Summary
Hier beschrijven we een preklinisch orthotopisch muismodel voor GBM, vastgesteld door intracraniële injectie van cellen afgeleid van genetisch gemanipuleerde muismodeltumoren. Dit model toont de ziektekenmerken van menselijke GBM. Voor translationele studies wordt de hersentumor van de muis gevolgd door in vivo MRI en histopathologie.
Abstract
Genetisch gemanipuleerde muis (GEM) modellen voor menselijk glioblastoom multiforme (GBM) zijn van cruciaal belang voor het begrijpen van de ontwikkeling en progressie van hersentumoren. In tegenstelling tot xenografttumoren, ontstaan tumoren in GEM's in de oorspronkelijke micro-omgeving in een immunocompetente muis. Het gebruik van GBM GEMs in preklinische behandelingsstudies is echter een uitdaging vanwege lange tumorlatenties, heterogeniteit in neoplasmafrequentie en de timing van geavanceerde tumorontwikkeling. Muizen geïnduceerd via intracraniële orthotopische injectie zijn beter handelbaar voor preklinische studies en behouden kenmerken van de GEM-tumoren. We genereerden een orthotopisch hersentumormodel afgeleid van een GEM-model met Rb, Kras en p53-aberraties (TRP), dat GBM-tumoren ontwikkelt met lineaire foci van necrose door neoplastische cellen en dichte vascularisatie analoog aan menselijke GBM. Cellen afgeleid van GEM GBM-tumoren worden intracraniaal geïnjecteerd in wild-type, stam-gematchte ontvangende muizen en reproduceren graad IV-tumoren, waardoor de lange tumorlatentieperiode bij GEM-muizen wordt omzeild en de creatie van grote en reproduceerbare cohorten voor preklinische studies mogelijk wordt. De zeer proliferatieve, invasieve en vasculaire kenmerken van het TRP GEM-model voor GBM worden samengevat in de orthotopische tumoren en histopathologiemarkers weerspiegelen menselijke GBM-subgroepen. Tumorgroei wordt gemonitord door seriële MRI-scans. Vanwege de invasieve aard van de intracraniële tumoren in immunocompetente modellen, is het zorgvuldig volgen van de hier beschreven injectieprocedure essentieel om extracraniële tumorgroei te voorkomen.
Introduction
Glioblastoom (GBM; graad IV glioom) is de meest voorkomende en kwaadaardige hersentumor en de huidige therapieën zijn niet effectief, wat resulteert in een mediane overleving van 15 maanden1. Betrouwbare en nauwkeurige preklinische modellen die de complexe signaalroutes vertegenwoordigen die betrokken zijn bij de groei en pathogenese van hersentumoren zijn essentieel om de vooruitgang bij het evalueren van nieuwe therapeutische regimes voor GBM te versnellen. Muismodellen waarin menselijke hersentumorcellijnen subcutaan worden geïmplanteerd in immuungecompromitteerde muizen weerspiegelen niet de inheemse immuunomgeving van hersentumoren, noch kunnen ze worden gebruikt om het vermogen van therapeutica om de bloed-hersenbarrière te passerente evalueren 2. Idealiter zouden preklinische muismodellen ook de menselijke GBM-histopathologie nauwkeurig moeten reproduceren, inclusief het hoge niveau van invasiviteit in het omringende parenchym3. Hoewel genetisch gemanipuleerde muismodellen (GEM) tumoren ontwikkelen in de context van een intact immuunsysteem, zijn er vaak gecompliceerde fokschema's nodig en kunnen tumoren zich langzaam en inconsistent ontwikkelen4. GEM-afgeleide allograftmodellen zijn beter geschikt voor preklinische therapeutische studies, waarbij grote cohorten tumordragende muizen nodig zijn in een korter tijdsbestek.
In een eerder rapport beschreven we een orthotopisch GBM-muismodel dat rechtstreeks is afgeleid van GEM-tumoren. Tumorigenese in het GEM wordt geïnitieerd door genetische gebeurtenissen in celpopulaties (voornamelijk astrocyten) die gliaal fibrillair zuur eiwit (GFAP) tot expressie brengen, die resulteren in progressie naar GBM. Deze TRP GEMs bevatten een TgGZT121-transgen (T), dat T121 tot expressie brengt na blootstelling aan de GFAP-aangedreven Cre-recombinase. T121 eiwitexpressie resulteert in de onderdrukking van Rb (Rb1, p107 en p103) eiwitactiviteit. Co-expressie van een GFAP-gedreven Cre-transgen (GFAP-CreERT2) richt zich op expressie naar volwassen astrocyten na inductie met tamoxifen. TRP-muizen herbergen ook een Cre-afhankelijke mutant Kras (KrasG12D; R) allel, om de activering van de receptor tyrosine kinase route weer te geven, en zijn heterozygoot voor het verlies van Pten (P)5,6. Gelijktijdige genafwijkingen in de receptor tyrosinekinase (RTK), PI3K en RB-netwerken zijn betrokken bij 74% van de GBM-pathogenese7. Daarom worden de primaire signaalroutes die zijn veranderd in menselijke GBM vertegenwoordigd door de gemanipuleerde mutaties in TRP-muizen, in het bijzonder GBM-tumoren, waarin gedeelde downstream-doelen van RTK's worden geactiveerd5.
