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चूहों में आंशिक हेपेटेक्टोमी के बाद हेपेटोसाइट्स को पुनर्जीवित करने का अलगाव

Published: December 2, 2022 doi: 10.3791/64493
Automatic Translation
1, 1
1Swiss HPB Laboratory, Department of Visceral & Transplant Surgery, University Hospital Zurich (USZ)

Summary

लिपिड से भरे हेपेटोसाइट्स यकृत पुनर्जनन में अंतर्निहित होते हैं लेकिन आमतौर पर घनत्व-ढाल सेंट्रीफ्यूजेशन पर खो जाते हैं। यहां, हम एक अनुकूलित सेल अलगाव प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं जो स्टीटोटिक हेपेटोसाइट्स को बरकरार रखता है, जिससे चूहों में आंशिक हेपेटेक्टोमी के बाद हेपेटोसाइट्स को पुनर्जीवित करने की प्रतिनिधि आबादी होती है।

Abstract

चूहों में यकृत पुनर्जनन की जांच के लिए आंशिक हेपेटेक्टोमी का व्यापक रूप से उपयोग किया गया है, लेकिन डाउनस्ट्रीम एकल-कोशिका अनुप्रयोगों के लिए व्यवहार्य हेपेटोसाइट्स की उच्च पैदावार का अलगाव चुनौतीपूर्ण है। चूहों में सामान्य यकृत पुनर्जनन के पहले 2 दिनों के दौरान हेपेटोसाइट्स को पुनर्जीवित करने के भीतर लिपिड का एक चिह्नित संचय देखा जाता है। यह तथाकथित क्षणिक पुनर्जनन से जुड़े स्टीटोसिस (टीआरएएस) अस्थायी है लेकिन आंशिक रूप से प्रमुख प्रोलिफेरेटिव चरण को ओवरलैप करता है। घनत्व-ढाल शुद्धिकरण प्राथमिक हेपेटोसाइट्स के अलगाव के लिए अधिकांश मौजूदा प्रोटोकॉल की रीढ़ है। चूंकि ढाल शुद्धिकरण कोशिकाओं के घनत्व और आकार पर निर्भर करता है, इसलिए यह गैर-स्टीटोटिक को स्टीटोटिक हेपेटोसाइट आबादी से अलग करता है। इसलिए, फैटी हेपेटोसाइट्स अक्सर खो जाते हैं, जिससे गैर-प्रतिनिधि हेपेटोसाइट अंश उत्पन्न होते हैं।

प्रस्तुत प्रोटोकॉल उनकी लिपिड सामग्री की परवाह किए बिना हेपेटोसाइट्स को पुनर्जीवित करने के विवो अलगाव के लिए एक आसान और विश्वसनीय विधि का वर्णन करता है। नर सी 57बीएल /6 चूहों से हेपेटोसाइट्स को क्लासिक दो-चरण कोलेजनेज छिड़काव दृष्टिकोण द्वारा हेपेटेक्टोमी के 24-48 घंटे बाद अलग किया जाता है। एक मानक पेरिस्टालिक पंप पोर्टल नस के माध्यम से बहिर्वाह के साथ प्रतिगामी छिड़काव तकनीक का उपयोग करके कैथेटराइज्ड अवर वेना कावा के माध्यम से गर्म समाधानों को अवशेष में चलाता है। हेपेटोसाइट्स को ग्लिसन कैप्सूल से उनकी रिहाई के लिए कोलेजनेज द्वारा अलग किया जाता है। धोने और सावधानीपूर्वक सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद, हेपेटोसाइट्स का उपयोग किसी भी डाउनस्ट्रीम विश्लेषण के लिए किया जा सकता है। अंत में, यह पेपर चूहों में आंशिक हेपेटेक्टोमी के बाद हेपेटोसाइट्स को पुनर्जीवित करने की प्रतिनिधि आबादी के अलगाव के लिए एक सीधी और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य तकनीक का वर्णन करता है। विधि फैटी यकृत रोग के अध्ययन में भी सहायता कर सकती है।

Introduction

जिगर बड़े ऊतक हानि के बाद भी खुद को पुनर्जीवित कर सकता है। इस अद्वितीय पुनर्योजी क्षमता को आंशिक (70%) हेपेटेक्टॉमी के प्रयोगात्मक मॉडल द्वारा स्पष्ट रूप से चित्रित किया गया है, जिसे पहली बार 1931 में हिगिंस और एंडरसन द्वारा चूहों में वर्णित किया गयाथा। इस मॉडल में, यकृत के 70% को बड़े यकृत लोब को काटकर जानवरों से शल्य चिकित्सा द्वारा हटा दिया जाता है। शेष लोब तब सर्जरी के बाद लगभग 1 सप्ताह के भीतर मूल यकृत द्रव्यमान को बहाल करने के लिए प्रतिपूरक हाइपरट्रॉफी के माध्यम से बढ़ते हैं, हालांकि मूल यकृत वास्तुकला 2,3 की बहाली के बिना। ऊतक हटाने की अलग-अलग मात्रा के साथ अतिरिक्त हेपेटेक्टॉमी विकसित की गई है, जैसे कि 86% -विस्तारित हेपेटेक्टोमी जहां यकृत अवशेष ठीक होने के लिए बहुत छोटा है, अंततः पोस्टहेपेटेक्टोमी यकृत विफलता (पीएचएलएफ) और बाद में 30% -50% जानवरों में मृत्यु हो जाती है। ये मॉडल सामान्य और असफल यकृत पुनर्जनन के अध्ययन को सक्षम करते हैं, जो कि कटे हुए ऊतक की मात्रा पर निर्भर करता है (चित्रा 1)।

यद्यपि हेपेटेक्टॉमी के माउस मॉडल का उपयोग कई वर्षों से सफलतापूर्वक किया गया है, केवल हाल ही में एकल-कोशिका स्तर पर गहरी अंतर्दृष्टि के लिए अधिक उन्नत विश्लेषणात्मक तरीकों की अनुमति दी गई है। इनमें से अधिकांश विधियों के लिए, हालांकि, व्यक्तिगत हेपेटोसाइट्स की उपस्थिति एक बुनियादी शर्त है। प्राथमिक हेपेटोसाइट्स के अलगाव के लिए अधिकांश प्रोटोकॉल मलबे और गैर-पैरेन्काइमल, साथ ही मृत कोशिकाओं 7,8,9 से व्यवहार्य हेपेटोसाइट्स को अलग करने के लिए दो-चरण कोलेजनेज छिड़काव तकनीक और बाद में घनत्व-ढाल शुद्धिकरण पर आधारित हैं। इस विधि को पहली बार बेरी और फ्रेंड द्वारा 196910 में वर्णित किया गया था और 1972 11,12 में सेग्लेन और सहयोगियों द्वारा अनुकूलित किया गया था। हालांकि, चूंकि ढाल सेंट्रीफ्यूजेशन कोशिकाओं के घनत्व और आकार पर निर्भर करता है, लिपिड से भरे हेपेटोसाइट्स अक्सर मानक शुद्धिकरण के दौरान खो जाते हैं। जबकि इस तरह के नुकसान कई शोध प्रश्नों के लिए नगण्य हो सकते हैं, यह प्रारंभिक यकृत पुनर्जनन के लिए एक महत्वपूर्ण पहलू है। पहले 2 दिनों के दौरान, पुन: उत्पन्न माउस यकृत के भीतर हेपेटोसाइट्स लिपिड जमा करते हैं, जिससे आकार में वृद्धि होती है और घनत्व में गिरावट आती है। यह क्षणिक पुनर्जनन से जुड़े स्टीटोसिस (टीआरएएस) पुनर्योजी ईंधन प्रदान करने का कार्य करता है और अस्थायी है, लेकिन आंशिक रूप से प्रमुख प्रोलिफेरेटिव चरण को ओवरलैप करता है और यकृत लोब्यूल्स के भीतर असमान रूप से वितरित होता है - यकृत की कार्यात्मक इकाइयां13,14। विस्तारित 86% -हेपेटेक्टोमी के बाद, हालांकि, टीआरएएस भी होता है लेकिन बना रहता है, क्योंकि पुनर्जनन रुका हुआ है और लिपिड कोऑक्सीकरण नहीं किया जा रहा है। इसलिए, 70% या 86% -हेपेटेक्टॉमी के बाद हेपेटोसाइट्स के ढाल-शुद्धिकरण से गैर-प्रतिनिधि अंश उत्पन्न होंगे, क्योंकि अधिकांश लिपिड-लदे हेपेटोसाइट्स उनके कम घनत्व15 के कारण खो जाते हैं।

इस संशोधित अलगाव प्रोटोकॉल में, सी 57बीएल /6 चूहों से हेपेटोसाइट्स को क्लासिक दो-चरण कोलेजनेज छिड़काव दृष्टिकोण द्वारा हेपेटेक्टोमी के 24-48 घंटे बाद अलग किया जाता है। आमतौर पर, सेल अलगाव के लिए अवशेष का प्रवेशनी और छिड़काव पोर्टल नस के माध्यम से किया जाता है। हालांकि, प्रमुख शोधन के बाद छोड़े गए छोटे अवशेषों में पोर्टोवस्कुलर प्रतिरोध उच्च16 है, और इस प्रकार छिड़काव नाजुक है। क्योंकि वेना कावा हेपेटेक्टॉमी से अप्रभावित रहता है, इसलिए वेना कावा के प्रवेशनी के माध्यम से प्रतिगामी दिशा में छिड़काव आसानी से किया जा सकता है। एक मानक पेरिस्टालिक पंप कैथेटराइज्ड अवर वेना कावा के माध्यम से गर्म समाधानों को यकृत अवशेष में चलाता है, पोर्टल नस (पूरक चित्रा एस 1) के माध्यम से बहिर्वाह के साथ प्रतिगामी छिड़काव का उपयोग करता है। हेपेटोसाइट्स कोलेजनेस द्वारा अलग होते हैं और ग्लिसन के कैप्सूल से जारी किए जाते हैं। कम गति वाले सेंट्रीफ्यूजेशन दृष्टिकोण का उपयोग करके चरणबद्ध अलगाव द्वारा व्यवहार्य हेपेटोसाइट्स को धोने और सावधानीपूर्वक प्रसंस्करण के बाद, हेपेटोसाइट्स का उपयोग किसी भी डाउनस्ट्रीम विश्लेषण के लिए किया जा सकता है।

