de migração celular dependendo do planejamento experimental, tipos de células e números de células. Além disso, os efeitos de tratamentos não complicados podem ser investigados pela simples quantificação de ensaios tradicionais de motilidade, mas quantificações mais sofisticadas podem ser necessárias para estudar os efeitos complexos de vários tratamentos combinados8.
Foi desenvolvido um instrumento para monitorar a corrente elétrica de uma placa de microtitulação coberta com microeletrodos9. A adesão das células à superfície do poço impede o fluxo de elétrons, e a impedância correlaciona-se com a ligação quantitativa e qualitativa das células. A presença dos microeletrodos no fundo do poço permite a medição da adesão, espalhamento e proliferação celular. A presença dos microeletrodos sob uma membrana microporosa da câmara superior permite medir a migração e invasão celular para a câmara inferior, com a câmara superior revestida com proteínas da matriz extracelular (MEC) para permitir a invasão10.
Anteriormente, foi demonstrado que medidas em tempo real baseadas em impedância da migração e invasão de células tumorais fornecem dados em tempo real durante todo o experimento, bem como comparações e quantificações instantâneas sob várias condiçõesexperimentais11. Nesse artigo, o knockdown gênico foi induzido para testar o papel de proteínas de interesse na migração e invasão de células tumorais. Como um efeito knockdown completo do gene nas condições experimentais testadas levou 3-4 dias após a eletroporação com pequenos RNAs interferentes (siRNAs)8, as células foram replaqueadas após a eletroporação e recolhidas 3 dias depois para a medição em tempo real baseada em impedância da migração e invasão de células tumorais.
CT10 regulador da quinase (Crk) e Crk-like (CrkL) são proteínas adaptadoras que medeiam interações proteína-proteína a jusante de várias vias da quinase do receptor do fator de crescimento e vias da tirosina quinase não-receptora12. Níveis elevados das proteínas Crk e CrkL contribuem para o mau prognóstico em vários cânceres humanos, incluindo o glioblastoma13. No entanto, não está claro como as proteínas Crk e CrkL elevadas levam a um prognóstico ruim. Portanto, é importante definir o efeito da superexpressão de Crk e CrkL sobre as funções das células tumorais. Anteriormente, um estudo de knockdown genético foi realizado para demonstrar que os níveis endógenos das proteínas Crk e CrkL são necessários para a migração e invasão de células de glioblastoma8. Aqui, um sistema de ensaio modificado foi desenvolvido para abordar o efeito da superexpressão de Crk e CrkL na migração e invasão de células tumorais.
Recentemente, a síntese in vitro de mRNA e suas aplicações terapêuticas têm chamado atenção renovada devido ao desenvolvimento das vacinas de mRNA contra SARS-CoV-2 (revisado por Verbeke et al.14). Além disso, avanços notáveis têm sido obtidos no uso do RNAm sintético em câncer e outras doenças15,16. A eletroporação de células é um método eficaz para liberar RNAm sintético e induzir modificações genéticas transitórias (revisado por Campillo-Davo et al.17), e o uso de RNAm sintético permite expressão gênica rápida e eficiente em fibroblastosimortalizados18. Este artigo de método combina a superexpressão gênica usando mRNA sintético com análises celulares em tempo real para estudar a migração e invasão de células tumorais. Entretanto, o esquema experimental utilizado para siRNAs não funciona com transfecção de RNAm sintético, pois o nível de proteínas exógenas aumenta rapidamente e diminui gradualmente com a transfecção de RNAm sintético18. Portanto, o método foi modificado para realizar a análise em tempo real da migração e invasão celular logo após a transfecção sem a cultura adicional das células.
Este artigo de método demonstra que a combinação de medidas em tempo real baseadas em impedância com a transfecção de células tumorais com mRNAs sintéticos fornece uma análise rápida e abrangente dos efeitos da upregulation gênica na migração e invasão de células tumorais. Este artigo descreve procedimentos detalhados para medir como a migração e invasão de células de glioblastoma são afetadas pela superexpressão de Crk e CrkL. Ao examinar os efeitos dependentes da concentração do mRNA sintético na migração de células tumorais, o artigo descreve claramente como um aumento nos níveis de proteína estimula a migração de células tumorais. Além disso, uma abordagem de variação da concentração do gel de MEC é apresentada para avaliar os efeitos de alterações na expressão gênica sobre a invasão de células tumorais.
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Protocol
1. Síntese de mRNA
NOTA: Para a síntese de RNAm, todos os reagentes e equipamentos devem ser especialmente tratados para inativar as RNases antes do uso. Consulte a Tabela de Materiais para obter detalhes sobre todos os materiais, instrumentos e reagentes usados neste protocolo.
- Linearização do DNA
NOTA: Os cDNAs de camundongos de CrkI e CrkL foram clonados no vetor de expressão pFLAG-CMV-5a para adicionar o epítopo FLAG no terminal C e subclonados no vetor pcDNA3.1/myc-His para incorporar o promotor T7, como descrito anteriormente 18,19.- Adicionar 10 μL de tampão de reação 10x, 1,5 μL de PmeI (10.000 unidades/mL) e 10 μg de DNA plasmidial a um tubo de microcentrífuga para linearizar o DNA plasmidial com a enzima de restrição. Adicione água livre de nucleases para elevar o volume de reação a 100 μL.
- Misture batendo, gire para baixo e incube a mistura de reação a 37 °C durante a noite.