Het gem-afgeleide syngenetische orthotopische model werd gevalideerd als een model dat kenmerken van menselijke hersentumoren samenvat, inclusief invasiviteit en de aanwezigheid van subtype biomarkers, voor gebruik als een platform om kankertherapieën te evalueren die gericht zijn op afwijkende routes in GBM. Cellen werden gekweekt uit tumoren geoogst uit TRP-hersenen en opnieuw geïmplanteerd in de hersenen van op stam afgestemde muizen, met behulp van stereotactische apparatuur voor intracraniële injectie in de cortex. Dit preklinische orthotopische muismodel ontwikkelde GBM-tumoren die zeer cellulair, invasief, pleomorf waren met een hoge mitotische snelheid en lineaire foci van necrose vertoonden door neoplastische cellen en dichte vascularisatie, zoals waargenomen voor menselijke GBM. Tumorvolumes en groei werden gemeten met in vivo magnetische resonantie beeldvorming (MRI).
In dit rapport beschrijven we de optimale techniek voor de intracraniële injectie van primaire GBM-cellen of cellijnen in het wild-type muizenbrein, met TRP-tumoren als voorbeeld. Hetzelfde protocol kan worden aangepast voor immuungecompromitteerde muizen en andere GBM-cellijnen. Cruciale tips worden gegeven voor het vermijden van veelvoorkomende valkuilen, zoals suboptimale celvoorbereiding of cellekkage op de injectieplaats, en voor het correct gebruiken van de stereotactische apparatuur om de reproduceerbaarheid en betrouwbaarheid van het model te garanderen. Voor translationele doeleinden valideren we het model door MRI-detectie van hersentumorgroei bij levende dieren, histologische karakterisering en presenteren we een voorbeeld van behandeling bij tumordragende muizen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Het hier beschreven onderzoeksprotocol is goedgekeurd door het NCI van het Frederick Animal Care and Use Committee. NCI-Frederick is geaccrediteerd door AAALAC International en volgt het beleid van de volksgezondheidsdienst voor de verzorging en het gebruik van proefdieren. Dierverzorging werd verleend in overeenstemming met de procedures die zijn beschreven in de "Guide for Care and Use of Laboratory Animals (National Research Council, 2011; De National Academies Press, Washington D.C.).
1. Voorbereiding van cellen voor injectie
OPMERKING: Primaire cellen van muizenhersentumoren (MBR's) die voor dit model werden gebruikt, werden oorspronkelijk geïsoleerd uit tamoxifen-geïnduceerde TRP GEM-muizen, zoals beschreven in El Meskini et al.5. Details over het celpreparaat zijn te vinden in deze referentie.
- Voer de volgende stappen uit met behulp van steriele techniek in een bioveiligheidskast.
- Kweek primaire hersentumorcellen in vitro totdat ze de exponentiële groeifase bereiken.
- Oogst de cellen in 0,25% trypsine en zodra ze zijn losgemaakt, verdun ze met groeimedium om de trypsine te inactiveren.
- Pellet de cellen door centrifugeren op 400 x g en was met serumvrije media. Herhaal dit één keer voordat u gaat tellen.
- Tel de cellen handmatig of met een geautomatiseerde celteller. Resuspendeer de cellen in 5% steriele methylcellulose in 1x fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) in de gewenste concentratie, op basis van een eindinjectievolume van 2 μL. De gewenste celconcentratie kan variëren op basis van de cellijn en het hersentumormodel. Voor GBM GEM TRP-cellen injecteren we 2 μL van een 25 x 106 cellen / ml-oplossing, of 50.000 cellen.
2. Muizenstam
- Fok of koop een geschikte muizenstam die overeenkomt met de stamachtergrond van de hersentumorcellen. Gebruik voor TRP-cellen 9 weken oude B6D2F1 / J-muizen (van een kruising tussen C57BL / 6J [B6] -vrouwtjes en DBA / 2J [D2] -mannetjes) als ontvangers van tumorcellen.
3. Het chirurgische gebied instellen
OPMERKING: Alle chirurgische stappen worden uitgevoerd met behulp van aseptische techniek in een schone, ontsmette omgeving. Scrubs en persoonlijke beschermingsmiddelen, waaronder een masker, moeten door de chirurg worden gedragen. Chirurgische hulpmiddelen moeten vóór gebruik met warmte worden gesteriliseerd.
- Plaats oppervlaktebeschermers onder het stereotaxische apparaat en op het werkoppervlak.
