Summary
Los hepatocitos cargados de lípidos son inherentes a la regeneración hepática, pero generalmente se pierden con la centrifugación por gradiente de densidad. Aquí, presentamos un protocolo de aislamiento celular optimizado que retiene hepatocitos esteatósicos, produciendo poblaciones representativas de hepatocitos regeneradores después de la hepatectomía parcial en ratones.
Abstract
La hepatectomía parcial se ha utilizado ampliamente para investigar la regeneración hepática en ratones, pero el aislamiento de altos rendimientos de hepatocitos viables para aplicaciones de células individuales aguas abajo es un desafío. Se observa una marcada acumulación de lípidos dentro de los hepatocitos regeneradores durante los primeros 2 días de regeneración hepática normal en ratones. Esta llamada esteatosis asociada a la regeneración transitoria (TRAS) es temporal, pero se superpone parcialmente a la fase proliferativa principal. La purificación por gradiente de densidad es la columna vertebral de la mayoría de los protocolos existentes para el aislamiento de hepatocitos primarios. Como la purificación de gradiente depende de la densidad y el tamaño de las células, separa las poblaciones de hepatocitos no esteatósicos de las esteatósicas. Por lo tanto, los hepatocitos grasos a menudo se pierden, produciendo fracciones de hepatocitos no representativas.
El protocolo presentado describe un método fácil y fiable para el aislamiento in vivo de hepatocitos regeneradores independientemente de su contenido lipídico. Los hepatocitos de ratones machos C57BL/6 se aíslan 24-48 h después de la hepatectomía mediante un enfoque clásico de perfusión de colagenasa de dos pasos. Una bomba peristáltica estándar impulsa las soluciones calentadas a través de la vena cava inferior cateterizada hacia el remanente, utilizando una técnica de perfusión retrógrada con flujo de salida a través de la vena porta. Los hepatocitos son disociados por la colagenasa para su liberación de la cápsula de Glisson. Después del lavado y la centrifugación cuidadosa, los hepatocitos se pueden usar para cualquier análisis posterior. En conclusión, este artículo describe una técnica sencilla y reproducible para el aislamiento de una población representativa de hepatocitos regeneradores después de la hepatectomía parcial en ratones. El método también puede ayudar al estudio de la enfermedad del hígado graso.
Introduction
El hígado puede regenerarse incluso después de una pérdida importante de tejido. Esta capacidad regenerativa única se ilustra explícitamente en el modelo experimental de hepatectomía parcial (70%), descrito por primera vez en ratas por Higgins y Anderson en 19311. En este modelo, el 70% del hígado se extirpa quirúrgicamente de los animales cortando lóbulos hepáticos más grandes. Los lóbulos restantes crecen a través de la hipertrofia compensatoria para restaurar la masa hepática original dentro de aproximadamente 1 semana después de la cirugía, aunque sin restauración de la arquitectura hepática original 2,3. Se han desarrollado hepatectomías adicionales con cantidades variables de extirpación de tejido, como la hepatectomía extendida al 86% donde el remanente hepático es demasiado pequeño para recuperarse, lo que finalmente conduce a insuficiencia hepática posthepatectomía (PHLF) y posterior muerte en 30% -50% de los animales 4,5,6. Estos modelos permiten estudiar la regeneración hepática normal y fallida, dependiendo de la cantidad de tejido resecado (Figura 1).
