小鼠部分肝切除术后再生肝细胞的分离

摘要

富含脂质的肝细胞在肝脏再生过程中具有内在作用，但通常在密度梯度离心过程中丢失。本文介绍了一种优化的细胞分离方案，可保留脂肪变性肝细胞，从而在小鼠部分肝切除术后获得具有代表性的再生肝细胞群体。

摘要

部分肝切除术已广泛用于研究小鼠肝脏再生，但为后续单细胞应用分离出高产量且存活率高的肝细胞仍具挑战性。在小鼠正常肝脏再生的前两天内，可观察到再生肝细胞中脂质显著积聚。这种被称为再生相关性短暂性脂肪变性（TRAS）的现象虽为暂时性，但与主要增殖阶段存在部分重叠。密度梯度纯化是目前大多数原代肝细胞分离方案的核心步骤。由于梯度纯化依赖于细胞的密度和大小，因此会将非脂肪变性肝细胞与脂肪变性肝细胞分离开。因此，脂肪变性的肝细胞常被丢失，导致所获得的肝细胞群体缺乏代表性。

本文所述方案介绍了一种简便且可靠的 体内 无论脂质含量如何分离再生肝细胞。在雄性C57BL/6小鼠肝切除术后24-48小时，采用经典的两步胶原酶灌注法分离肝细胞。标准蠕动泵驱动预热的灌注液 通过 将导管插入下腔静脉，利用逆行灌注技术经门静脉流出，灌注残余肝脏。通过胶原酶消化使肝细胞从格利森囊分离。经洗涤和仔细离心后，肝细胞可用于后续各项分析。总之，本文介绍了一种简单且可重复的小鼠部分肝切除术后分离再生肝细胞群体的技术。该方法也有助于脂肪肝疾病的研究。

引言

即使在发生重大组织损失后，肝脏仍能自我再生。这种独特的再生能力在部分（70%）肝切除的实验模型中得到了明确体现，该模型最早由 Higgins 和 Anderson 于 1931 年在大鼠中首次描述¹。在此模型中，通过手术切除较大的肝叶，将动物体内 70% 的肝脏组织移除。剩余的肝叶随后通过代偿性肥大迅速生长，通常在术后约 1 周内恢复原有的肝脏质量，但并不恢复原有的肝脏结构^2,3。此外，研究人员还开发了不同切除比例的其他肝切除模型，例如 86% 扩展性肝切除，其中残留肝组织过小而无法恢复，最终导致 30%–50% 的实验动物出现肝切除后肝功能衰竭（PHLF）并相继死亡^4,5,6。这些模型可根据切除组织的多少，用于研究正常或失败的肝脏再生过程（图 1）。

尽管肝切除小鼠模型已被成功使用多年，但直到最近更先进的分析方法才使得在单细胞水平上获得更深入的见解成为可能。然而，对于大多数这些方法而言，获得单个肝细胞是基本前提。目前大多数原代肝细胞分离方案均基于两步胶原酶灌注技术，随....

方案

所有动物实验均遵循瑞士联邦动物管理条例，并经苏黎世兽医办公室批准（编号° 007/2017、156/2019）确保动物福利。使用10-12周龄雄性C57BL/6小鼠，维持12小时昼夜循环，自由摄食和饮水。每个实验组包含六至八只动物。见 材料表 有关本方案中使用的所有材料、仪器和试剂的详细信息。

1. 小鼠部分肝切除术

1. 对于标准肝切除术（70%），结扎并切除左外侧叶、方叶的右部分以及方叶的左部分（图1B）。对于扩大肝切除术（86%）⁴，还需切除尾状叶和右前叶（图1C）。
2. 注意：标准肝切除术是多年来用于肝脏再生研究的一种手术方法。该手术的实验方案已有文献报道^3,17，包括Mitchell和Willenbring的视频辅助操作方案¹⁸。本研究中所用肝切除技术的更多细节详见补充文件1。

结果

在肝切除术后16小时，肝再生相关性苍白（TRAS）达到高峰，并在标准肝切除术后32-48小时内逐渐消失，但在扩大肝切除术后可持续超过48小时。肉眼可见，TRAS表现为肝脏残留部分的苍白外观（图1F），可在肝切除术后16至48小时的小鼠中观察到。

70%肝切除术后小鼠的估计最终肝细胞产量为10-15 × 10⁶，扩展性86%肝切除术后为4-9 × 10⁶，最终平均活力分别为78%和65%。该产量与整只小鼠肝脏的总产量50-70 × 10⁶相比，符合预期百分比（图6A、C）。部分肝切除术后，肝细胞体积较正常肝脏增大，与其脂质含量增加相对应（图6B）。门控策略见补充图S4。