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Protocol

सभी पशु प्रयोग स्विस संघीय पशु विनियमों के अनुसार थे और ज्यूरिख के पशु चिकित्सा कार्यालय (एन ° 007/2017, 156/2019) द्वारा मानव देखभाल का आश्वासन देते हुए अनुमोदित थे। 10-12 सप्ताह की आयु के नर सी 57बीएल /6 चूहों को भोजन और पानी तक मुफ्त पहुंच के साथ 12 घंटे दिन / रात चक्र पर रखा गया था। प्रत्येक प्रयोगात्मक समूह में छह से आठ जानवर शामिल थे। इस प्रोटोकॉल में उपयोग की जाने वाली सभी सामग्रियों, उपकरणों और अभिकर्मकों से संबंधित विवरण के लिए सामग्री की तालिका देखें।

1. चूहों में आंशिक हेपेटेक्टोमी

  1. मानक हेपेटेक्टोमी (70%) के लिए, बाएं पार्श्व लोब, मध्य लोब के दाहिने हिस्से और माध्य लोब के बाएं हिस्से को अलग और संरक्षित करें (चित्रा 1 बी)। विस्तारित हेपेटेक्टोमी (86%) 4 के लिए, कॉडेट लोब और दाहिने पूर्ववर्ती लोब (चित्रा 1 सी) को भी हटा दें।
  2. नोट: मानक हेपेटेक्टोमी एक प्रक्रिया है जिसका उपयोग कई वर्षों से यकृत पुनर्जनन अनुसंधान में किया गया है। इस प्रक्रिया के लिए प्रोटोकॉल 3,17 उपलब्ध हैं, जिसमें मिशेल और विलेनब्रिंग18 के वीडियो-असिस्टेड प्रोटोकॉल शामिल हैं। हेपेटेक्टॉमी के लिए यहां उपयोग की जाने वाली तकनीकों के लिए अधिक विवरण पूरक फाइल 1 में पाया जा सकता है।

Figure 1
चित्रा 1: चूहों में मानक (70%) और विस्तारित (86%) हेपेटेक्टोमी। (A) पांच माउस लिवर लोब और कुल यकृत वजन में उनके संबंधित योगदान। (बी) चूहों में 70% -हेपेटेक्टोमी का योजनाबद्ध चित्रण। डार्क लोब भविष्य के यकृत अवशेष का प्रतिनिधित्व करते हैं। (सी) चूहों में 86% -हेपेटेक्टोमी का योजनाबद्ध चित्रण। डार्क लोब भविष्य के यकृत अवशेष का प्रतिनिधित्व करते हैं। (डी) 70% और 86% हेपेटेक्टोमी के बाद निकाले गए ऊतक की सटीक मात्रा। (ई) 70% -हेपेटेक्टोमी के तुरंत बाद माउस पेट; (एफ) 86% -हेपेटेक्टोमी के तुरंत बाद माउस पेट (बाएं) और 48 घंटे (दाएं)। स्टीटोटिक अवशेष (सफेद तीर) के हल्के रंग पर ध्यान दें। n = 6-7/समूह। संक्षेप: एसएचएक्स = मानक हेपेटेक्टोमी; ईएचएक्स = विस्तारित हेपेटेक्टोमी; एलडब्ल्यू = यकृत का वजन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

2. छिड़काव समाधान की तैयारी

  1. छिड़काव, पाचन और संरक्षण बफर तैयार करें ( तालिका 1 देखें)।
    1. आवश्यकतानुसार सोडियम हाइड्रॉक्साइड (एनएओएच) या हाइड्रोजन क्लोराइड (एचसीएल) जोड़कर 37 डिग्री सेल्सियस पर सभी बफर समाधानों के पीएच को समायोजित करें। बफर के लिए इष्टतम पीएच 7.4 है।
    2. बर्फ पर संरक्षण बफर और विलियम्स के मीडियम ई रखें।
  2. फ्लो साइटोमेट्री बफर तैयार करें और इसे बर्फ पर स्टोर करें।

तालिका 1: हेपेटोसाइट्स के पाचन और शुद्धिकरण के लिए उपयोग किए जाने वाले समाधान और बफर। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

3. छिड़काव उपकरण की तैयारी

  1. पानी के स्नान को 42 डिग्री सेल्सियस तक गर्म करें और पानी के स्नान में छिड़काव बफर (50 एमएल) और पाचन बफर (10-20 एमएल) रखें। पाचन बफर में कोलेजनेज को अभी तक न जोड़ें।
  2. पेरिस्टालिक पंप तैयार करें और टयूबिंग डालें। पूर्ण छिड़काव सेटअप चित्रा 2 में दिखाया गया है।
    1. एक ल्यूर लॉक कनेक्टर का उपयोग करके ट्यूबिंग के आउटलेट छोर पर 26 जी IV कैनुला कनेक्ट करें। ट्यूब के इनलेट छोर को पानी के स्नान में प्रीवार्ड छिड़काव बफर ट्यूब में डालें। टयूबिंग को 70% इथेनॉल के साथ फ्लश करें, इसके बाद 50 एमएल बाँझ सोडियम क्लोराइड (NaCl 0.9%) है। गर्म छिड़काव बफर (3 एमएल / मिनट की पंप गति) के साथ ट्यूबिंग को प्राइम करें।
  3. आइसोफ्लुरेन इनहेलेशन एनेस्थीसिया (800 एमएल / मिन ओ2, प्रेरण के लिए 3% -5% आइसोफ्लुरेन और प्रक्रिया के दौरान रखरखाव के लिए 2%) का उपयोग करके माउस को सेडेट करें। एक प्रयोगशाला हुड के तहत आइसोफ्लुरेन को संभालें और पर्याप्त वेंटिलेशन प्रदान करें।
  4. 0.1 मिलीग्राम / किग्रा शरीर के वजन की खुराक पर सर्जरी से 30 मिनट पहले ब्यूप्रेनोर्फिन को चमड़े के नीचे प्रशासित करें।
  5. हाइपोथर्मिया को रोकने के लिए, बेहोश माउस को वार्मिंग पैड पर रखें और यकृत को अन्य अंगों से ऊपर उठाने और अवर वेना कावा तक पहुंच की सुविधा के लिए ऊपरी पेट के नीचे एक लुढ़का हुआ कपड़ा ऊतक डालें।
    नोट: ऊतक का उपयोग न करें जो बहुत मोटा है क्योंकि वाहिकाओं की किंकिंग संभव है और छिड़काव प्रभावकारिता प्रभावित होगी।
  6. कॉर्नियल क्षति को रोकने के लिए आंखों का मलहम जोड़ें।
  7. सर्जरी शुरू करने से पहले, सुनिश्चित करें कि जानवर को पेडल विदड्रॉल रिफ्लेक्स (दोनों पिछले पैरों पर फुट पैड पिंच) का परीक्षण करके पर्याप्त रूप से एनेस्थेटाइज्ड किया गया है। प्रतिक्रिया के मामले में, अतिरिक्त संज्ञाहरण की आपूर्ति करें और प्रक्रिया शुरू करने से पहले पुन: परीक्षण करें।
  8. पेट को 70% इथेनॉल से साफ करें।
    1. सीवन को काटकर और घाव के किनारों को धीरे से खींचकर मध्य रेखा चीरा को फिर से खोलें। यदि हेपेटेक्टोमी 24-48 घंटे से अधिक पुरानी है, तो सीवन को हटा दें और कैंची से त्वचा को काट लें।
    2. उरोस्थि के लिए एक 5-0 पॉलीप्रोपाइलीन सीवन को ठीक करें, इसे कपाल से खींचें, और इसे इस स्थिति में ठीक करें। पेट को खुला रखने के लिए एक रिट्रेक्टर या सरल क्लिप का उपयोग करें। पहुंच और विज़ुअलाइज़ेशन को अनुकूलित करने के लिए पेट की गुहा को जितना संभव हो उतना उजागर किया जाना चाहिए।
  9. पोर्टल नस और वेना कावा को प्रकट करने के लिए कपास के स्वैब का उपयोग करके आंतों को दाईं ओर ले जाएं। आंतों को बनाए रखने के लिए गीले कपड़े का उपयोग करें।
  10. माउस के पिछले पैरों (पूरक चित्रा एस 2 ए) के बगल में लगभग 2 सेमी ऊंचाई की एक भारी वस्तु (उदाहरण के लिए, वॉल्यूमेट्रिक फ्लास्क के लिए एक सिलिकॉन-लेपित वजन की अंगूठी) रखें। ट्यूबिंग को ऑब्जेक्ट पर कनेक्टेड 26 जी IV कैनुला के साथ रखें और सुई को वेना कावा के शीर्ष पर सावधानीपूर्वक रखें। टयूबिंग की लंबाई समायोजित करें।
  11. तैयार कोलेजनेज स्टॉक समाधान को पूर्व-पाचन बफर ट्यूब में डालें। 10 एमएल पाचन बफर में स्टॉक समाधान का 250 μL जोड़ें। प्रति पशु 10-20 एमएल पाचन बफर तैयार करें। बड़े जानवरों या पूरे यकृत के छिड़काव के लिए, 30 एमएल तक पाचन बफर तैयार करें।
    नोट: पाचन प्रक्रिया की शुरुआत से लगभग 30 मिनट पहले गर्म पाचन बफर में कोलेजनेज स्टॉक समाधान जोड़ने की सिफारिश की जाती है।
    Figure 2
    चित्रा 2: छिड़काव सेटअप पर अवलोकन। (ए) छिड़काव के लिए आवश्यक उपकरणों के साथ सर्जिकल टेबल। (बी) यकृत की तैयारी के लिए आवश्यक सामग्री, साथ ही हेपेटोसाइट निष्कर्षण और अलगाव। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