- Bevestig de vinylslang van het anesthesieapparaat aan de IN-poort van het gasanesthesieplatform van het stereotaxische apparaat en een andere buis aan de OUT-poort.
- Sluit het digitale display aan op een voedingsbron en op het apparaat.
- Sluit de micropompregelaar (figuur 1A) aan op een voedingsbron en bevestig de micropomp (figuur 1A) aan de manipulatorarm van het apparaat (zie ook de instructies van de fabrikant).
- Stel de micropomp in op 5,6 nL/s voor de volume-injectie van 2.000 nL.
- Zet de hete kraalsterilisator aan.
- Sluit het verwarmingskussen van de muis aan op de temperatuurregelaar en sluit het aan op een voedingsbron. Plaats de plaat op het podiumplatform. Stel de plaattemperatuur in op 37 °C.
- Backload een 30 G precisiespuit en zorg ervoor dat u geen bubbels introduceert. Plaats de zuiger en bevestig de naald. Zorg ervoor dat u de naald alleen bij de naaf vastpakt. Druk de zuiger in totdat een druppel van het methylcellulosecelmengsel door de naald stroomt. Reinig de naald met een 70% alcoholbereidingspad door voorzichtig de zijkanten van de naald af te vegen of door een steriel gaasje op het werkoppervlak te plaatsen en het te deppen. Zorg ervoor dat u de naald niet buigt of breekt.
- Bevestig de precisiespuit aan de micropomp en draai de manipulatorarm weg van het podium om verplaatsing van de spuitnaald te voorkomen voordat u de muis op het podium plaatst.
4. De muis voorbereiden op een operatie
- Verdoof de muis door deze in de inductiekamer te plaatsen met de isofluraan vaporizer ingesteld op 2,5%, of volgens institutionele richtlijnen. Zet de isofluraanstroom naar de neuskegel aan.
- Breng de muis over naar het stereotaxische apparaat en bevestig deze aan de neuskegel, met de bovenste tanden op de neuskegelsteun geplaatst (figuur 1B, 9). Draai de knop op de neuskegel vast om vast te zetten (figuur 1B). Zorg voor een passend niveau van anesthesie door een teenknijper uit te voeren om te controleren op reflex.
- Controleer de oren, voeten en slijmvliezen op kleur (roze) om voldoende oxygenatie te garanderen. Controleer ook de ademhalingsfrequentie (een toename of afname kan wijzen op de noodzaak om isofluraanniveaus aan te passen).
- Steek oorbalkjes (figuur 1B) in beide oren en draai de knop vast om het hoofd vast te zetten.
- Breng oogzalf aan om de ogen te smeren terwijl de muis onder narcose is.
- Gebruik een gebogen tang om het haar op het hoofd van de muis te plukken naar een gebied dat ongeveer 150% groter is dan de geplande incisie, om adequate aseptische omstandigheden te garanderen.
- Injecteer 0,5-1 mg/kg buprenorfine SR-analgesie subcutaan of gebruik een ander door het protocol goedgekeurd analgeticum.
- Plaats de rectale sonde van de muis om de interne temperatuur te controleren en onderkoeling als gevolg van anesthesie te voorkomen. Houd de lichaamstemperatuur van de muis tussen 36,5 en 38,5 °C.
- Ontsmet het operatieveld met behulp van buitenste cirkels, afwisselend drie keer een chirurgische scrub en ethanol.
- Gebruik een tang om de huid strak te trekken en maak een incisie van ongeveer 1 cm met het scalpelmesje, beginnend tussen de ogen. De bregma moet zichtbaar zijn door de incisie.
OPMERKING: Voor de juiste steriele techniek raakt u de chirurgische plaats alleen aan met de uiteinden van gesteriliseerde gereedschappen en plaatst u gereedschapspunten alleen op een steriel oppervlak (zoals de binnenkant van een geautoclaveerd gereedschapspakket). - Gebruik het houten uiteinde van de applicator met katoenpunt om overtollig bindweefsel weg te schrapen en vervolgens het katoenen uiteinde van een andere applicator te drogen.
5. Celinjectie
- Plaats de manipulatorarm met de bevestiging van de spuit over de muis en draai de knop vast om vast te zetten. Gebruik de X- en Y-knoppen in het horizontale vlak om de spuitbevestiging over bregma te bewegen. Laat de naald zakken met de Z-knop om de bregmapositie te bevestigen. Stel de digitale uitleesconsole in op nul.
- Gebruik de X- en Y-knoppen en de bijbehorende digitale uitlezing om de naald naar de gewenste positie te verplaatsen. Voor de corticale cortexlocatie zijn de juiste coördinaten 3 mm posterieur, 2 mm lateraal rechts naar de bregma en 2 mm diep van de dura mater. Gebruik de Z-knop om de naald naar het oppervlak van de schedel te verplaatsen.