- Gire para baixo e adicione 5 μL de dodecil sulfato de sódio (SDS) a 10% e 1 μL de proteinase K (20 mg/mL, grau RNA) à mistura de reação. Misture batendo, gire para baixo e incube a 50 °C por 30 min.
- Sob o exaustor, adicionar 100 μL da fase inferior de fenol:clorofórmio:álcool isoamílico à mistura de reação plasmidial para extração. Vórtice e, em seguida, centrifugar a 18.800 × g por 5 min à temperatura ambiente. Mova a fase superior para um novo tubo.
- Repetir o passo 1.1.4 com clorofórmio:álcool isoamílico a 24:1.
- No novo tubo, levar o volume de reação para 300 μL adicionando 200 μL de água livre de nuclease e, em seguida, adicionar 30 μL de acetato de sódio 3 M e 600 μL de etanol 100%.
- Misturar por vórtice e, em seguida, colocar a -20 °C por 30-60 min para a precipitação de etanol do DNA.
- Centrifugar a 18.800 × g por 20 min a 4 °C, descartar o sobrenadante e enxaguar o pellet com 1 mL de etanol 70%. Repita a centrifugação por 10 minutos e, em seguida, remova completamente o sobrenadante.
- Secar com a tampa aberta por 2 min, adicionar 30 μL de água livre de nucleases e ressuspender o pellet de DNA.
- Determinar a concentração de DNA usando um espectrofotômetro.
- Verificar o tamanho e a quantidade do DNA linearizado usando eletroforese em gel de agarose.
- Síntese de RNA utilizando T7 RNA polimerase
- Adicionar 2 μL de 10x de tampão de transcrição, ATP, GTP, UTP, CTP e T7 e 1 μg de um DNA linearizado a um tubo de microcentrífuga. Adicione água livre de nucleases para elevar o volume de reação para 20 μL.
- Misturar por batida, girar para baixo e incubar a mistura de reação a 37 °C por 2 h para síntese de RNA.
- Gire para baixo, adicione 1 μL de DNase (2 U/μL) e incube a 37 °C por 15 min para remover o DNA do molde.
- Precipitação de cloreto de lítio do RNA
- Adicionar 10 μL de cloreto de lítio (7,5 M) à mistura de reacção. Misture batendo, girando para baixo e incube a mistura de reação a -20 °C por 30 min.
- Centrifugar a 18.800 × g por 20 min a 4 °C, descartar o sobrenadante e enxaguar o pellet com 500 μL de etanol 70%. Repita a centrifugação por 10 minutos e, em seguida, remova completamente o sobrenadante.
- Secar com a tampa aberta por 2 min, adicionar 30 μL de água livre de nuclease e ressuspender o pellet de RNA.
- Nivelamento
- Aqueça a amostra de RNA a 65 °C por 10 min e, em seguida, coloque-a no gelo para resfriamento.
- Adicionar 5 μL cada de 10x tampão de cobertura, 10 mM GTP e 1 mM (10x) S-adenosilmetionina (SAM), 2 μL cada de uma mistura de enzimas de capping e mistura de enzimas O-metiltransferase, e 1,25 μL de inibidor de RNase. Misturar por batida, girar para baixo e incubar a mistura de reação a 37 °C por 1 h.
- Rejeito de poli(A)
- Gire a amostra e, em seguida, adicione 6 μL de água livre de nucleases, 20 μL de tampão E-PAP 5x, 10 μL de 25 mM MnCl2, 10 μL de 10 mM ATP e 4 μL de enzima de rejeito E-PAP poli(A). Misturar por batida, girar para baixo e incubar a mistura de reação a 37 °C por 2 h.
- Precipitação de cloreto de lítio e quantificação do RNAm sintético
- Adicionar 50 μL de cloreto de lítio (7,5 M) e efectuar a precipitação de cloreto de lítio conforme descrito nos passos 1.3.1-1.3.3.
- Medir a concentração do mRNA usando um espectrofotômetro.
- Verificar o tamanho e a quantidade de RNAm usando eletroforese em gel de formaldeído (1%-2%), agarose (1%).
2. Revestimento em gel da matriz extracelular (MEC) das placas de invasão e migração celular (CIM)
NOTA: Uma placa de invasão e migração celular (CIM) é uma placa de 16 poços fabricada comercialmente para análise celular em tempo real baseada em impedância. Para o ensaio de invasão celular, revestir placas CIM com gel de MEC, como descrito anteriormente, mas com algumas modificações11.
- Retire uma alíquota de caldo de gel ECM do congelador e mantenha-a no gelo.
- Diluir o gel de MEC (10 mg/mL) para uma concentração de trabalho (100 μg/mL) misturando 990 μL de Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) (sem soro ou antibióticos) com 10 μL de gel de MEC em um tubo de microcentrífuga. Misture por pipetagem suave.
- Adicionar 60 μL de gel de ECM diluído a cada um dos 16 orifícios da câmara superior da placa CIM. Aplicar o método de pipetagem reversa evitando bolhas de ar20,21.
NOTA: Otimizar a concentração do gel de MEC para cada linhagem celular. Para linhagens celulares de glioblastoma, foi utilizado gel de MEC de 0,1 μg/μL a 1 μg/μL para otimização. - Coloque a câmara superior da placa CIM com a tampa da placa desligada em uma folha plástica protetora dentro de uma incubadora de CO2 por aproximadamente 4 h para formar uma camada de gel.
CUIDADO: Durante o revestimento da placa CIM com gel de ECM, os eletrodos da câmara superior da placa CIM não devem ter contato direto com as mãos do experimentador ou com as superfícies do equipamento, incluindo o gabinete de biossegurança ou a incubadora CO2 .