4. कैनुलाशन और छिड़काव

  1. पंप की गति को 3 एमएल / मिनट में समायोजित करें और पंप चालू करें। पूर्वप्रमाण छिड़काव बफर को सुई तक पहुंचने दें। छिड़काव बफर के पहले 2-3 एमएल को छोड़ दें।
  2. अवर वेना कावा का प्रवेशन करें।
    1. जबकि बफर सुई के माध्यम से चल रहा है, गुर्दे के नीचे वेना कावा में उथले कोण पर 26 जी IV प्रवेशनी डालें। सुनिश्चित करें कि सुई ऊपर की ओर इशारा करती है।
    2. पंचर साइट के नीचे वेना कावा को धीरे-धीरे खींचने के लिए एक कपास के फाहे का उपयोग करें ताकि प्रदान किया गया तनाव नस में प्रवेशनी के सम्मिलन की सुविधा प्रदान करे। जब सुई लुमेन में प्रवेश करती है तो कैथेटर के फ्लैश चैंबर में रक्त की तलाश करें।
    3. सुई को अतिरिक्त 2-3 मिमी आगे बढ़ाएं ताकि यह सुनिश्चित हो सके कि प्लास्टिक कैथेटर की नोक भी नस में प्रवेश कर गई है।
    4. प्लास्टिक कैथेटर को सुई के ऊपर और वेना कावा में 5 मिमी और स्लाइड करें। सुई को धीरे-धीरे और बहुत सावधानी से निकालें।
      नोट: कैनुला को लिगेचर के साथ ठीक करने की सिफारिश नहीं की जाती है। यह कदम समय लेने वाला है क्योंकि इस उद्देश्य के लिए जहाज को पहले विच्छेदित किया जाना चाहिए। यदि कैनुला शिथिल रूप से तैनात है और किसी वस्तु के साथ समर्थित है, तो कोई और निर्धारण आवश्यक नहीं है ( पूरक चित्रा एस 2 में छिड़काव सेटअप देखें)। कैनुलाशन साइट को स्थिर करने और बैकफ्लो को रोकने के लिए, कैनुलाशन साइट पर मोनोमेरिक एन-ब्यूटाइल-साइनोएक्रिलेट की एक बूंद जोड़ी जा सकती है।
  3. जब रक्त कैनुला से बाहर निकलता है, तो इसे सिरिंज का उपयोग करके गर्म छिड़काव बफर से भरें।
  4. ट्यूब को कैनुला से फिर से जोड़ें, अभी भी 3 एमएल / मिनट की पंप गति से चल रहा है। छिड़काव बफर को यकृत में प्रवेश करने दें।
  5. 2-3 सेकंड के बाद, यकृत में बनने वाले सफेद धब्बे और / या पोर्टल नस के विस्तार / सूजन की तलाश करें, जो इंगित करते हैं कि छिड़काव बफर यकृत के माध्यम से बह रहा है और केंद्रीय नस से यकृत लोब्यूल्स में प्रवेश कर रहा है (चित्रा 3)।
  6. जिगर की सतह पर सफेद धब्बे दिखाई देने के बाद पोर्टल नस के 1-2 सेकंड के भीतर स्पष्ट रूप से सूज जाने की प्रतीक्षा करें। लिवर हिलस से जितना संभव हो सके कैंची से पोर्टल नस काटें। काटने की साइट को लेबल करने के लिए एक माइक्रो वेसल क्लिप का उपयोग करें (चित्र 3 बी)।
    नोट: यह छिड़काव प्रक्रिया के दौरान यकृत के माध्यम से प्रवाह के आकलन को सरल बनाता है। जिगर तुरंत रक्त को साफ करता है और कुछ सेकंड के भीतर पीला-सफेद हो जाता है (चित्रा 3 सी)। पेट के उद्घाटन के दाईं ओर त्वचा के माध्यम से एक अतिरिक्त कटौती रक्त के बहिर्वाह के साथ-साथ छिड़काव समाधान (चित्रा 3 बी और पूरक चित्रा एस 2 बी, सी) की सुविधा प्रदान करती है।
  7. पशु के वजन, यकृत के आकार और पूर्व हेपेटेक्टोमी की सीमा के आधार पर प्रवाह को 4-7 एमएल / मिनट तक बढ़ाएं।
  8. पोर्टल नस को चिमटी या संवहनी क्लैंप के साथ 7-10 सेकंड के लिए दबाएं। सुनिश्चित करें कि कोई तरल पदार्थ नहीं गुजर रहा है।
    नोट: क्लैंपिंग के दौरान यकृत स्पष्ट रूप से सूज जाता है और रिलीज होने पर आराम करता है। यह पूरे जिगर को फ्लश करने और इसे किसी भी शेष रक्त से साफ करने के लिए महत्वपूर्ण है।
  9. लगभग 30 सेकंड के बाद दूसरा क्लैंप करें और सुनिश्चित करें कि यकृत सूज जाए और आराम करे। जानवर को तब तक फ्लश करना जारी रखें जब तक कि पोर्टल नस से बहने वाला बफर स्पष्ट न हो जाए, लेकिन कम से कम 3-4 मिनट के लिए।
    नोट: पंप की गति ट्यूब के साथ-साथ यकृत के आकार पर निर्भर करती है। इसका व्यक्तिगत रूप से मूल्यांकन किया जाना चाहिए।
  10. प्रक्रिया के इस बिंदु पर, इच्छामृत्यु को एक्ससेंग्यूनेशन के लिए द्वितीयक होना चाहिए था। पुष्टि करें कि प्रणालीगत परिसंचरण बंद हो गया है (कोई दिल की धड़कन या दिल की झिलमिलाहट नहीं)। मृत्यु सुनिश्चित करने के लिए, इच्छामृत्यु की द्वितीयक शारीरिक विधि के रूप में प्रक्रिया के इस चरण में द्विपक्षीय न्यूमोथोरैक्स किया जाता है।
    नोट: यदि प्रणालीगत परिसंचरण बंद हो गया है (कोई दिल की धड़कन या दिल की झिलमिलाहट नहीं) तो पंप की गति को थोड़ा कम करें।

Figure 3
चित्र 3: प्रवेशनी से पाचन तक छिड़काव प्रक्रिया। (A) अवर वेना कावा (सफेद तीर) और पोर्टल नस (पीला तीर) के साथ माउस यकृत की शारीरिक रचना। (बी) अवर वेना कावा का प्रवेशन। कैनुला को एक लिगेचर (सफेद तीर) के साथ सुरक्षित किया जाता है, और खोले गए पोर्टल नस के माध्यम से बहिर्वाह का स्थान एक माइक्रो पोत क्लैंप के साथ चिह्नित (क्लैंप नहीं) होता है। (सी) छिड़काव बफर द्वारा यकृत को सभी शेष रक्त (सफेद तीर) से साफ करने से पहले पैची संरचनाओं की उपस्थिति पर ध्यान दें। त्वचा को इंजेक्शन (पीला तीर) किया जाता है और रक्त और छिड़काव तरल पदार्थ की निकासी सुनिश्चित करने के लिए एक कपास का फाहा रखा जाता है। आंतरायिक क्लैंपिंग एक संवहनी क्लैंप या चिमटी के साथ किया जा सकता है। (डी) जिगर को सभी रक्त (*) से साफ किया जाना चाहिए। कोलेजनेज युक्त पाचन बफर के यकृत में प्रवेश करने के बाद, यह क्लैंपिंग के बाद आराम नहीं करेगा और यकृत लोब आकार में बढ़ जाएगा। (ई) थोड़ी देर बाद, यकृत की सतह पर एक चुलबुली उपस्थिति देखी जा सकती है (*)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