- Prik een gat in de schedel met een spuit van 1 ml met een bijgevoegde naald van 25 G. Plaats de schuine kant van de naald in de richting van de 30 G precisiespuit en naald en draai de manipulatorarm voorzichtig naar de zijkant. Rol met duim en vinger de naald langzaam heen en weer met zachte druk totdat de naaldpunt net de schedeldop doorboort.
- Gebruik een applicator met katoenen punt om bloed weg te deppen van het naaldgat. Plaats de manipulatorarm terug in de juiste positie met de geladen precisiespuitnaald boven het gat. Lijn de punt van de naald uit met het gat, gebruik de Z-knop om de naald naar de hersendura te laten zakken en stel de digitale uitleesconsole op nul.
- Laat met de Z-knop de naald 1 mm zakken en wacht 1 minuut. Herhaal dit totdat de gewenste diepte is bereikt (2 mm zoals aangegeven).
OPMERKING: De naald wordt langzaam neergelaten om extra schade aan het omliggende hersenweefsel en de terugstroom van de celoplossing te voorkomen. - Start de micropomp en controleer vervolgens of de pomp stopt wanneer 2 μL is geïnjecteerd. Dit proces duurt ongeveer 6 minuten bij de aangegeven snelheid. Wacht vervolgens 1 minuut voordat u de naald verplaatst.
6. Verwijdering van de naald en wondsluiting
- Til de naald 1 mm op en wacht 1 min. Herhaal dit totdat de naald volledig vrij is van de schedel.
- Gebruik indien nodig een applicator met katoenpunt om bloed weg te deppen van de injectieplaats.
- Gebruik het houten uiteinde van een applicator met katoenen punt en neem een klein stukje botwas (~ 1 mm) en vorm het tot een kegel. Plaats het in de opening in de schedel en duw de was in het gat.
- Verwarm de tang met behulp van een kralensterilisator en gebruik ze om de resterende was op de schedel te smelten en glad te maken.
- Plaats ongeveer twee druppels bupivacaïne (verdovings)oplossing in de incisie en gebruik een tang om de randen van de huid samen te trekken.
- Trek de huid strak en plaats een of twee wondclips om de huid te sluiten.
- Plaats de muis in een schone herstelkooi op een verwarmingskussen in een tochtvrije ruimte en observeer de muis nauwkeurig. Laat de muis volledig ontwaken uit de anesthesie en hervat de normale activiteit voordat u hem terugbrengt naar de normale behuizing.
- Controleer de muis dagelijks na de chirurgische ingreep en dien pijnbestrijding toe, volgens de institutionele richtlijnen.
- Als buprenorfine SR (stap 4.6) wordt gebruikt voor analgesie, duurt de formule met aanhoudende afgifte 72 uur. Herhaal de injectie alleen als er na 72 uur zichtbare pijn of ongemak aanwezig is. Wanneer correct uitgevoerd, herstellen de muizen goed van de intracraniële injecties en is extra analgesie niet nodig.
- Verwijder de nietjes 7-10 dagen na de operatie.
- Controleer de tumorgroei door beeldvorming van levende dieren (MRI).
- Euthanaseer de muizen wanneer humane eindpunten worden bereikt (d.w.z. als het dier 20% lichaamsgewicht verliest of onderkoeld raakt).
- Vanwege de invasieve aard van deze hersentumoren, observeer de muizen op neurologische symptomen, zoals ongelijkmatige gang, gedeeltelijke verlamming, draaien of hoofdkanteling. Euthanaseer een muis als een van deze klinische tekenen van gevorderde tumorgroei wordt waargenomen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Muizen geïnjecteerd met hersentumorcellen moeten dagelijks worden gecontroleerd op tekenen van tumorgroei zoals toevallen, ataxie of gewichtsverlies. De groei van hersentumoren kan ook worden gecontroleerd door MRI-scans met regelmatige tussenpozen. Wekelijkse MRI-scans maken het mogelijk om de toenemende tumorlast in de hersenen en tumorvolumemetingen te visualiseren (figuur 1C). In het bijzonder vertonen TRP-tumoren agressieve groei en 3D-tumorvolumes zijn meetbaar met MRI binnen 2 tot 3 weken na intracraniële injectie (met een gemiddeld volume van 30 tot 40 mm3). In één representatieve studie werd een cohort hersentumordragende muizen verdeeld in twee groepen voor controle versus bestralingstherapie; MRI-tumorvolumemeting toonde een gebrek aan tumorgroeionderdrukking na bestraling (figuur 2A), wat resulteerde in geen toename van de overleving voor de behandelde muizen (figuur 2B).