3. Preparação das células tumorais
NOTA: Todos os materiais de cultura celular devem ser mantidos estéreis. Colher e eletroporar as células tumorais sob uma cabine de segurança biológica com equipamento de proteção individual (EPI) apropriado, como descrito anteriormente, mas com algumasmodificações11.
- Cultura de células tumorais
- Cultura de células U-118MG em 10 mL de DMEM contendo 5% de soro fetal bovino (SFB) e 1% de antibióticos por placa de cultura de tecido de poliestireno 100 mm x 20 mm a 37 °C em incubadora de 5% CO2 (condição de cultura).
- Depleção sérica das células tumorais
NOTA: A exposição das células aos quimioatrativos presentes na SFB deve ser minimizada antes dos ensaios de migração e invasão celular usando uma alta concentração de SFB.- Retire o meio velho e adicione 10 mL de DMEM pré-aquecido contendo 0,5% de SFB e 1% de antibióticos por prato (meio de soro baixo).
- Repita a etapa 3.2.1.
- Incubar as células a 37 °C numa incubadora de CO2 a 5% durante 4 h ou mais.
- Colheita das células tumorais
- Remova o meio antigo, adicione 8 mL de solução salina tamponada com fosfato (DPBS) pré-aquecido de Dulbecco por prato, remova o DPBS, adicione tripsina-EDTA 0,05% pré-aquecido (2 mL/prato) para cobrir a superfície e incube na incubadora CO2 por 30 s.
- Aspirar o EDTA-tripsina cuidadosamente, adicionar meio de soro baixo (7 mL/placa) e, em seguida, coletar células em um tubo de centrífuga de 50 mL ou 15 mL.
- Aliquot um pequeno volume de células, e use um contador de células automatizado portátil para contar as células.
- Calcular o número total de células e o volume necessário para 10.000 células/μL.
- Gire as células centrifugando-as a 100 × g por 5 min à temperatura ambiente, aspirar o sobrenadante, adicionar o volume calculado de DMEM contendo 0,5% de SFB (sem antibióticos) e ressuspender suavemente o pellet celular.
- Transferir 110 μL da suspensão celular, contendo 1,1 milhão de células, para um tubo de microcentrífuga para cada tratamento.
- Repetir o passo 3.3.6 para transferir as células para quatro tubos de microcentrífuga para quatro tratamentos diferentes.
NOTA: Uma placa CIM tem um total de 16 poços. Projetar quatro tratamentos diferentes para comparação de modo que quatro poços da placa CIM possam ser atribuídos para cada tratamento. Utilizar as células eletroporadas para os seguintes experimentos: análises de western blot (0,3 milhão de células por placa de cultura de tecido de 35 mm), quatro poços de ensaios de migração celular em tempo real (0,1 milhão de células/poço) e quatro poços de ensaios de invasão celular em tempo real (0,1 milhão de células/poço) para cada tratamento. Ajustar o número de células que precisam ser eletroporosas se o desenho experimental mudar.
4. Eletroporação das células tumorais
- Para remover o meio, adicione 1 mL de DPBS à suspensão celular em cada tubo, gire a suspensão da célula três vezes por 10 s cada vez enquanto gira o tubo 180° a cada 10 s usando uma mini centrífuga e remova o sobrenadante usando uma micropipeta.
NOTA: É importante formar um pellet de célula compacto, mas facilmente ressussuspensável. - Adicionar 110 μL de tampão de ressuspensão R ao pellet celular para obter 0,1 milhão de células em 10 μL.
- Adicionar mRNA sintético ao pellet celular para obter uma concentração de 0,2-20 ng/μL dependendo do nível de expressão desejado. Misture e ressuspenda o pellet de células suavemente batendo ou pipetando suavemente.
NOTA: Use diferentes concentrações de mRNA sintético, examine a expressão de proteínas usando a análise de western blot e determine a concentração de mRNA sintético que leva ao nível de expressão desejado, a fim de investigar a correlação específica entre a expressão de proteínas e efeitos biológicos. - Eletroporato de 10 μL da suspensão celular com sistema de eletroporação a 1.350 V por 10 ms com três pulsos de cada vez.
- Transferir as células eletroporadas para um novo tubo de microcentrífuga com 1,1 mL de DMEM contendo SFB a 0,5%.
- Repita a eletroporação até que o restante da suspensão celular seja eletroporado. Combinar as células eletroporadas no tubo de microcentrífuga para obter 1,1 milhão de células em 1,1 mL.
NOTA: Ambas as pontas de eletroporação de 100 μL e 10 μL podem ser usadas para eletroporar um grande volume de células, mas as pontas de eletroporação para 10 μL e 100 μL estão incluídas em dois kits separados e precisam ser adquiridas separadamente. O buffer de ressuspensão R está incluído em ambos os kits. - Ao completar todas as respectivas eletroporações, ressuspenda suavemente as células agrupadas.
- Placa de 0,3 milhão de células em placa de cultura de tecido de poliestireno de 35 mm x 10 mm com 2 mL de DMEM contendo 5% de SFB e cultura das células por 1 dia sob condição de cultura para preparação de lisado celular total e análises de western blot.
- Mantenha o restante das células eletroporosas à temperatura ambiente até que o sistema de análise celular em tempo real esteja pronto.
5. Configuração do analisador de células em tempo real, do programa e das placas CIM
NOTA: Prepare o analisador de células em tempo real e duas placas CIM, conforme descrito anteriormente11.