5. पाचन

  1. छिड़काव पंप को रोकें और छिड़काव बफर से इनलेट टयूबिंग को जल्दी से पूर्ववाधित पाचन बफर में स्थानांतरित करें। पंप को पुनरारंभ करें।
  2. इससे पहले कि पाचन बफर यकृत तक पहुंचे, पोर्टल नस को 3-4 सेकंड के लिए एक और बार दबाएं। सुनिश्चित करें कि क्लैंप की रिहाई पर यकृत आराम करता है और छिड़काव तरल पदार्थ स्पष्ट रहता है।
    नोट: पाचन बफर में फिनोल लाल होता है और यह स्पष्ट छिड़काव बफर से आसानी से अलग होता है। यह ट्यूब के भीतर आसान ट्रैकिंग के लिए अनुमति देता है।
  3. जैसे ही पाचन बफर यकृत तक पहुंच गया है, पोर्टल नस को एक बार फिर माइक्रो वेसल क्लिप के साथ दबाएं।
    नोट: क्लैंपिंग करते समय, यकृत सूज जाता है लेकिन क्लैंप की रिहाई पर आराम नहीं करता है। यह सामान्य है।
  4. पाचन प्रक्रिया को सुविधाजनक बनाने के लिए, डायाफ्राम के नीचे सीधे संवहनी क्लैंप के साथ बेहतर वेना कावा को बंद करें ताकि पाचन बफर को अवर वेना कावा से यकृत तक खोलने वाली पोर्टल नस के माध्यम से बहिर्वाह तक जाने की अनुमति मिल सके।
    नोट: यह क्लैंपिंग सुनिश्चित करता है कि प्रणालीगत परिसंचरण को दरकिनार कर दिया जाता है और अवशिष्ट रक्त घटकों / अवरोधकों के साथ अनावश्यक संपर्क को रोका जाता है। यह कदम वैकल्पिक है, क्योंकि शाम सर्जरी के बाद बढ़े हुए यकृत ऊतक के पीछे बेहतर वेना कावा तक पहुंचना मुश्किल है, लेकिन हेपेटेक्टोमाइज्ड चूहों में पहुंच बहुत आसान है।
  5. 5 एमएल / मिनट की प्रवाह दर पर लगभग 4 मिनट के लिए पचाएं। जैसे-जैसे पाचन बढ़ता है, यकृत की सतह पर सूजन और छोटे स्पष्ट / पारदर्शी खंडों के संकेतों की तलाश करें। इसके अलावा, ध्यान दें कि यकृत कपड़े के गीले टुकड़े की बनावट लेता है और लगभग चिपचिपा दिखाई देता है (चित्रा 3 ई)। नम कपास के फाहे से सावधानीपूर्वक स्पर्श करके स्थिरता की जांच करें।
  6. छिड़काव के साथ जारी रखें जब तक कि यकृत की सतह बनावट में एक उल्लेखनीय अंतर नहीं देखा जा सकता है। ध्यान दें कि यकृत एक बहुत ही हल्का रंग और एक चुलबुली उपस्थिति मानता है (चित्रा 3 ई), और ग्लिसन कैप्सूल (यानी, यकृत की बोरी) पैरेन्काइमा से अलग हो जाती है। जैसे ही यकृत ने इन गुणों को प्राप्त किया है, पाचन प्रक्रिया को रोक दें, क्योंकि अति-पाचन हेपेटोसाइट्स को नुकसान पहुंचा सकता है। हवा के लीवर में जाने से पहले सुई को हटा दें।
    नोट: आमतौर पर पर्याप्त पाचन तक पहुंचने के लिए 10-20 एमएल पाचन बफर की आवश्यकता होती है। यह जानवर के आकार, हेपेटेक्टोमी की सीमा, ट्यूबिंग सेटअप और कोलेजनेज समाधान की गुणवत्ता पर निर्भर करता है। यदि आवश्यक हो, तो छिड़काव गति के बजाय छिड़काव समय बढ़ाएं। संवहनी प्रणाली में बहुत अधिक दबाव यकृत को फटने का कारण बन सकता है और छिड़काव / पाचन द्रव रेट्रोपरिटोनियल स्पेस में खो सकता है।

6. जिगर की तैयारी

  1. यकृत को पेट की गुहा से धीरे से हटा दें। बहुत सावधान रहें क्योंकि यह अब बहुत कमजोर और नाजुक है।
  2. बल का उपयोग करके लोब के बीच केंद्रीय संयोजी ऊतक को पकड़ें और इसे लंगर बिंदु के रूप में उपयोग करते हुए थोड़ा ऊपर उठाएं।
  3. जिगर के सभी कनेक्शन को अन्य अंगों से काट लें, पित्ताशय को हटा दें, और यकृत को बर्फ-ठंडा संरक्षण बफर में रखें।
    नोट: आदर्श रूप से, हेपेटोसाइट्स निष्कर्षण और आगे की प्रक्रिया हेपेटोसाइट्स की व्यवहार्यता को बनाए रखने के लिए तुरंत होनी चाहिए। हालांकि, यदि आवश्यक हो, तो यकृत को 4 डिग्री सेल्सियस (जैसे, परिवहन के लिए) पर थोड़े समय के लिए संग्रहीत किया जा सकता है। यह देरी 30-40 मिनट से अधिक नहीं होनी चाहिए।

7. हेपेटोसाइट निष्कर्षण

  1. जिगर को 10 सेमी पेट्री डिश में स्थानांतरित करें और 10 एमएल बर्फ-ठंडा विलियम्स 'मीडियम ई जोड़ें।
  2. यकृत की सतह के साथ कुछ स्थानों पर बारीक-टिप चिमटी के साथ ग्लिसन के कैप्सूल को तोड़ना। दो जोड़ी चिमटी के साथ एक केंद्रीय भाग (जैसे, यकृत हिलस में संयोजी ऊतक) को पकड़ें और धीरे-धीरे उन्हें अलग करें, जिससे कैप्सूल हेपेटोसाइट्स को नुकसान पहुंचाए बिना फट जाए। कैप्सूल को धीरे से हिलाकर कोशिकाओं को छोड़ दें (पूरक चित्रा एस 3)।
    नोट: आदर्श रूप से, यकृत आसानी से अलग हो जाता है और कोशिकाओं को छोड़ देता है। बल लागू न करें। एक सेल स्क्रैपर सभी कोशिकाओं को पूरी तरह से हटाने और सेल उपज बढ़ाने में मदद कर सकता है। कैंची से लीवर को टुकड़ों में न काटें।
  3. 50 एमएल ट्यूब में 100 μm सेल स्ट्रेनर के माध्यम से 5 एमएल लिवर पल्प को फ़िल्टर करें। 10 मिलीलीटर ताजा बर्फ-ठंडे माध्यम के साथ फ़िल्टर को कुल्ला करें। सेल छन्नी के माध्यम से शेष 5 एमएल लुगदी को छान लें।
    नोट: यकृत के गूदे को विघटित हेपेटोसाइट्स (चित्रा 4 ए) के साथ स्थानांतरित करने के लिए 25 एमएल सीरोलॉजिकल पिपेट का उपयोग करें। छोटे उद्घाटन वाले छोटे पिपेट कतरनी तनाव को बढ़ाते हैं और अपरिवर्तनीय रूप से हेपेटोसाइट्स को नुकसान पहुंचाते हैं।
  4. पेट्री डिश को कुल्ला करने के लिए कुल 30 एमएल ठंडा माध्यम जोड़ें, इसे फ़िल्टर करें, और 50 एमएल ट्यूब में निलंबन जोड़ें जब तक कि यह पूरा न हो जाए। सभी पृथक कोशिकाएं अब निलंबन में हैं (चित्रा 4 बी)।

Figure 4
चित्र 4: कोमल सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा शुद्धिकरण। (A) निष्कर्षण चरण के बाद लिवर होमोजेनेट छोड़ दिया गया। (बी) होमोजेनेट का सूक्ष्म दृश्य (20x आवर्धन); मलबे के साथ चिह्नित संदूषण पर ध्यान दें। (ग) शुद्धिकरण सेंट्रीफ्यूजेशन चरण और (घ) सतह पर तैरने वाले कणों के सूक्ष्म दृश्यों को त्याग दिया जाना। (ई) शुद्ध हेपेटोसाइट अंश का सूक्ष्म दृश्य। स्केल पट्टियाँ = 100 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

8. हेपेटोसाइट अलगाव

  1. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 50 × ग्राम पर स्पिन करें (सबसे कम त्वरण और सबसे कम ब्रेक संभव)।
    नोट: हेपेटोसाइट्स गैर-पैरेन्काइमल यकृत कोशिकाओं की तुलना में सघन होते हैं। कम सेंट्रीफ्यूजेशन बल के कारण, केवल हेपेटोसाइट्स को गोली मार दी जाती है, जबकि अन्य कोशिकाएं (जैसे, प्रतिरक्षा कोशिकाएं, एरिथ्रोसाइट्स और साइनसॉइडल कोशिकाएं) सतह पर तैरने वाले में रहती हैं।
  2. अधिकांश सतह पर तैरने वाले को एस्पिरेटेड करें, ट्यूब को धीरे से घुमाकर कोशिकाओं को फिर से निलंबित करने के लिए 1 एमएल छोड़ दें।
  3. ठंडे विलियम्स के ई माध्यम के 40 एमएल जोड़ें और मृत हेपेटोसाइट्स और सेल मलबे और पेलेट व्यवहार्य और फैटी हेपेटोसाइट्स को हटाने के लिए 10 मिनट के लिए 50 × ग्राम पर फिर से स्पिन करें (चित्रा 4 सी)।
  4. अधिकांश सतह पर तैरने वाले को त्याग दें, ट्यूब को घुमाकर कोशिकाओं को फिर से निलंबित करने के लिए 1 एमएल छोड़ दें।
  5. 40 मिलीलीटर ठंडा विलियम्स ई माध्यम जोड़ें और 4 डिग्री सेल्सियस (कम त्वरण, कम ब्रेक) पर 5 मिनट के लिए 50 × ग्राम पर फिर से स्पिन करें।
  6. अधिकांश सतह पर तैरने वाले को एस्पिरेटेड करें, ट्यूब को धीरे से घुमाकर कोशिकाओं को फिर से निलंबित करने के लिए 1 एमएल छोड़ दें।
    नोट: इस प्रक्रिया को तब तक न रोकें जब तक कि कोशिकाओं को ठीक या विश्लेषण न किया जाए। हेपेटोसाइट्स बहुत नाजुक होते हैं और छिड़काव, पाचन और शुद्धिकरण प्रक्रिया में कोई भी देरी कोशिकाओं को नुकसान पहुंचा सकती है।
  7. न्यूबाउर-बेहतर गिनती कक्ष का उपयोग करके ट्रिपैन ब्लू को जोड़ने के बाद अंतिम सेल एकाग्रता निर्धारित करें।
    नोट: अधिकांश मलबे और गैर-पैरेन्काइमल कोशिकाओं को अब हटा दिया गया है, जिसके परिणामस्वरूप 70% -हेपेटेक्टोमी के बाद लगभग 10-15 × 106 हेपेटोसाइट्स की एक साफ गोली बची है।
  8. वांछित एकाग्रता के आधार पर, अधिक बर्फ-ठंडा माध्यम जोड़ें। किसी भी डाउनस्ट्रीम विश्लेषण के लिए हेपेटोसाइट सेल निलंबन का उपयोग करें या प्राथमिक सेल संस्कृति शुरू करें।
    नोट: इस स्तर पर, निलंबन में केवल कुछ प्रतिरक्षा और गैर-पैरेन्काइमल कोशिकाएं (<5%) रहती हैं। यदि आगे शुद्धिकरण वांछित है, तो चुंबकीय- या प्रतिदीप्ति-सक्रिय सेल सॉर्टिंग (एमएसीएस / एफएसीएस) द्वारा सीडी 31 + और सीडी 45 + कोशिकाओं का नकारात्मक चयन करें। आज तक, यकृत पैरेन्काइमल कोशिकाओं के लिए कोई विश्वसनीय और मजबूत सतह मार्कर नहीं है।