Bij obductie kunnen tumoren verschijnen als een donkere vlek op de hersenen in een gezwollen rechterhersenhelft (figuur 3A, middenpaneel), of in het geval van grotere tumoren, als een verhoogd, verduisterd gebied. Voor histopathologische analyse zorgt sagittale doorsnede door het gebied van de injectieplaats (figuur 3A) voor een optimale beoordeling van de tumorgroei en de mate van invasie in niet-kwaadaardig hersenweefsel. GBM-tumoren in syngenetische modellen kunnen agressief groeien en de schedel doorbreken door het terminale eindpunt, dat kan worden waargenomen bij obductie. Daarentegen duidt extracraniële groei kort na celimplantatie waarschijnlijk op een lekkage van cellen tijdens de injectie, die kan worden waargenomen op MRI-scans (figuur 3B), of in een levende muis door een koepelvormig gebied op het hoofd. Het is mogelijk dat de naald te snel van de injectieplaats is verwijderd (zie rubriek 6). Extracraniële groei wordt bevestigd als lekkage op de injectieplaats door histologische beoordeling.
In het TRP-orthotopische model bevestigde histopathologie de aanwezigheid van graad IV astrocytoom/GBM, inclusief recapitulatie van de onderscheidende kenmerken waargenomen in TRP GEM-tumoren zoals pseudopalisading en necrose (figuur 4). GBM neurale stamcel- en voorlopermarkers beschreven voor humane GBM-subclassificatie werden geëvalueerd door immunohistochemie (figuur 5). Wijdverspreide expressie van gliaal fibrillair zuur eiwit (GFAP) duidt op een proliferatieve tumor van astrocytische voorloperoorsprong, terwijl Nestin en Sox-2 gevestigde neuronale voorlopermarkers zijn, en Olig-2-expressie bevestigt de aanwezigheid van cellen van oligodendrocytische oorsprong 5,7. Alle vier de markers komen sterk tot expressie in subtypen van menselijke GBM8.
Figuur 1: Intracraniële implantaatapparatuur en groei van TRP GBM-tumoren gevisualiseerd door seriële MRI. (A) Opstelling van het apparaat met verschillende elementen die nodig zijn voor intracraniële implantaten (1 tot 11 beschreven); specifieke plaatsing van de muiskop en inhalatie-anesthesie-eenheid wordt vergroot in (B). Wekelijkse beeldvorming werd uitgevoerd op een MRI 3.0T klinische scanner met een op maat gemaakte vier muis SENSE array surface coil 5,9. Multi-slice T2-gewogen turbo spin echo (T2w-TSE) sequentie: (TR/TE (4437/100 ms), in vlakresolutie (0,12 x 0,15 mm), plakdikte (0,5 mm), SENSE versnellingsfactor (4) beelden werden verkregen in het axiale vlak om het hele muizenbrein te bedekken. Getoond zijn coronale secties van tumoren op 3, 4 en 5 weken na implantaat. Een representatieve schaalbalk voor MRI-beelden wordt rechtsonder (C) aangegeven. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Representatieve werkzaamheidsstudie van een orthotopisch GBM-model met bestralingsbehandeling. (A) Driedimensionale tumorvolumes berekend op basis van MRI-scans, overeenkomend met week 2, 3 en 4 post-tumorimplantaten. De volumes van de hersentumoren werden gemeten door analyse van de MRI-beelden. Na het uploaden van een MRI-beeld in het ITK_SNAP programma werden het beeldcontrast en het beeldintensiteitsgebiedfilter aangepast. Na de actieve contourinitialisatie en beeldsegmentatie werd het tumorvolume gemeten in kubieke milimieters. Individuele controle (onbehandelde) muizen en muizen behandeld door bestraling (3 Gy per dag gedurende 5 dagen voor een totaal van 15 Gy) worden uitgezet. (B) Overleving van met straling behandelde muizen in vergelijking met controle. Het overlevingspercentage werd berekend met grafische software (zie Tabel van Materialen) van in totaal n = 11 onbehandelde muizen en n = 12 met straling behandelde muizen. Studiemuizen werden geëuthanaseerd toen humane eindpunten werden bereikt, op basis van onze institutionele richtlijnen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Tumorlocatie in de hersenen bij obductie . (A) Juiste locatie van tumorgroei in de rechter muishelft. Het linkerpaneel toont een voorbeeld van een tumor in de hersenen van een MRI-scan bij beëindiging van het onderzoek; De rode pijl geeft de tumorlocatie aan. Het ontlede muizenbrein wordt getoond in de schedel (middenpaneel) en verwijderd uit de schedelholte (rechterpaneel). In het middelste paneel geven blauwe pijlen de naaldinslag van de injectieplaats aan en dubbelpuntige pijlen geven de aanbevolen locatie van de sagittale snede in de hersenen aan voor histologie, waarbij de rechterhersenhelft in twee delen wordt gesplitst. Beide hersendelen zijn ingebed in paraffine op een "open boek" manier. De stippellijn geeft de mediane longitudinale spleet aan die de twee hersenhelften scheidt als referentie. In het rechterpaneel vertegenwoordigt het gebied omsloten door de stippellijn het zichtbare tumorgebied bij obductie. (B) Een voorbeeld van een hersentumor die buiten de schedel van de muis groeit, wordt getoond in de MRI-scan. Een representatieve schaalbalk voor beide MRI-beelden is weergegeven in figuur 3A. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Histopathologie van orthotopische TRP GBM-tumoren vat de kenmerken van menselijke GBM samen. Hematoxyline en eosine (H &E) gekleurde, sagittale delen van de hele hersenen werden geëvalueerd door een ACVP-board-gecertificeerde veterinaire patholoog, en de tumoren werden beoordeeld op basis van de huidige classificatie van de Wereldgezondheidsorganisatie (WHO) voor menselijke astrocytomen10,11. Orthotopische GBM-tumoren zijn zeer proliferatief, invasief (I) en gevasculariseerd (V) en vertonen kenmerken van menselijke GBM-histopathologie, waaronder necrose (N) en pseudopalisering (P) door neoplastische cellen12. Onderbroken lijnen tonen vergroting van de gebieden binnen de hersentumor en aan de periferie, grenzend aan normaal hersenweefsel (respectievelijk rechtsboven en onder). Antilichamen en methoden voor immunohistochemie worden beschreven in El Meskini et al.5. Er wordt een schaalbalk voor H&E-afbeeldingen weergegeven voor zowel lage als hoge vergrotingen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Biomarkers van GBM uitgedrukt in het orthotopische model. Expressie van de multipotente voorlopermarker SOX-2 (SRY-Box transcriptiefactor 2), neurale voorlopers Nestin en Olig-2, en de gliale fibrillaire zure eiwit (GFAP) astrocytische marker duiden op cellulaire heterogeniteit, een gemeenschappelijk kenmerk van menselijke GBM 7,8. Een representatieve schaalbalk voor alle IHC-afbeeldingen wordt weergegeven in Olig2 (Oligodendrocytentranscriptiefactor 2;rechtsonder). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Preklinische modellen zijn essentieel voor de evaluatie van nieuwe therapeutische doelen en nieuwe behandelingsstrategieën in GBM. Genetisch gemanipuleerde muismodellen voor GBM hebben het voordeel dat tumoren voorkomen op de autochtone plaats, maar vaak met een lange latentie en onvoorspelbare tumorgroei13. De GEM-modeltumoren vertonen een latentie van 4-5 maanden en het ideale tijdvenster voor beeldvorming, rekrutering en behandeling is variabel bij individuele muizen. Het orthotopische model heeft een gevestigde en handelbare groei- en behandelingstijdlijn van 4-5 weken en tumoren worden betrouwbaar gedetecteerd door MRI na implantaat. Het gebruik van GEM-afgeleide orthotopische modellen maakt het mogelijk om de tumor op de exacte locatie in elke muis te plaatsen, evenals temporele controle van tumorgroeiinitiatie, terwijl het voordeel van de omringende micro-omgeving van de hersenen behouden blijft. In het TRP-orthotopische model produceren geactiveerde RTK-, PTEN- en RB-routes een tumormodel dat de histologische kenmerken van menselijke GBM samenvat. Analoog aan menselijke GBM vertonen orthotopische TRP GBM-tumoren kenmerken van agressieve groei, zoals necrotische foci omringd door pseudopaliserende neoplastische cellen en neovascularisatie. Tumoren zijn ook invasief in het omliggende hersenparenchym. Daarom kunnen middelen die tumorinfiltratie en migratie bij patiënten kunnen onderdrukken, preklinisch worden geëvalueerd in TRP-orthotopische tumoren. Het proces van het injecteren van cellen van invasieve GEM-tumoren in syngenetische muizen vereist bijzondere voorzichtigheid om onbedoelde lekkage en groei van cellen buiten het beoogde gebied te voorkomen. De hier beschreven methode kan, wanneer routinematig toegepast, worden gebruikt om grote cohorten tumordragende muizen te genereren met consistente tumorgroei.
Kritieke stappen in het protocol die van invloed kunnen zijn op een succesvolle tumorinjectie zijn onder meer het verwijderen van de naald uit de hersenen na de celinjectie en het gebruik van botwas. De naald moet 1 mm per keer worden ingebracht en verwijderd (zoals beschreven in stap 5 en 6), om extra schade aan het omliggende hersenweefsel en het lekken van restcellen of terugstroom van de geïnjecteerde suspensiete voorkomen 14. Het gebruik van gesmolten botwas om het naaldgat te dichten en af te dichten, creëert een barrière om cellekkage te voorkomen, net als het implanteren van cellen in een methylcellulosuspensie. Belangrijk is dat methylcellulose moet worden gemengd in een gebufferde oplossing zoals PBS (of als alternatief, serumvrije media) voordat de hersencellen worden geresuspendeerd. Bovendien heeft het gebruik van inhalatie-anesthesie de voorkeur boven injecteerbare anesthesie, om de hersteltijd te verkorten.