- Equilíbrio do analisador de células em tempo real
- Mova o analisador de células em tempo real para uma incubadora de CO2 várias horas antes do uso para equilibrar o sistema sob a condição de cultura.
- Configurando o programa de análise
- Abra o programa de análise clicando duas vezes no ícone do software de análise de células em tempo real na área de trabalho.
- Quando a opção Configuração de Padrão de Experimento estiver aberta, selecione a opção para executar três experimentos separadamente.
Observação : cada berço tem uma janela separada. Existem diferentes guias para configurar o intervalo de medição e a duração, a análise de dados e outras condições experimentais. - Abra cada berço clicando na guia Número .
- Clique na guia Notas do experimento, selecione a pasta na qual os dados serão salvos e insira o nome do experimento .
- Clique na guia Layout , configure poços quádruplos para cada condição de tratamento selecionando quatro poços de cada vez e inserindo as informações da amostra e, em seguida, clique em Aplicar.
- Clique na aba Programação | Adicione uma etapa para configurar o modo de duas etapas das medições de impedância da célula. Em seguida, clique em Aplicar para configurar a primeira etapa.
- Clique em Adicionar uma etapa novamente, digite 10 min para o intervalo e 48 h para a duração da migração e invasão, e clique em Aplicar para configurar a segunda etapa.
NOTA: O primeiro passo faz uma medição de linha de base única (uma varredura com um intervalo de 1 minuto). A segunda etapa mede a impedância celular para o experimento (por exemplo, 289 varreduras com intervalo de 10 min por 48 h) no berço. Ajustar o intervalo e a duração em função do desenho experimental. - Mova para o próximo suporte e configure-o repetindo as etapas 5.2.3-5.2.7.
- Preparação das placas CIM
- Uma hora antes do início da impedância celular, preencher os orifícios da câmara inferior da placa CIM com 160 μL de DMEM contendo 10% de soro ou outros quimioatrativos.
- Montar a câmara superior que contém os poços revestidos com gel de MEC (para invasão) ou poços não revestidos (para migração) com a câmara inferior.
- Adicionar 50 μL de soro baixo aos orifícios da câmara superior da placa CIM para o ensaio de migração celular e colocar a placa CIM no berço do sistema.
- Clique na guia Mensagem e verifique se a mensagem Conexões ok é exibida. A placa CIM já está pronta para o experimento.
- Pré-incubar a placa CIM montada na incubadora CO2 por 30-60 min antes da análise celular em tempo real para aclimatar a placa CIM à condição de cultura.
6. Análise de células em tempo real e exportação de dados
Observação : execute uma leitura de linha de base, propagação de célula, medição de impedância de célula e exportação de dados conforme descrito anteriormente11.
- Leitura da linha de base
NOTA: A linha de base deve ser lida após a placa CIM ser aclimatada e antes que as células sejam adicionadas aos poços da câmara superior.- Clique no botão Iniciar para cada suporte. Quando a janela Salvar como for exibida, salve o arquivo experimental para executar a leitura da linha de base.
- Semeadura de células
- Retire a placa CIM do berço e coloque-a no armário de biossegurança no suporte da placa.
- Adicionar 100 μL (contendo 100.000 células) de células eletroporosas aos orifícios da câmara superior da placa CIM de acordo com o programa na unidade de controle. Aplique o método de pipetagem reversa evitando bolhas de ar.
- Deixe a placa CIM sob o gabinete de biossegurança por 30 minutos à temperatura ambiente para garantir que as células se espalhem uniformemente no fundo do poço.
- Medição de impedância celular
- Mova a placa CIM totalmente montada de volta para o respectivo berço. Clique no botão Iniciar do suporte para iniciar a medição da impedância da célula para a segunda etapa.
- Clique na guia Plotar , clique no botão Adicionar Tudo e selecione as caixas Average e STD DEV para visualizar os dados em tempo real.
Observação : A opção de plotagem padrão é tempo para o eixo x e índice de célula para o eixo y. A seção Plot Selection permite que o usuário selecione opções alternativas para o eixo y: Normalized Cell Index ou Delta Cell Index. Uma vez que a varredura final é feita, o experimento é concluído e os resultados são salvos automaticamente.
- Exportação dos dados para análise
- Clique na guia Plotar e selecione as caixas Average e STD DEV para copiar os dados de cada poço individualmente.
- Clique com o botão direito do mouse na área de plotagem e selecione Copiar dados em formato de lista.
- Abra um arquivo de planilha vazio, cole os dados e salve o arquivo.
- Volte para o programa de análise, clique na guia Placa para cada berço e selecione Liberar para fechar o experimento para o berço.
- Volte para o arquivo de planilha e ajuste a hora dos dados brutos para que a hora de início na segunda etapa se torne a hora de início real da medição.
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Representative Results
As proteínas Crk e CrkL desempenham papéis importantes na motilidade de muitos tipos celulares, incluindo neurônios22, células T23, fibroblastos 18,19 e uma variedade de células tumorais13. Uma vez que as proteínas Crk e CrkL foram relatadas como elevadas no glioblastoma24,25,26, os efeitos da superexpressão de CrkI, uma variante de emenda de Crk, sobre a migração celular de glioblastoma foram estudados neste trabalho. Células U-118MG foram eletroporosadas com diferentes concentrações de RNAm sintético de CrkI e analisadas quanto aos níveis de proteína e migração celular. A eletroporação de células de glioblastoma U-118MG com concentrações variáveis de mRNA sintético de CrkI resultou em um aumento dependente da concentração na proteína CrkI marcada com FLAG 1 dia após a transfecção (Figura 1A). Enquanto 0,2 ng/μL e 2 ng/μL de mRNA levaram a uma expressão indetectável ou modesta da proteína exógena CrkI, 20 ng/μL de mRNA resultaram em um nível de expressão muito maior do que a proteína CrkI endógena.