9. फ्लो साइटोमेट्री के लिए पृथक हेपेटोसाइट्स की तैयारी

  1. हेपेटोसाइट्स को 5 मिनट के लिए 100 × ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज करें।
  2. सुपरनैटेंट को छोड़ दें और सेल निलंबन की एकाग्रता के आधार पर फ्लो साइटोमेट्री बफर की वांछित मात्रा जोड़ें।
  3. फ्लो साइटोमेट्री ट्यूब में 1 एमएल सेल सस्पेंशन जोड़ें। सेंट्रीफ्यूज 5 मिनट के लिए 100 × ग्राम पर और सतह पर तैरने वाले को त्याग दें।
  4. कोशिकाओं में पतला एलेक्सा फ्लूर 488 ज़ोंबी ग्रीन वायबिलिटी डाई (एकाग्रता 1: 400) के 100-200 μL जोड़ें और उन्हें धीरे से हिलाएं। मैन्युअल झटकों द्वारा या 2 सेकंड के लिए कम गति (अधिकतम 2-3) पर भंवर मिक्सर का उपयोग करके हेपेटोसाइट्स को सावधानीपूर्वक पुन: निलंबित करें।
    नोट: कोशिकाओं को पुन: निलंबित करने के लिए छोटे पिपेट युक्तियों का उपयोग न करें। वे बहुत नाजुक हैं और लागू कतरनी तनाव क्षति का कारण बनता है और सेल व्यवहार्यता को कम करता है। यदि पिपेटिंग से बचा नहीं जा सकता है, तो व्यास को बढ़ाने के लिए सिरे से सबसे छोटे हिस्से को काटने के बाद 1,000 μL पिपेट का उपयोग करें और कोशिकाओं को बहुत धीरे-धीरे पिपेट करें।
  5. ट्यूबों को बर्फ पर रखें या वांछित धुंधलापन के आधार पर उन्हें कमरे के तापमान पर स्टोर करें। अंधेरे में 20-30 मिनट के लिए कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें।
  6. फ्लो साइटोमेट्री बफर के 2 एमएल जोड़ें और कोशिकाओं को 3x धोएं। प्रत्येक धोने के चरण के बाद कोशिकाओं को 5 मिनट के लिए 100 × ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज करें।
  7. निर्धारण बफर के 2 एमएल जोड़ें (1: 1 4% पीएफए और पीबीएस)। मैन्युअल झटकों द्वारा या 2 सेकंड के लिए कम गति (अधिकतम 2-3) पर भंवर मिक्सर का उपयोग करके हेपेटोसाइट्स को सावधानीपूर्वक पुन: निलंबित करें।
  8. कोशिकाओं को 30 मिनट के लिए ठीक करें।
  9. 100 × ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज अगले 5 मिनट के लिए, सतह पर तैरने वाला छोड़ दें, और फ्लो साइटोमेट्री बफर जोड़ें।
    नोट: अलगाव के बाद 72 घंटे तक विश्लेषण से पहले कोशिकाओं को प्रवाह साइटोमेट्री बफर में संग्रहीत किया जा सकता है।

10. फ्लो साइटोमेट्री के साथ हेपेटोसाइट्स का विश्लेषण

  1. प्रतिदीप्ति-सक्रिय सेल सॉर्टर का उपयोग करके हेपेटोसाइट्स का विश्लेषण करें।
    नोट: हेपेटोसाइट्स के अपेक्षाकृत बड़े आकार पर विचार करें और वोल्टेज को समायोजित करें। कम वोल्टेज से शुरू करें और फॉरवर्ड स्कैटर (एफएससी) के लिए 350 वी और साइड स्कैटर (एसएससी) के लिए 220 वी से अधिक न जाएं।
    1. कोशिकाओं के अनुमानित बड़े आकार में एफएससी और एसएससी के लिए वोल्टेज समायोजित करें। हेपेटोसाइट आबादी की पहचान करें और एसएससी-ए और एफएससी-ए (चित्रा 5 ए) का उपयोग करके सभी घटनाओं को रिकॉर्ड करें।
    2. ध्यान दें कि मलबे और गैर-पैरेन्काइमल कोशिकाओं को एफएससी बनाम एसएससी घनत्व प्लॉट के निचले बाएं कोने में प्रदर्शित किया जाता है और बाहर रखा जाता है (चित्रा 5 ए)।
    3. चूंकि डबल कोशिकाएं विश्लेषण को प्रभावित कर सकती हैं, इसलिए डबल्स को बाहर करने के लिए साइड स्कैटर ऊंचाई (एसएससी-एच) बनाम साइड स्कैटर एरिया (एसएससी-ए) घनत्व प्लॉट का निर्माण करें, जैसा कि चित्रा 5 बी में दिखाया गया है।
    4. सीडी 31- (एंडोथेलियल मार्कर) और सीडी 45- (प्रतिरक्षा मार्कर) कोशिकाओं (चित्रा 5 सी) को गेट करके अंतिम हेपेटोसाइट आबादी का चयन करें।

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Representative Results

टीआरएएस हेपेटेक्टॉमी के बाद 16 घंटे पर चरम पर पहुंचता है और धीरे-धीरे मानक हेपेटेक्टोमी के बाद 32-48 घंटे तक गायब हो जाता है, लेकिन विस्तारित हेपेटेक्टोमी के बाद 48 घंटे से अधिक समय तक बना रहता है। मैक्रोस्कोपिक रूप से, टीआरएएस यकृत अवशेष (चित्रा 1 एफ) के पीले रंग के रूप में आसानी से दिखाई देता है और सर्जरी के बाद 16 घंटे और 48 घंटे के बीच हेपेटेक्टोमाइज्ड चूहों में देखा जा सकता है।

अनुमानित अंतिम उपज 70% हेपेटेक्टोमी के बाद 10-15 × 106 हेपेटोसाइट्स और चूहों में विस्तारित86% हेपेटेक्टोमी के बाद 4-9 × 10 6 है, जिसमें क्रमशः 78% और 65% की औसत अंतिम व्यवहार्यता है। यह पूरे माउस यकृत (चित्रा 6 ए, सी) से 50-70 × 106 की कुल उपज की तुलना में अपेक्षित प्रतिशत से मेल खाती है। आंशिक हेपेटेक्टॉमी के बाद, हेपेटोसाइट्स सामान्य यकृत की तुलना में एक बढ़ी हुई कोशिका आकार दिखाते हैं, जो उनकी बढ़ी हुई लिपिड-सामग्री (चित्रा 6 बी) के अनुरूप है। गेटिंग रणनीति पूरक चित्र एस 4 में दिखाया गया है।

Figure 6
चित्र 6: हेपेटोसाइट उपज, कोशिका का आकार और व्यवहार्यता। (ए) एक पूरे माउस यकृत की कोशिका गणना और 24 घंटे के बाद 70% और 86% हेपेटेक्टोमी के अवशेष। (बी) पृथक हेपेटोसाइट्स की कोशिका मात्रा की गणना। 70% और 86% दोनों के लिए हेपेटेक्टोमी के बाद सेल आकार में 24 घंटे की उल्लेखनीय वृद्धि पर ध्यान दें। (सी) शुद्धिकरण प्रक्रिया के प्रत्येक चरण के बाद पृथक हेपेटोसाइट्स की सेल व्यवहार्यता। व्यवहार्यता को एलेक्सा फ्लूर 488 ज़ोंबी ग्रीन वायबिलिटी डाई का उपयोग करके फ्लो साइटोमेट्री द्वारा मापा गया था। प्रतिशत सभी हेपेटोसाइट सिंगल्स से लिए जाते हैं। गेटिंग रणनीति के लिए, पूरक चित्रा एस 6 और पूरक चित्रा एस 4 देखें। त्रुटि पट्टियाँ n = 6-8/समूह के साथ मानक विचलन को संदर्भित करती हैं। संक्षेप: एसएचएक्स = मानक हेपेटेक्टोमी; ईएचएक्स = विस्तारित हेपेटेक्टोमी; डब्ल्यू /ओ रिसेक्शन = शाम सर्जरी। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

आंशिक हेपेटेक्टोमी के 24 घंटे बाद मुराइन हेपेटोसाइट्स में एक बढ़ी हुई लिपिड सामग्री को ग्रैन्यूलैरिटी में वृद्धि द्वारा देखा जा सकता है (चित्रा 7; गेटिंग रणनीति के लिए, पूरक चित्रा एस 5 देखें) या सीधे बढ़े हुए हेपेटोसाइट्स के अंदर लिपिड पुटिकाओं की उपस्थिति से देखा जा सकता है (चित्रा 8 और पूरक फ़ाइल 1)।