Houd er rekening mee dat de hoofdgrootte enigszins kan verschillen tussen muizenstammen of op leeftijd en geslacht; Het is dus mogelijk dat de stereotactische apparatuur opnieuw moet worden gekalibreerd bij het overschakelen van het ene muiscohorttype naar het andere. We raden ook aan om het celnummer voor injectie voor elke cellijn van belang in een klein aantal muizen te optimaliseren voordat u doorgaat met een groot cohort. In vergelijking met menselijke xenografts kunnen muizentumoren agressief groeien wanneer ze opnieuw worden geïmplanteerd in op stam afgestemde muizen en hebben ze minder cellen nodig voor injectie, zoals we hebben waargenomen met TRP-lijnen.
Een belangrijk voordeel van orthotopische herseninjectie in vergelijking met de initiatie en groei van glioblastoom in een GEM-model is dat het weefsel rond de geïnjecteerde tumor normaal is en dat lokale invasiviteit kan worden beoordeeld door histopathologie. We kunnen echter niet uitsluiten dat veranderingen in de micro-omgeving als gevolg van de injectiewond zelf, die mogelijk resulteren in een lokale ontstekingsreactie of verstoring van de bloed-hersenbarrière.
Kortom, orthotopische modellen maken de studie van GBM mogelijk, met een redelijke tijdlijn voor behandeling en binnen de context van de inheemse tumorlocatie. Ons model vat menselijke GBM-kenmerken samen, maar in een immunocompetente muis; Daarom kan de immuunmicro-omgeving worden geanalyseerd ten opzichte van tumorgroei of als reactie op immunotherapie. Tumorgroei is agressief en invasief, in tegenstelling tot veel cellijn xenograft GBM-modellen waarin de tumor ingekapseld blijft en niet de histologische kenmerken van humaan GBMvertoont 13,15,16. Indien correct uitgevoerd, resulteert de hier beschreven procedure in betrouwbare tumorgroei zonder cellekkage of extracraniële verspreiding.
Ten slotte, hoewel dit protocol is geoptimaliseerd in de context van GBM als een orthotopisch muismodel, kan de nauwkeurigheid en betrouwbare toepassing ervan in preklinische translatie worden aangepast aan modellen van andere hersentumorsubklassen. Methoden en reagentia in dit protocol kunnen worden gebruikt voor verschillende celtype-implantaten met mutaties voor het hersentumormodel van belang (bijv. Diffuus middenlijnglioom17), met de aanpassing van stereotaxische coördinaten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren geen belangenverstrengeling te hebben.
Acknowledgments
We zijn de heer Alan E. Kulaga dankbaar voor de uitstekende technische assistentie en mevrouw Michelle L. Gumprecht voor het verfijnen van de chirurgische technieken. We bedanken Dr. Philip L. Martin voor pathologie-analyse en mevrouw Lilia Ileva en Dr. Joseph Kalen van het Frederick National Laboratory Small Animal Imaging Program voor MRI-scans.
Dit project is geheel of gedeeltelijk gefinancierd met federale fondsen van het National Cancer Institute, National Institutes of Health, onder contractnummer HHSN261201500003I. De inhoud van deze publicatie weerspiegelt niet noodzakelijkerwijs de standpunten of het beleid van het ministerie van Volksgezondheid en Human Services, noch impliceert de vermelding van handelsnamen, commerciële producten of organisaties goedkeuring door de Amerikaanse overheid.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5% methylcellulose in 1X PBS, autoclaved | Millipore Sigma | M7027 | |
| 1mL Tuberculin Syringe, slip tip | BD | 309659 | |
| 6" Cotton Tipped Applicators | Puritan | S-18991 | |
| Adjustable stage platform | David Kopf Instruments | Model 901 | |
| Aerosol Barrier Tips | Fisher Scientific | 02-707-33 | |
| Alcohol Prep Pads Sterile, Large - 2.5 x 3 Inch | PDI | C69900 | |
| B6D2 mouse strain (C57Bl/6J x DBA/2J) | Jackson Laboratory | Jax #10006 | |
| Bone Wax | Surgical Specialties | 901 | |
| Bupivacaine 0.25% | Henry Schein | 6023287 | |
| BuprenorphineSR | ZooPharm | n/a | |
| Clear Vinyl Tubing 1/8ID X 3/16OD | UDP | T10004001 | |
| CVS Lubricant Eye Ointment | CVS Pharmacy | 247881 | |
| Disposable Scalpels, #10 blade | Scalpel Miltex | 16-63810 | |
| Gas anesthesia machine with oxygen hook-up and anesthesia box | Somni Scientific | n/a | Investigator may use facility standard equipment |