Os resultados do ensaio de migração celular usando o sistema de análise celular em tempo real indicaram que a eletroporação com 0,2 ng/μL ou 2 ng/μL de mRNA CrkI não afetou muito a migração celular. No entanto, a eletroporação com 20 ng/μL de RNAm CrkI levou a uma clara estimulação da migração celular, com mais células migrando entre 2 h e 13 h (Figura 1B). A comparação entre o nível da proteína CrkI e a migração celular revelou que a migração celular de glioblastoma foi estimulada pelo aumento do nível da proteína CrkI. Parece que o nível de proteína CrkI deve ser maior do que um certo limiar para causar uma estimulação substancial da migração celular. Se a migração celular tivesse sido medida de maneiras diferentes para contar ou observar as células migradas em pontos de tempo específicos, muito mais esforço poderia ter sido necessário para identificar esse tipo de mudança na migração celular.
Para estudar como a superexpressão de CrkL influencia a invasão celular de glioblastoma através de camadas de gel de MEC com diferentes concentrações de proteínas de MEC, células U-118MG foram eletroporosadas com mRNA sintético de CrkL e analisadas em termos de níveis de proteína e invasão celular através de uma camada de gel de MEC. A eletroporação de células de glioblastoma U-118MG com mRNA sintético de CrkL levou a uma expressão robusta da proteína CrkL marcada com FLAG 1 dia após a transfecção (Figura 2A). À medida que a concentração de proteínas da MEC aumentava, a invasão das células controle diminuía (Figura 2B). As células superexpressantes de CrkL também mostraram uma diminuição dependente da concentração do gel de MEC na invasão celular (Figura 2C). A comparação entre as células controle e as células superexpressantes de CrkL em diferentes concentrações de gel de MEC indicou que a superexpressão de CrkL geralmente estimulava a invasão celular através da camada de gel de MEC (Figura 2D-G). No entanto, a diferença entre as duas populações celulares tornou-se óbvia em diferentes momentos dependendo da concentração do gel de MEC.
Para o gel de MEC 0,1 μg/μL, a estimulação mediada por superexpressão de CrkL de invasão celular foi evidente entre 8 h e 20 h (Figura 2D), mas a diferença na invasão celular foi desprezível após 32 h. Para o gel de MEC de 0,2 μg/μL, a diferença na invasão celular com e sem superexpressão de CrkL foi mínima em todos os momentos (Figura 2E). Para o gel de MEC de 0,5 μg/μL, a diferença na invasão celular foi evidente entre 24 h e 36 h (Figura 2F). Para o gel de 1 μg/μL de MEC, o efeito da superexpressão de CrkL sobre a invasão celular tornou-se ligeiramente aparente em 48 h (Figura 2G). Os resultados sugerem que a janela para detectar a diferença entre as células controle e as células superexpressas de CrkL muda para tempos posteriores à medida que a concentração do gel de MEC aumenta. Os resultados também sugerem que as duas populações celulares foram afetadas diferencialmente pelo aumento da concentração do gel de MEC em diferentes momentos. Por exemplo, em 12 h, as células superexpressantes de CrkL mostraram invasão substancialmente maior apenas a 0,1 μg/μL de gel de MEC (Figura 2H). No entanto, em 24 h, as células superexpressas de CrkL mostraram invasão um pouco maior ou semelhante nas concentrações de gel de MEC testadas (Figura 2I). Portanto, é importante investigar as diferenças dependentes do tempo e dependentes da concentração do gel de MEC na invasão celular para obter uma visão abrangente das diferenças entre as duas populações celulares com e sem superexpressão de CrkL. Esses resultados demonstram que a combinação de superexpressão transitória usando RNAm sintético com análises celulares em tempo real baseadas em impedância fornece uma ferramenta poderosa para analisar a correlação potencial entre a superexpressão gênica e a migração e invasão de células tumorais. Examinar os efeitos das variações de concentração no RNAm sintético e no gel de MEC forneceria informações mais precisas e detalhadas.