Figure 7
चित्र 7: प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा मापी गई ग्रैन्यूलैरिटी और सेल आकार में वृद्धि। (ए) लिपिड पुटिकाओं की उपस्थिति के लिए अप्रत्यक्ष मार्कर के रूप में हेपेटेक्टोमी के 24 घंटे बाद पृथक हेपेटोसाइट्स के बीच बढ़ी हुई ग्रैन्यूलैरिटी। (बी) एसएससी को दर्शाने वाला हिस्टोग्राम। (सी) प्रतिशत एसएससी सिग्नल द्वारा मापा गया उच्च साइटोप्लाज्मिक दानेदार तीव्रता वाली कोशिकाओं के अंश का प्रतिनिधित्व करते हैं। त्रुटि पट्टियाँ n = 6-8/समूह के साथ मानक विचलन को संदर्भित करती हैं। संक्षेप: एसएचएक्स = मानक हेपेटेक्टोमी; ईएचएक्स = विस्तारित हेपेटेक्टोमी; डब्ल्यू /ओ रिसेक्शन = शाम सर्जरी; एफएससी = फॉरवर्ड स्कैटर सिग्नल; एसएससी = साइड स्कैटर। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 8
चित्र 8: सूडान IV अलग-थलग ताजा हेपेटोसाइट्स की वसा सामग्री के मार्कर के रूप में धुंधला होना। (A) पूर्व सर्जरी के बिना एक ताजा पूरे माउस यकृत से हेपेटोसाइट्स। हेपेटोसाइट्स 24 एच (बी) के बढ़े हुए आकार और वसा सामग्री 70% -हेपेटेक्टोमी और (सी) 86% -हेपेटेक्टोमी के बाद। बड़े, स्टीटोटिक हेपेटोसाइट्स और छोटे, गैर-स्टीटोटिक हेपेटोसाइट्स दोनों की सहवर्ती उपस्थिति पर ध्यान दें। स्केल सलाखों = 30 μm (B-D)। त्रुटि पट्टियाँ n = 6-8/समूह के साथ मानक विचलन को संदर्भित करती हैं। संक्षेप: एसएचएक्स = मानक हेपेटेक्टोमी; ईएचएक्स = विस्तारित हेपेटेक्टोमी; डब्ल्यू /ओ रिसेक्शन = शाम सर्जरी। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

प्रतिरक्षा और गैर-पैरेन्काइमल कोशिकाओं का बहुत कम प्रतिशत अंतिम निलंबन में रहता है। यदि वांछित हो, तो एफएसीएस या एमएसीएस द्वारा आगे शुद्धिकरण प्राप्त किया जाता है। फ्लो साइटोमेट्री द्वारा सीडी 31 + और सीडी 45 + कोशिकाओं के नकारात्मक चयन का उपयोग गैर-पैरेन्काइमल कोशिकाओं को प्रदर्शित करने और मात्रा निर्धारित करने के लिए किया जाता है (चित्रा 5)।

Figure 5
चित्र 5: फ्लो साइटोमेट्री गेटिंग रणनीति और सीडी 31- और सीडी 45- पैरेन्काइमल कोशिकाओं का चयन। हेपेटोसाइट्स के अपेक्षाकृत बड़े आकार पर विचार करें और समायोजित वोल्टेज का उपयोग करें। एफएससी के लिए 350 वी और एसएससी के लिए 220 वी से अधिक न जाएं। (बी) सिंगलेट गेटिंग। (सी) हेपेटोसाइट्स को सीडी 31- (एंडोथेलियल मार्कर) और सीडी 45- (प्रतिरक्षा मार्कर) कोशिकाओं को गेट करके चुना जाता है। यदि आवश्यक हो, तो आगे के डाउनस्ट्रीम विश्लेषण के लिए पैरेन्काइमल कोशिकाओं का चयन करने के लिए यह चयन प्रतिदीप्ति-सक्रिय सेल सॉर्टर में किया जा सकता है; n = 4-5/समूह। संक्षेप: एफएससी = आगे बिखराव; एसएससी = साइड स्कैटर। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

स्टेटोटिक कोशिकाओं को बनाए रखने में संशोधित प्रोटोकॉल की प्रभावकारिता का प्रदर्शन करने के लिए, हेपेटोसाइट्स को क्लासिक घनत्व-ढाल दृष्टिकोण7 (चित्रा 9 ए) का उपयोग करके अलग किया गया था। संशोधित प्रक्रिया (चित्रा 9 बी) के विपरीत, घनत्व ढाल के शीर्ष पर एक फैटी सेल परत स्पष्ट रूप से दिखाई दे रही थी। कोशिकाओं के विश्लेषण ने घनत्व-ढाल सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद गोली में लिपिड से भरे हेपेटोसाइट्स की सकल अनुपस्थिति की पुष्टि की। इसके विपरीत, फैटी परत से कोशिकाओं को स्टीटोटिक हेपेटोसाइट्स और गैर-पैरेन्काइमल और मृत कोशिकाओं के पर्याप्त अंश से समृद्ध किया गया था (चित्रा 9 ए)। इस प्रकार, क्लासिक अलगाव स्टीटोटिक कोशिकाओं की फसल से वंचित करता है, जबकि घनत्व ढाल को छोड़ने वाला यह संशोधित प्रोटोकॉल लिपिड से लदी उप-आबादी को बरकरार रखता है, जिससे दुबला हेपेटोसाइट्स की ओर झुकाव के बिना यकृत पुनर्जनन की निष्पक्ष खोज को सक्षम किया जा सकता है।

Figure 9
चित्र 9: बेहतर प्रोटोकॉल की तुलना में क्लासिक घनत्व-ढाल अलगाव प्रोटोकॉल का पालन करते हुए स्टीटोटिक हेपेटोसाइट्स की पैदावार। (A) क्लासिक घनत्व-ढाल शुद्धिकरण विधि (फॉस्फेट-बफर ्ड खारा में 90% घनत्व-ढाल समाधान की अंतिम एकाग्रता) के साथ, मृत हेपेटोसाइट्स घनत्व-ढाल समाधान के शीर्ष पर एक सेल परत में एकत्र किए जाते हैं। (बी) इस परत में न केवल गैर-पैरेन्काइमल कोशिकाएं और गैर-व्यवहार्य हेपेटोसाइट्स शामिल हैं, बल्कि व्यवहार्य, बड़े, फैटी हेपेटोसाइट्स भी शामिल हैं। (ग) घनत्व-प्रवणता सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद प्राप्त गोली में छोटे आकार के दुबला हेपेटोसाइट्स होते हैं और ज्यादातर स्टीटोटिक कोशिकाओं से रहित होते हैं। यह "शुद्ध" अंश है जिसे क्लासिक प्रोटोकॉल के साथ अलग किया जाता है। (डी) बेहतर प्रोटोकॉल के साथ, लिपिड से भरे हेपेटोसाइट्स खो नहीं जाते हैं और सभी हेपेटोसाइट्स को गोली मार दी जाती है। सुपरनैटेंट (ई) में ज्यादातर मृत और खंडित हेपेटोसाइट्स और गैर-पैरेन्काइमल कोशिकाएं होती हैं, जबकि गोली (एफ) परिवर्तनीय आकार और लिपिड-सामग्री के हेपेटोसाइट्स का मिश्रण होता है। स्केल पट्टियाँ = 100 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

अनुपूरक फाइल 1: पूरक प्रोटोकॉल। (ए) सूडान IV के साथ लिपिड धुंधला होना; (बी) चूहों में मानक और विस्तारित हेपेटेक्टोमी। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक चित्रा एस 1: छिड़काव सेटअप पर अवलोकन। (1) अवर वेना कावा को नष्ट कर दें। (2) कैल्शियम को चिकना करने के लिए गर्म छिड़काव बफर के साथ यकृत को संक्रमित करें। (3) विवो में कोशिकाओं को अलग करने के लिए कोलेजनेस और सीए2 + के साथ पाचन बफर को गर्म करें। जिगर को हटा दें और (4) बर्फ-ठंडे संरक्षण बफर (अधिकतम 30 मिनट) में स्टोर करें। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक चित्रा एस 2: छिड़काव सेटअप। (ए) एक आइसोफ्लुरेन नोजल, लाल प्रकाश हीटिंग लैंप और छिड़काव ट्यूब के साथ छिड़काव तालिका। इसे स्थिर करने और विस्थापन के जोखिम को कम करने के लिए ट्यूब के नीचे एक भारी वस्तु रखी जा सकती है। (बी) छिड़काव के पहले कुछ मिनटों के दौरान, कुछ रक्त पोर्टल नस के माध्यम से बाहर निकल जाएगा और खुले पेट की गुहा में पूल होगा। (सी) रक्त निकालने के लिए पेट की दीवार को एक तरफ लगाया जाता है। एक कपास का फाहा जल निकासी की सुविधा प्रदान करता है। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक चित्रा एस 3: ग्लिसन कैप्सूल। (ए) ग्लिसन के कैप्सूल को यकृत की सतह के साथ कुछ स्थानों पर ठीक-टिप चिमटी के साथ तोड़ दिया जाता है, और यकृत कोशिकाओं को धीरे से कैप्सूल को हिलाकर जारी किया जाता है। (बी) जिगर को आसानी से अलग कर देना चाहिए। (सी) निलंबन में जारी हेपेटोसाइट्स के साथ खाली यकृत थैली (ग्लिसन कैप्सूल)। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक चित्रा एस 4: व्यवहार्यता स्क्रीनिंग के लिए फ्लो साइटोमेट्री गेटिंग रणनीति। (ए) सभी घटनाओं को दर्ज किया गया था। (बी) सिंगलेट गेटिंग। (सी) एलेक्सा फ्लूर 488 ज़ोंबी ग्रीन वायबिलिटी डाई के साथ लाइव / डेड धुंधलापन। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक चित्रा एस 5: ग्रैन्यूलेरिटी माप के लिए फ्लो साइटोमेट्री गेटिंग रणनीति। (ए) सभी घटनाओं को दर्ज किया गया था। (बी) सिंगलेट गेटिंग। (सी) साइड स्कैटर का डॉट प्लॉट (एसएससी; एक्स अक्ष) बनाम फॉरवर्ड स्कैटर (एफएससी; वाई अक्ष) ग्रैन्यूलैरिटी के स्तर का विश्लेषण करने के लिए। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक चित्रा एस 6: हेपेटोसाइट शुद्धिकरण। (ए) पहले सेंट्रीफ्यूजेशन चरण के बाद सेल पेलेट; माध्यम के शीर्ष पर फैटी परत पर ध्यान दें। (बी) सेंट्रीफ्यूजेशन के दूसरे दौर के बाद हेपेटोसाइट गोली। (सी) शुद्धिकरण प्रक्रिया के अंत में शुद्ध हेपेटोसाइट्स। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