| Gas anesthesia platform for mice | David Kopf Instruments | Model 923-B | |
| GraphPad Prism | Graphpad | Prism 9 version 9.4.1 | |
| Hamilton 30 g needle, ½ “, small hub, point pst 3 | Hamilton | Special Order | |
| Hamilton precision microliter syringe, 1701 RN, no needle 10 µL | Hamilton | 7653-01 | |
| Hot bead sterilizer with beads | Fine Science Tools | 18000-45 | |
| Invitrogen Countess 3 Automated Cell Counter | Fisher Scientific | AMQAX2000 | |
| IsoFlurane | Piramal Critical Care | 29404 | |
| Isopropyl Alcohol Prep Pads | PDI | C69900 | |
| ITK_SNAP (Version 36.X, 2011-present) | Penn Image Computing and Science Laboratory (PICSL) at the University of Pennsylvania, and the Scientific Computing and Imaging Institute (SCI) at the University of Utah | ||
| KOPF Small Animal Stereotaxic Instrument with digital readout console | David Kopf Instruments | Model 940 | |
| Masterflex Fitting, PVDF, Straight, Hose Barb Reducer, 1/4" ID x 1/8" ID | Masterflex | HV-30616-16 | |
| Mouse Heating Plate | David Kopf Instruments | PH HP-4M | |
| Mouse Rectal Probe | David Kopf Instruments | PH RET-3-ISO | |
| Nalgene Super Versi-Dry Surface Protectors | ThermoFisher Scientific | 74000-00 | |
| P20 pipette | Gilson | F123600 | |
| Povidone Iodine Surgical Scrub | Dynarex | 1415 | |
| Reflex 9 mm Wound Clip Applicator | Fine Science Tools | 12031-09 | |
| Reflex 9 mm Wound Clip Remover | Fine Science Tools | 12033-00 | |
| Reflex 9 mm Wound Clips | Fine Science Tools | 12032-09 | |
| Semken forceps, curved | Fine Science Tools | 11009-13 | |
| Temperature Controller | David Kopf Instruments | PH TCAT-2LV | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | ThermoFisher Scientific | 25200056 | |
| Tuberculin Syringe with 25g needle, slip tip | BD | 309626 | |
| UltraMicroPump 3 with Micro2T Controller | World Precision Instruments | Model UMP3T |
References
- Tamimi, A. F., Juweid, M. Epidemiology and Outcome of Glioblastoma. Glioblastoma. , (2017).
- Robertson, F. L., Marques-Torrejon, M. A., Morrison, G. M., Pollard, S. M. Experimental models and tools to tackle glioblastoma. Disease Models & Mechanisms. 12 (9), (2019).
- Wen, P. Y., Kesari, S.
- Haddad, A. F., et al. Mouse models of glioblastoma for the evaluation of novel therapeutic strategies. Neuro-Oncology Advances. 3 (1), (2021).
- El Meskini, R., et al. A preclinical orthotopic model for glioblastoma recapitulates key features of human tumors and demonstrates sensitivity to a combination of MEK and PI3K pathway inhibitors. Disease Models & Mechanisms. 8 (1), 45-56 (2015).
- Song, Y., et al.
- Cancer Genome Atlas Research Network. Comprehensive genomic characterization defines human glioblastoma genes and core pathways. Nature. 455 (7216), 1061-1068 (2008).
- Motomura, K., et al. Immunohistochemical analysis-based proteomic subclassification of newly diagnosed glioblastomas. Cancer Science. 103 (10), 1871-1879 (2012).
- Choyke, P. L., Dwyer, A. J., Knopp, M. V. Functional tumor imaging with dynamic contrast-enhanced magnetic resonance imaging. Journal of Magnetic Resonance Imaging. 17 (5), 509-520 (2003).
- Raza, S. M., et al. Identification of necrosis-associated genes in glioblastoma by cDNA microarray analysis. Clinical Cancer Research. 10, 212-221 (2004).
- Raza, S. M., et al. Necrosis and glioblastoma: a friend or a foe? A review and a hypothesis. Neurosurgery. 51 (1), 2-12 (2002).
- Hambardzumyan, D., Bergers, G.
- Kijima, N., Kanemura, Y. Glioblastoma. Mouse Models of Glioblastoma. , Exon Publications. (2017).
- Casanova, F., Carney, P. R., Sarntinoranont, M. Effect of needle insertion speed on tissue injury, stress, and backflow distribution for convection-enhanced delivery in the rat brain. PloS One. 9 (4), 94919 (2014).
- Jin, F., Jin-Lee, H. J., Johnson, A. J.
- Zalles, M., Towner, R. A. Pre-Clinical Models and Potential Novel Therapies for Glioblastomas. Gliomas. , Exon Publications. 1-13 (2021).
- Wierzbicki, K., et al. Targeting and therapeutic monitoring of H3K27M-mutant glioma. Current Oncology Reports. 22 (2), 19 (2020).