讨论

已发表的方案提供了一种可靠且简便的方法，用于分离获得高产量的正常及脂肪变性小鼠肝细胞，适用于单细胞下游分析或经FACS分选后的细胞群体分析。与密度梯度纯化法相比，其显著优势在于细胞内的脂质含量几乎不影响肝细胞的有效得率。因此，脂肪变性肝细胞的比例得以保留并包含在后续分析中。这一点不仅对于脂肪生成性肝病的研究至关重要，而且在研究大部肝切除术后相关过程时也极为关键，因为在肝再生的最初2-3天内，肝细胞会表现出时空动态的脂肪变性。尽管在肝切除术后已开展过对分离肝细胞的（单细胞）分析^19,20,21，但可以推断，所分析的细胞群体至少部分缺失了富含脂质的肝细胞，因此结果未能完全代表真实情况，而偏向于瘦型肝细胞。

目前，TRAS 的功能尚未完全阐明。例如，肝小叶内脂质含量的空间差异仍不清楚。因此，需要一种能够在不将这些细胞精确排除在分析之外的情况下实现定性和定量检测的方法（例如用于单细胞转录组学、流式细胞术和.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
试剂
Alexa Fluor 488 Zombie green	BioLegend	423111	胺反应性活率染料
Attane Isoflurane ad us. vet. 99.9%	Provet AG	QN01AB06	注意：需要通风
EDTA 溶液	Sigma-Aldrich	E8008-100ML	-
乙醇	Sigma-Aldrich	V001229	用水稀释至 70%
胎牛血清 (FCS)	Gibco	A5256701	-
Hanks' 平衡盐溶液 (HBSS)，含 Ca2+、Mg2+，含酚红	Sigma-Aldrich	H9269-6x600ML	用于消化/保存
Hanks' 平衡盐溶液 (HBSS)，无 Ca2+，无 Mg2+，无酚红	Sigma-Aldrich	H6648-6x500ML	用作灌注缓冲液
HEPES 溶液，1 M	Sigma-Aldrich	83264-100ML-F	-
Histoacryl 组织粘合剂（丁基-2-氰基丙烯酸酯）	B. Braun	1050052	用于固定插管部位
Hoechst 33258 染色染料溶液	Abcam	ab228550	-
Liberase 研究级	Roche	5401119001	冻干胶原酶 I/II
0.9% NaCl 500 mL Ecotainer	B. Braun	123	-
Paralube Vet 软膏	Dechra	17033-211-38	-
磷酸盐缓冲液 (PBS)	Gibco	A1286301	-
Sudan IV – 脂质染色	Sigma-Aldrich	V001423	-
Temgesic（盐酸丁丙诺啡）注射液 0.3 mg/mL	Indivior Europe Ltd.	345928	麻醉药品，需安全存放
台盼蓝，0.4%，无菌过滤	Sigma-Aldrich	T8154	用于细胞计数
Williams’ Medium E	Sigma-Aldrich	W4128-500ML	-
材料
25 mL 刻度移液管，Greiner Cellstar	Merck	P7865	-
50 mL Falcon 管	TPP	-	-
BD Neoflon Pro IV 导管 26 G	BD Falcon	391349	-
细胞刮刀，旋转刀片宽度 25 mm	TPP	99004	-
Falcon 细胞筛，100 µm 尼龙	BD Falcon	352360	-
带孔无菌手术巾	-	-	可重复使用的布料
16# 管用填充喷嘴（内径 3.1 mm）	Drifton	FILLINGNOZZLE#16	插入管中使用
流式细胞仪管，5 mL	BD Falcon	352008	-
雄性鲁尔接头转接头，管内径 3.2 mm	Drifton	LM41	连接注射器的管路
培养皿，96 x 21 mm	TPP	93100	-
Prolene 5-0	Ethicon	8614H	用于胸骨牵开
Prolene 6-0	Ethicon	8695H	用于皮肤缝合
Prolene 8-0	Ethicon	EH7470E	结扎胆囊
16# 管，壁厚 1.6 mm，内径 3.2 mm，外径 6.4 mm	Drifton	SC0374T	灌注管
设备
BD LSRFortessa 细胞分析流式细胞仪	BD	-	-
Isis 啮齿类动物剃毛器	Aesculap	GT421	-
异氟烷工作站	Provet	-	-
低速离心机 – Scanspeed 416	Labogene	-	-
改进型 Neubauer 计数板	Marienfeld	-	-
氧气浓缩器 – EverFlo	Philips	1020007	0 – 5 L/min
Pipetboy – Pipettor Turbo-Fix	TPP	94700	-
Shenchen 灌注泵 – YZ1515x	Shenchen	YZ1515x	-
手术显微镜 – SZX9	Olympus	-	-
ThermoLux 加热垫	Thermo Lux	-	-
Vortex Genie 2，2700 转/分钟	NeoLab	7-0092	-
水浴锅 – Precision GP 02	Thermo scientific	-	调节至 42 °C