Figura 1: Efeitos da superexpressão de CrkI na migração celular de glioblastoma. Células U-118MG foram eletroporadas com as concentrações indicadas (ng/μL) de mRNA CrkI marcado com FLAG. (A) Para as análises de western blot, as células eletroporadas foram cultivadas por 1 dia antes da preparação do lisado celular total. Os níveis de proteína na transfecção com RNAm sintético de CrkI foram comparados. Anticorpos anti-Crk e anti-CrkL foram usados para detectar as proteínas endógenas e marcadas com FLAG e para comparar a razão entre as proteínas endógenas e as proteínas marcadas com FLAG. Vinculina e α-tubulina foram usadas como controles de carregamento. (B) Para as análises de migração celular, as células eletroporadas foram plaqueadas em placa CIM sem cultura adicional. Os valores do índice celular foram obtidos de quatro poços para cada amostra, e seus valores médios ± DP são mostrados. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Efeitos da superexpressão de CrkL na invasão celular de glioblastoma. Células U-118MG foram eletroporadas com mRNA de CrkL marcado com H2O livre de nuclease ou 20 ng/μL marcado com FLAG. (A) Para as análises de western blot, as células eletroporadas foram cultivadas por 1 dia antes da preparação do lisado celular total. Os níveis de proteína na transfecção com RNAm sintético de CrkL foram comparados. Anticorpos anti-Crk e anti-CrkL foram usados para detectar as proteínas endógenas e marcadas com FLAG e para comparar a razão entre as proteínas endógenas e as proteínas marcadas com FLAG. Vinculina e α-tubulina foram usadas como controles de carregamento. (B-G) Para a análise da invasão celular, as células eletroporadas foram plaqueadas em placa CIM com revestimento em gel de MEC sem posterior cultura. Os valores do índice celular foram obtidos de quatro poços para cada amostra, e seus valores médios ± DP são mostrados. (B) Os dados de invasão celular das células controle com diferentes concentrações de gel de MEC foram comparados. (C) Os dados de invasão celular das células superexpressando CrkL com várias concentrações de gel de MEC foram comparados. (D-G) Os dados de invasão celular entre as células controle e as células superexpressantes de CrkL foram comparados para a concentração de gel de MEC indicada. (H) Comparação da invasão celular em 12 h entre as células controle e as células superexpressas por CrkL. (I) Comparação da invasão celular em 24 h entre as células controle e as células superexpressantes de CrkL. Abreviações: MEC = matriz extracelular; CIM = invasão e migração celular. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Diagramas esquemáticos dos procedimentos experimentais após knockdown ou superexpressão gênica. (A) O procedimento experimental da análise celular em tempo real após a transfecção de siRNA. Uma vez que 3-4 dias são necessários para induzir o knockdown completo do gene após a transfecção de siRNA nas condições experimentais, as células foram replaqueadas e cultivadas por 3 dias após a eletroporação antes de estarem prontas para análises celulares em tempo real. (B) O procedimento experimental para a análise celular em tempo real após a transfecção de RNAm sintético. Como a expressão proteica da transfecção de RNAm sintético é rápida, as células eletroporadas foram utilizadas para análises celulares em tempo real no mesmo dia. Observe a diferença entre os dois procedimentos experimentais; enquanto a análise celular em tempo real foi realizada 3 dias após a eletroporação para knockdown gênico usando siRNAs, a análise celular em tempo real foi realizada logo após a eletroporação para superexpressão gênica com mRNA sintético. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Migração e invasão são características importantes das células tumorais. A mensuração da motilidade das células tumorais e a compreensão do mecanismo subjacente que controla a motilidade das células tumorais fornecem informações críticas para intervenções terapêuticas 2,27. Vários métodos têm sido desenvolvidos para estudar a migração celular7. O ensaio de cicatrização de feridas com arranhões ou pastilhas de cultura é um método simples e frequentemente utilizado que fornece imagens contrastantes de fechamento de lacunas. O ensaio de rastreamento celular individual requer o monitoramento de células individuais com imagens de lapso de tempo, para as quais as células podem ser marcadas com corantes fluorescentes. Tanto o ensaio de cicatrização de feridas quanto o ensaio de rastreamento celular individual medem o movimento espontâneo das células.
Com o auxílio de imagens de lapso de tempo e processamento intensivo de dados pós-requisição, ambos os ensaios podem fornecer comparações quantitativas entre amostras28. No entanto, esses ensaios não são adequados para estudar a invasão celular através de uma camada de proteína da MEC. Em contraste, os ensaios de migração e invasão transwell medem a migração celular direcionada através de uma membrana de inserção de transwell com ou sem uma camada de proteína da MEC. No entanto, o monitoramento contínuo não é viável com esses ensaios, pois as células migradas precisam ser coletadas em um determinado ponto de tempo, e o transwell não pode ser usado novamente. Todos esses ensaios requerem tempo e esforço significativos para o processamento de dados ou para experimentos práticos para coletar e contar as células, resultando em potenciais variações relacionadas ao operador. O maior desafio para esses ensaios é fazer comparações quantitativas sofisticadas entre múltiplos tratamentos combinados em vários momentos.
O uso do sistema de análise celular em tempo real apresentado neste trabalho permite o monitoramento quantitativo, contínuo e abrangente para medir a migração e invasão celular, e este sistema tem muitas vantagens sobre outros ensaios simples de motilidade celular, que fornecem resultados em pontos de tempo limitados e fixos. Assim como em outros ensaios, as condições experimentais das análises celulares em tempo real precisam ser otimizadas para cada linhagem celular, pois a migração e invasão de diferentes linhagens celulares podem ser afetadas diferencialmente pelo número de células. Além disso, a taxa de invasão celular diminui com o aumento da concentração do gel de MEC (Figura 2B,C). Portanto, recomenda-se testar diferentes concentrações de gel de MEC e comparar os efeitos das alterações na expressão gênica sobre a invasão celular sob essas diferentes concentrações de gel de MEC.
Com o sistema de análise de células em tempo real, a otimização é fácil e direta, pois o sistema de ensaio produz dados em tempo real sem tempo prático. O sistema de ensaio identifica em quanto tempo as células migram ou invadem e quando atingem o nível máximo de migração ou invasão celular. A obtenção dessas informações sobre a motilidade celular permite análises comparativas detalhadas entre vários grupos de tratamento, o que pode ser feito simplesmente usando os recursos internos do programa. Além disso, a sensibilidade do sistema de ensaios em tempo real permite identificar e quantificar alterações sutis na migração e invasão celular pela expressão gênica concentração-dependente, como demonstrado na Figura 1 e Figura 2.