प्रकाशित प्रोटोकॉल एफएसीएस सॉर्टिंग के बाद एकल-सेल डाउनस्ट्रीम विश्लेषण या कोशिकाओं के थोक विश्लेषण के लिए सामान्य और स्टीटोटिक मुराइन हेपेटोसाइट्स की उच्च उपज को अलग करने के लिए एक विश्वसनीय और सीधा तरीका प्रदान करता है। घनत्व-ढाल शुद्धिकरण पर अलग लाभ यह है कि सेलुलर लिपिड सामग्री का हेपेटोसाइट्स की प्रभावी उपज पर अनिवार्य रूप से कोई प्रभाव नहीं पड़ता है। इस प्रकार, स्टीटोटिक हेपेटोसाइट्स के अंश को बनाए रखा जाएगा और डाउनस्ट्रीम विश्लेषण में शामिल किया जाएगा। यह न केवल स्टेटोजेनिक यकृत रोगों के अध्ययन के लिए महत्वपूर्ण है, बल्कि प्रमुख हेपेटेक्टॉमी के बाद प्रक्रियाओं के किसी भी विश्लेषण के लिए भी सर्वोपरि है, जहां हेपेटोसाइट्स पुनर्जनन के पहले 2-3 दिनों के भीतर अस्थायी और स्थानिक रूप से गतिशील स्टीटोसिस प्रदर्शित करते हैं। भले ही पृथक हेपेटोसाइट्स के (एकल-कोशिका) विश्लेषण पहले से हीहेपेटेक्टॉमी 19,20,21 के बाद किए गए हैं, यह माना जाना चाहिए कि विश्लेषण की गई सेल आबादी, कम से कम आंशिक रूप से, लिपिड से भरे हेपेटोसाइट्स से वंचित थी और इसलिए, परिणाम पूरी तरह से प्रतिनिधि नहीं थे और दुबला हेपेटोसाइट्स की ओर झुके हुए थे।

वर्तमान में, TRAS का कार्य पूरी तरह से स्पष्ट नहीं है। उदाहरण के लिए, यकृत लोब्यूल्स के भीतर लिपिड सामग्री में स्थानिक अंतर को गलत तरीके से समझा जाता है। इसलिए, एक ऐसी विधि की आवश्यकता है जो विश्लेषण से इन कोशिकाओं को ठीक से बाहर किए बिना मात्रात्मक और गुणात्मक पहचान की अनुमति देती है (उदाहरण के लिए, एकल-सेल ट्रांसस्क्रिप्टोमिक्स, फ्लो साइटोमेट्री और मेटाबोलॉमिक्स के लिए)।

कुल मिलाकर, इस बेहतर प्रोटोकॉल के साथ हेपेटोसाइट उपज घनत्व-ढाल शुद्धिकरण15 का उपयोग करके वसा युक्त हेपेटोसाइट्स (जैसे, गैर-मादक स्टीटोहेपेटाइटिस, एनएएसएच वाले चूहों से) के अलगाव के लिए अन्य तरीकों से स्पष्ट रूप से बेहतर है। हालांकि, सेल उपज, व्यवहार्यता और वसा सामग्री तैयारी के बीच भिन्न हो सकती है। कई कारक जिम्मेदार प्रतीत होते हैं।

सबसे पहले, कोलेजनेज या कोलेजनेज मिश्रणों के विभिन्न बैच उनकी एंजाइमेटिक गतिविधि में भिन्न होंगे; हालांकि, बहुत से बहुत अंतर पारंपरिक कोलेजनेस के साथ महत्वपूर्ण नहीं हैं। फिर भी, काम की एकाग्रता को समायोजित करना आवश्यक हो सकता है। उपयोग तक उचित भंडारण द्वारा मतभेदों को और कम किया जा सकता है (शुष्क लियोफिलिज़ेट्स और -15 से -25 डिग्री सेल्सियस पर पुनर्जलीकृत स्टॉक समाधान) और दोहराए जाने वाले फ्रीज-पिघलने चक्रों से बचकर, लेकिन पूरी तरह से समाप्त नहीं किया जा सकता है। इसलिए, किसी दिए गए प्रयोगात्मक श्रृंखला के लिए एक विशिष्ट बैच के केवल कोलेजनेस का उपयोग करने की सिफारिश की जाती है। इसके अलावा, एंजाइमेटिक गतिविधि उस तापमान पर निर्भर करती है जिस पर पाचन बफर यकृत तक पहुंचता है, कोलेजनेस I और II22 के मिश्रण के लिए 35 डिग्री सेल्सियस और 37 डिग्री सेल्सियस के बीच इष्टतम तापमान के साथ। कम तापमान एंजाइमेटिक गतिविधि को कम कर देगा, जबकि 50 डिग्री सेल्सियस से ऊपर के तापमान से प्रोटीन का अपरिवर्तनीय विकृतीकरण हो सकता है। इसे पहले से परीक्षण करें और पाचन बफर के प्रारंभिक तापमान, प्लास्टिक ट्यूब की लंबाई और व्यास और प्रवाह वेग को समायोजित करके प्रयोगात्मक स्थितियों को अनुकूलित करें। उदाहरण के लिए, 60 सेमी की ट्यूब लंबाई के भीतर 10 डिग्री सेल्सियस तक के बफर तापमान में गिरावट की उम्मीद की जानी चाहिए। यदि आवश्यक हो, तो वार्मिंग पैड और इन्फ्रारेड लैंप का उपयोग करके तापमान को सही करें। कोलेजनेस 7.4 के पीएच पर अपनी इष्टतम पाचन क्षमता प्रदर्शित करते हैं; इसलिए, उपयोग से पहले लगभग 37 डिग्री सेल्सियस के कामकाजी तापमान पर पहले से ही बफर समाधानों के पीएच को समायोजित करने की सलाह दी जाती है।

दूसरा, सीरम या एल्बुमिन जैसे संभावित अवरोधकों को खत्म करने के लिए पाचन प्रक्रिया शुरू करने से पहले यकृत (या पूरे माउस) को छिड़काव बफर के साथ पर्याप्त रूप से फ्लश करना सर्वोपरि है। आदर्श रूप से, छिड़काव केवल प्रणालीगत परिसंचरण बंद होने के बाद शुरू किया जाता है, यह सुनिश्चित करने के लिए कि पाचन बफर केवल यकृत के माध्यम से वेना कावा से खुले पोर्टल नस के माध्यम से बहिर्वाह तक जाता है। बेहतर वेना कावा को एक छोटे संवहनी क्लैंप के साथ बंद किया जा सकता है। यह अवशिष्ट रक्त घटकों / अवरोधकों के संपर्क को रोकता है। जिगर को बेहतर ढंग से फ्लश करने का एक और तरीका पोर्टल नस का आंतरायिक क्लैंपिंग है। यह सावधानी से किया जाना चाहिए और - एक बार पाचन बफर यकृत तक पहुंच जाने के बाद - पहले से ही पच चुकी कोशिकाओं को नुकसान पहुंचाने से बचने के लिए केवल एक बार प्रदर्शन किया जाता है।

तीसरा, हेपेटोसाइट्स को पुनर्जीवित करना संवेदनशील है, और अनुभव से पता चला है कि उन्हें अधिक पाचन और कोशिकाओं को नुकसान से बचने के लिए कम पाचन समय और अधिक सावधानीपूर्वक हैंडलिंग की आवश्यकता होती है। यकृत को यथासंभव धीरे से काटने के लिए, हेपेटिक हिलस को क्लैंप के साथ समझने की सिफारिश की जाती है और फिर, पहले बेहतर वेना कावा को काटें और यकृत को नस और डायाफ्राम के कनेक्शन से मुक्त करें। इसके बाद, अवर वेना कावा और पोर्टल नस को काटा जा सकता है, जो यकृत को जुटाने में सक्षम बनाता है और आसानी से इसे गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल लिगामेंट्स, एक तरफ अन्नप्रणाली और दूसरी तरफ दाईं किडनी से मुक्त करता है। हेपेटेक्टोमाइज्ड चूहों में, यकृत को हटाने के लिए मेडियन लोब से लिगेटर्स में से एक को ध्यान से समझना संभव है। यदि बल द्वारा यकृत को बाहर खींचने का प्रयास किया जाता है, तो ग्लिसन का कैप्सूल टूट सकता है, और पृथक कोशिकाएं खो सकती हैं।