Anteriormente, um procedimento detalhado foi fornecido para medir a migração e invasão de células tumorais após knockdown de genes usando o sistema de análise celular em tempo real baseado em impedância. Como o knockdown gênico leva de 3 a 4 dias após as células serem eletroporadas com siRNAs, as células foram replaqueadas após a eletroporação. As células eletroporadas foram cultivadas por 3 dias antes de serem recolhidas para as análises celulares em tempo real, tornando todo o experimento um processo de duas etapas: eletroporação no dia 1 e análise celular em tempo real no dia 4, como mostra a Figura 3. Em contraste, a expressão gênica na eletroporação de células com RNAm sintético é rápida e eficiente, uma vez que a análise de lapso de tempo de fibroblastos eletroporados com mRNA sintético para GFP mostrou um forte sinal de GFP 5 h após a transfecção; A intensidade da fluorescência atingiu um máximo em torno de 24 h, após o que houve um declínio gradual no sinal de fluorescência18.
Além disso, neste trabalho, as células U-118MG apresentaram expressão robusta da proteína exógena quando eletroporosas com RNAm sintético para CrkI (Figura 1A) e para CrkL (Figura 2A), consistente com observaçõesanteriores8. Portanto, é apropriado realizar as análises celulares em tempo real logo após a eletroporação. Algumas das etapas para a análise celular em tempo real devem ser realizadas antes da colheita das células para eletroporação. Todo o experimento é um processo de uma etapa envolvendo eletroporação e análise celular em tempo real no dia 1. O sistema de análise celular em tempo real baseado em impedância tem sido usado extensivamente para estudar a migração e invasão de células tumorais em várias células tumorais sólidas, incluindo câncer de mama29, câncer colorretal 30, melanoma 31, câncer de ovário 32, câncer escamoso de cabeça e pescoço 33, carcinoma de células renais 34, carcinoma pancreático 35, carcinoma hepatocelular 36 e células de câncer de pulmão de células não pequenas 10. Portanto, o uso combinado de superexpressão gênica usando mRNA ou knockdown gênico usando siRNAs torna a medição em tempo real da migração e invasão celular mais útil e aplicável.
A limitação deste protocolo é que este método requer dissociação e colheita de células antes da medição da migração e invasão celular. Os tratamentos enzimático e mecânico durante a dissociação, colheita e ressuspensão podem afetar a análise37. Além disso, pode haver um atraso na migração celular enquanto as células se recuperam dos tratamentos enzimático e mecânico. Este método pode não ser apropriado se as células forem facilmente danificadas por tripsinização ou outros tratamentos mecânicos durante a dissociação e coleta de uma única célula ou se exigirem um longo tempo de recuperação após essas manipulações. Essa limitação também se aplica ao ensaio de migração transwell, que é outro método para medir a migração celular direcionada. Além disso, a eletroporação após o preparo celular pode tornar as células mais vulneráveis a danos38. Portanto, é importante otimizar as condições de eletroporação para cada linhagem celular e também eletroporar as células controle para comparações mais precisas.
A página inicial do fabricante para o sistema de eletroporação fornece os parâmetros recomendados para eletroporação (veja a nota de rodapé na Tabela de Materiais). O uso de condições experimentais consistentes e minimamente prejudiciais durante a dissociação e ressuspensão celular é fundamental para a obtenção de resultados reprodutíveis. Além disso, correlacionar a quantidade de RNAm, o nível de proteína e a motilidade celular é crucial para distinguir entre os efeitos específicos e inespecíficos da transfecção de RNAm. Neste trabalho, observou-se que, se a concentração de RNAm excedia um determinado nível, inibia inespecificamente as funções celulares, incluindo migração e invasão celular (dados não mostrados). Portanto, é importante titular a concentração de RNAm. Além disso, é fundamental realizar a análise celular em tempo real quando a expressão proteica está em seu nível máximo, uma vez que a expressão proteica é transitória com a transfecção de RNAm. Como acontece com outros ensaios de motilidade celular, os resultados desta análise celular em tempo real podem ser confundidos pela proliferação de células durante a migração. Portanto, recomenda-se a realização adicional de um ensaio de proliferação celular para entender a influência da proliferação celular nos resultados de migração e invasão celular.
Os níveis de proteína de Crk e CrkL são conhecidos por serem elevados em alguns tipos de cânceres humanos. Como a expressão de Crk e CrkL correlaciona-se com várias funções de células tumorais e sua superexpressão contribui para o mau prognóstico, Crk e CrkL têm sido propostos como alvos terapêuticos para o tratamento docâncer13. Anteriormente, o knockdown gênico foi induzido em células de glioblastoma para demonstrar que a migração e invasão de células de glioblastoma são marcadores robustos da atividade de Crk e CrkL. O presente estudo fornece uma abordagem sistemática de expressão gênica para induzir a superexpressão de Crk e CrkL usando mRNA sintético. Uma estreita correlação foi obtida entre os níveis proteicos de Crk e CrkL e a migração e invasão celular de glioblastoma usando o sistema de análise celular em tempo real. Os resultados apoiam ainda mais a hipótese de que Crk e CrkL desempenham papéis essenciais na migração e invasão de células de glioblastoma. Juntamente com o artigo de métodos anteriores11, este estudo fornece uma abordagem de prova de conceito para investigar uma correlação potencial entre alterações na expressão gênica e migração e invasão de células tumorais.
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Disclosures
Os autores não têm conflitos de interesse a declarar.
Acknowledgments
Os autores agradecem ao Medical Writing Center at Children's Mercy Kansas City pela edição deste manuscrito. Este trabalho foi apoiado pela Fundação A.R.T. de Natalie (para T.P.) e por uma concessão do Conselho Consultivo de Parceiros da MCA do Children's Mercy Hospital (CMH) e do University of Kansas Cancer Center (KUCC) (para T.P.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AlphaImager HP | ProteinSimple | 92-13823-00 | Agarose gel imaging system |
| α-Tubulin antibody | Sigma | T9026 | Used to detect α-tubulin protein (dilution 1:3,000) |
| CIM-plate 16 | Agilent Technologies, Inc | 5665825001 | Cell invasion and migration plates |
| Crk antibody | BD Biosciences | 610035 | Used to detect CrkI and CrkII proteins (dilution 1:1,500) |
| CrkL antibody | Santa Cruz | sc-319 | Used to detect CrkL protein (dilution 1:1,500) |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) | ATCC | 302002 | Cell culture medium |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) | Corning | 21-031-CV | Buffer used to wash cells |
| Fetal bovine serum (FBS) | Hyclone | SH30910.03 | Culture medium supplement |
| Heracell VIOS 160i CO2 incubator | Thermo Scientific | 51030285 | CO2 incubator |
| IRDye 800CW goat anti-mouse IgG secondary antibody | Li-Cor | 926-32210 | Secondary antibody for Western blot analysis (dilution 1:10,000) |
| IRDye 800CW goat anti-rabbit IgG secondary antibody | Li-Cor | 926-32211 | Secondary antibody for Western blot analysis (dilution 1:10,000) |
| Lithium chloride | Invitrogen | AM9480 | Used for RNA precipitation |
| Matrigel matrix | Corning | 354234 | Extracellular matrix (ECM) gel |
| MEGAscript T7 transcription kit | Invitrogen | AM1334 | Used for RNA synthesis |
| Millennium RNA markers | Invitrogen | AM7150 | Used for formaldehyde agarose gel electrophoresis |
| Mini centrifuge | ISC BioExpress | C1301P-ISC | Used to spin down cells |
| Mouse brain QUICK-Clone cDNA | TaKaRa | 637301 | Source of genes (inserts) for cloning |
| NanoQuant | Tecan | M200PRO | Nucleic acid quantification system |
| Neon electroporation system | ThermoFisher Scientific | MPK5000 | Electroporation system1 |
| Neon transfection system 10 µL kit | ThermoFisher Scientific | MPK1025 | Electroporation kit |
| Neon transfection system 100 µL kit | ThermoFisher Scientific | MPK10096 | Electroporation kit |
| NorthernMax denaturing gel buffer | Invitrogen | AM8676 | Used for formaldehyde agarose gel electrophoresis |
| NorthernMax formaldehyde load dye | Invitrogen | AM8552 | Used for formaldehyde agarose gel electrophoresis |
| NorthernMax running buffer | Invitrogen | AM8671 | Used for formaldehyde agarose gel electrophoresis |
| Nuclease-free water | Teknova | W3331 | Used for various reactions during mRNA synthesis |
| Odyssey CLx Imager | Li-Cor | Imager for Western blot analysis | |
| pcDNA3.1/myc-His | Invitrogen | V80020 | The vector into which inserts (mouse CrkI and CrkL cDNAs) were cloned |
| pFLAG-CMV-5a | Millipore Sigma | E7523 | Source of the FLAG epitope tag |
| Phenol:chloroform:isoamyl alcohol | Sigma | P2069 | Used for DNA extraction |
| PmeI | New England BioLabs | R0560L | Used to linearize the plasmids for mRNA synthesis |
| Poly(A) tailing kit | Invitrogen | AM1350 | Used for poly(A) tail reaction |
| Polystyrene tissue culture dish (100 x 20 mm style) | Corning | 353003 | Used for culturing cells before transfection |
| Polystyrene tissue culture dish (35 x 10 mm style) | Corning | 353001 | Used for culturing transfected cells |
| Proteinase K | Invitrogen | 25530049 | Used to remove protein in the reaction mixture |
| Purifier Axiom Class II, Type C1 | Labconco Corporation | 304410001 | Biosafety cabinet for sterile handling of cells |
| Resuspension Buffer R | ThermoFisher Scientific | A buffer included in the electroporation kits, MPK1025 and MPK10096. The buffer is used to resupend cells before electroporation, and its composition is proprietary information. | |
| RNaseZap | Invitrogen | AM9780 | RNA decontamination solution |
| Scepter | Millipore | C85360 | Handheld automated cell counter |
| ScriptCap 2'-O-methyltransferase kit | Cellscript | C-SCMT0625 | Used for capping reaction |
| ScriptCap m7G capping system | Cellscript | C-SCCE0625 | Used for capping reaction |
| Sodium dodecyl sulfate solution | Invitrogen | 15553-035 | Detergent used for the proteinase K reaction |
| Sorvall Legend XT centrifuge | Thermo Scientific | 75004532 | Benchtop centrifuge to spin down cells |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25300-054 | Used for dissociation of cells |
| U-118MG | ATCC | HTB15 | An adherent cell line derived from a human glioblastoma patient |
| Vinculin antibody | Sigma | V9131 | Used to detect vinculin protein (dilution 1:100,000) |
| xCELLigence RTCA DP | Agilent Technologies, Inc | 380601050 | Instrument used for real-time cell analysis |
| 1Electroporation parameters and other related information for various cell lines are available on the manufacturer's homepage (https://www.thermofisher.com/us/en/home/life-science/cell-culture/transfection/neon-transfection-system/neon-transfection-system-cell-line-data.html?). |
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