अंत में, यह आवश्यक है कि छिड़काव प्रक्रिया और हेपेटोसाइट्स के आगे के प्रसंस्करण में बाधा या देरी न हो, क्योंकि यह तुरंत और अनिवार्य रूप से व्यवहार्यता को प्रभावित करेगा। आदर्श रूप से, छिड़काव कम से कम दो लोगों की एक टीम में और एक समय में एक जानवर पर किया जाता है। समय और जनशक्ति में ये आवश्यकताएं, हालांकि, इस पद्धति की सीमाओं में से एक हैं, हालांकि यह वैकल्पिक तरीकों पर भी लागू होता है।

एक और सीमा परिणामी सेल निलंबन की अंतिम शुद्धता है, क्योंकि घनत्व ढाल के लिए स्टीटोटिक हेपेटोसाइट्स को नहीं खोने का लाभ शेष गैर-पैरेन्काइमल और / या प्रतिरक्षा कोशिकाओं के एक छोटे से अनुपात में होता है। दिखाए गए नमूने में, सीडी 45 + (प्रतिरक्षा कोशिकाओं) और सीडी 31 + (एंडोथेलियल कोशिकाओं) का अंश 5% से नीचे है, और प्रवाह-साइटोमेट्री के दौरान पहले सेल आकार के लिए चयन करते समय, सीडी 45 + और सीडी 31 + का प्रतिशत क्रमशः 1.2% और 2.2% है (चित्रा 5)। अधिकांश अनुप्रयोगों के लिए, शुद्धता का यह स्तर पर्याप्त है, लेकिन अत्यधिक संवेदनशील तरीकों या प्राथमिक सेल संस्कृतियों में आगे के उपयोग के लिए शायद उच्च डिग्री की आवश्यकता होती है। कई अध्ययनों ने एमएसीएस23,24 या एफएसीएस 25 द्वारा यकृत कोशिका आबादी को क्रमबद्ध करने के लिए प्रणालीगत मार्करों के रूप में सीडी 31 और सीडी45 का उपयोग किया है।

यह बेहतर अलगाव विधि आदर्श रूप से यकृत पुनर्जनन के अध्ययन के लिए उपयुक्त है, विशेष रूप से प्रारंभिक अवधि जो महत्वपूर्ण मात्रा में स्टेटोटिक हेपेटोसाइट्स के साथ प्रस्तुत होती है। पीएचएलएफ, निरंतर स्टीटोसिस की विशेषता है, एक विशेष रूप से प्रासंगिक विषय है जिसे अनुसंधान की आवश्यकता है। सीमांत अवशेषों को पीछे छोड़ने वाले विस्तारित हेपेटेक्टॉमी के बाद, पीएचएलएफ विकसित हो सकता है और वास्तव में यकृत सर्जरी के कारण मृत्यु का सबसे आम कारण का प्रतिनिधित्व करता है। इसकी पैथोबायोलॉजी केवल आंशिक रूप से समझी जाती है, और वर्तमान में कोईउपचार उपलब्ध नहीं है। यह देखते हुए कि पीएचएलएफ यकृत सर्जरी के आवेदन को काफी सीमित करता है (जैसे कि यकृत विकृतियों के इलाज के लिए), इसके कारणों की खोज करना और संभावित उपायों की पहचान करना एक स्पष्ट चिकित्सा आवश्यकता है।

उन बीमारियों के अध्ययन के लिए भी आवश्यकता मौजूद है जो हेपेटिक स्टीटोसिस को शुरुआती बिंदु के रूप में साझा करते हैं। एक प्रमुख उदाहरण गैर-मादक फैटी लीवर रोग (एनएएफएलडी) है, जो एनएएसएच और अंततः हेपेटोसेलुलर कार्सिनोमा (एचसीसी) 27 में प्रगति कर सकता है। पश्चिमी आहार के साथ मिलकर गतिहीन जीवन शैली के प्रसार ने एनएएफएलडी की विश्वव्यापी महामारी को जन्म दिया है, और तदनुसार, एचसीसी की घटना28,29 बढ़ने का अनुमान है। स्टीटोसिस, बदले में, मोटापे, चयापचय सिंड्रोम और टाइप -2-मधुमेह से भी कसकर जुड़ा हुआ है, सभी बीमारियां बढ़तीघटनाओं के साथ 30। इसलिए, स्टीटोसिस वर्तमान स्वास्थ्य सेवा प्रणाली के लिए एक बढ़ते बोझ का प्रतिनिधित्व करता है, इसके प्रबंधन के लिए प्रभावी साधनों की मांग करता है। यह बेहतर दो-चरण कोलेजनेज छिड़काव विधि एकल-कोशिका स्तर पर स्टीटोटिक हेपेटोसाइट्स के अध्ययन को सक्षम बनाती है, और इसलिए हेपेटोसेलुलर लिपिड संचय के कारणों और परिणामों की खोज में सहायता करनी चाहिए।

यह प्रोटोकॉल आंशिक (70%) और विस्तारित (86%) हेपेटेक्टोमी के बाद चूहों से हेपेटोसाइट्स को पुनर्जीवित करने के विवो अलगाव के लिए एक आसान, तेज़ और विश्वसनीय तकनीक प्रस्तुत करता है। यह दृष्टिकोण ढाल-शुद्धिकरण पर भरोसा नहीं करता है और इसका उपयोग लिपिड से भरे हेपेटोसाइट्स को शामिल करने के साथ यकृत पुनर्जनन प्रक्रियाओं की जांच करने के लिए किया जा सकता है जो आमतौर पर पारंपरिक अलगाव प्रोटोकॉल के दौरान खो जाते हैं। इसके अलावा, इस विधि को स्टीटोटिक परिवर्तनों से जुड़े विभिन्न यकृत रोगों के अनुसंधान के लिए भी लागू किया जा सकता है और माउस प्रजातियों तक सीमित नहीं है।

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Disclosures

लेखक घोषणा करते हैं कि उनके पास कोई प्रतिस्पर्धी हित नहीं हैं।

Acknowledgments

इस अध्ययन को स्विस नेशनल फोंड (परियोजना अनुदान 310030_189262) द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
Alexa Fluor 488 Zombie green BioLegend 423111 Amine-reactive viability dye
Attane Isoflurane ad us. vet. 99.9% Provet AG QN01AB06 CAUTION: needs ventilation
EDTA solution Sigma-Aldrich E8008-100ML -
Ethanol Sigma-Aldrich V001229 Dilute with water to 70%
Fetal bovine serum (FCS) Gibco A5256701 -
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS), Ca2+, Mg2+, phenol red Sigma-Aldrich H9269-6x600ML For digestion/preservation
Hanks' Balanced Salt solution (HBSS), w/o Ca2+, w/o Mg2+, no phenol red Sigma-Aldrich H6648-6x500ML For perfusion buffer
HEPES solution, 1 M Sigma-Aldrich 83264-100ML-F -
Histoacryl tissue adhesive (butyl-2-cyanoacrylate) B. Braun 1050052 For stabilization of cannulation site
Hoechst 33258 Staining Dye Solution Abcam ab228550 -
Liberase Research Grade Roche 5401119001 Lyophilized collagenases I/II
NaCl 0.9% 500 mL Ecotainer B. Braun 123 -
Paralube Vet Ointment Dechra 17033-211-38 -
Phosphate buffered saline (PBS) Gibco A1286301 -
Sudan IV – Lipid staining Sigma-Aldrich V001423 -
Temgesic (Buprenorphine hydrochloride), Solution for Injection 0.3 mg/mL Indivior Europe Ltd. 345928 Narcotics. Store securely.
Trypan blue, 0.4%, sterile-filtered Sigma-Aldrich T8154 For cell counting
Williams’ Medium E Sigma-Aldrich W4128-500ML -
Materials
25 mL serological pipette, Greiner Cellstar Merck P7865 -
50 mL Falcon tubes TPP - -
BD Neoflon, Pro IV Catheter 26 G BD Falcon 391349 -
Cell scraper, rotating blade width 25 mm TPP 99004 -
Falcon Cell Strainer 100 µm Nylon BD Falcon 352360 -
Fenestrated sterile surgical drape - - Reusable cloth material
Filling nozzle for size 16# tubing (ID 3.1 mm) Drifton FILLINGNOZZLE#16 To go into the tubes
Flow cytometry tubes, 5 mL BD Falcon 352008 -
Male Luer to Barb, Tubing ID 3.2 mm Drifton LM41 Connection tube to syringe
Petri dishes, 96 x 21 mm TPP 93100 -
Prolene 5-0 Ethicon 8614H To retract the sternum
Prolene 6-0 Ethicon 8695H For skin suture
Prolene 8-0 Ethicon EH7470E Ligature gall bladder
Tube 16#, WT 1.6 mm, ID 3.2 mm, OD 6.4 mm Drifton SC0374T Perfusion tube
Equipment
BD LSRFortessa Cell Analyzer Flow Cytometer BD - -
Isis rodent shaver Aesculap GT421 -
Isofluran station Provet - -
Low-speed centrifuge – Scanspeed 416 Labogene - -
Neubauer-improved counting chamber Marienfeld - -
Oxygen concentrator – EverFlo Philips  1020007 0 – 5 L/min
Pipetboy – Pipettor Turbo-Fix TPP 94700 -
Shenchen perfusion pump – YZ1515x Shenchen YZ1515x -
Surgical microscope – SZX9 Olympus - -
ThermoLux warming mat Thermo Lux - -
Vortex Genie 2, 2700 UpM NeoLab 7-0092 -
Water bath – Precision GP 02 Thermo scientific - Adjust to 42 °C

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References

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चिकित्सा अंक 190
चूहों में आंशिक हेपेटेक्टोमी के बाद हेपेटोसाइट्स को पुनर्जीवित करने का अलगाव
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Breuer, E., Humar, B. Isolation of… More

Breuer, E., Humar, B. Isolation of Regenerating Hepatocytes after Partial Hepatectomy in Mice. J. Vis. Exp. (190), e64493, doi:10.3791/64493 (2022).

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