Aunque los modelos de hepatectomías en ratones se han utilizado con éxito durante muchos años, solo recientemente los métodos analíticos más avanzados han permitido una visión más profunda a nivel de una sola célula. Para la mayoría de estos métodos, sin embargo, la presencia de hepatocitos individuales es un requisito previo básico. La mayoría de los protocolos para el aislamiento de hepatocitos primarios se basan en una técnica de perfusión de colagenasa de dos pasos y la posterior purificación del gradiente de densidad para separar los hepatocitos viables de los desechos y no parenquimatosos, así como las células muertas 7,8,9. Este método fue descrito por primera vez por Berry y Friend en 196910 y adaptado por Seglen y colegas en 197211,12. Sin embargo, como la centrifugación por gradiente depende de la densidad y el tamaño de las células, los hepatocitos cargados de lípidos a menudo se pierden durante la purificación estándar. Si bien tal pérdida puede ser insignificante para muchas preguntas de investigación, es un aspecto crucial para la regeneración temprana del hígado. Durante los primeros 2 días, los hepatocitos dentro del hígado de ratón regenerador acumulan lípidos, creciendo así en tamaño y disminuyendo en densidad. Esta esteatosis asociada a la regeneración transitoria (TRAS) sirve para proporcionar combustible regenerativo y es temporal, pero se superpone parcialmente a la fase proliferativa principal y se distribuye de manera desigual dentro de los lóbulos hepáticos, las unidades funcionales del hígado13,14. Sin embargo, después de una hepatectomía extendida del 86%, la TRAS también ocurre pero persiste, porque la regeneración está estancada y los lípidos no se oxidan14. Por lo tanto, la purificación por gradiente de los hepatocitos después de hepatectomías al 70% u 86% producirá fracciones no representativas, ya que la mayoría de los hepatocitos cargados de lípidos se pierden debido a su baja densidad15.
En este protocolo de aislamiento modificado, los hepatocitos de ratones C57BL / 6 se aíslan 24-48 h después de la hepatectomía mediante un enfoque clásico de perfusión de colagenasa de dos pasos. Por lo general, la canulación y la perfusión del remanente para el aislamiento celular se realizan a través de la vena porta. Sin embargo, la resistencia portovascular en pequeños restos que quedan después de la resección mayor es alta16, y por lo tanto la perfusión es delicada. Debido a que la vena cava no se ve afectada por las hepatectomías, la perfusión se puede realizar fácilmente en la dirección retrógrada a través de la canulación de la vena cava . Una bomba peristáltica estándar impulsa las soluciones calentadas a través de la vena cava inferior cateterizada hacia el remanente hepático, utilizando perfusión retrógrada con flujo de salida a través de la vena porta (Figura suplementaria S1). Los hepatocitos son disociados por colagenasas y liberados de la cápsula de Glisson. Después del lavado y el procesamiento cuidadoso de hepatocitos viables mediante aislamiento gradual utilizando un enfoque de centrifugación de baja velocidad, los hepatocitos se pueden usar para cualquier análisis posterior.
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Protocol
Todos los experimentos con animales fueron de acuerdo con las Regulaciones Federales Alimentarias Suizas y aprobados por la Oficina Veterinaria de Zurich (n° 007/2017, 156/2019) asegurando el cuidado humano. Los ratones machos C57BL / 6 de 10 a 12 semanas se mantuvieron en un ciclo de día / noche de 12 h con acceso gratuito a alimentos y agua. Cada grupo experimental consistió de seis a ocho animales. Consulte la Tabla de materiales para obtener detalles relacionados con todos los materiales, equipos y reactivos utilizados en este protocolo.
1. Hepatectomía parcial en ratones
- Para la hepatectomía estándar (70%), ligar y resecar el lóbulo lateral izquierdo, la porción derecha del lóbulo mediano y la porción izquierda del lóbulo mediano (Figura 1B). Para la hepatectomía prolongada (86%)4, también se eliminan los lóbulos caudados y el lóbulo anterior derecho (Figura 1C).
- NOTA: La hepatectomía estándar es un procedimiento que se ha utilizado en la investigación de la regeneración hepática durante muchos años. Los protocolos para este procedimiento están disponibles3,17, incluyendo el protocolo asistido por video de Mitchell y Willenbring18. Se pueden encontrar más detalles sobre las técnicas utilizadas aquí para las hepatectomías en el Archivo Suplementario 1.
Figura 1: Hepatectomía estándar (70%) y extendida (86%) en ratones. (A) Los cinco lóbulos hepáticos del ratón y sus respectivas contribuciones al peso total del hígado. (B) Ilustración esquemática de hepatectomía al 70% en ratones. Los lóbulos oscuros representan el futuro remanente hepático. (C) Ilustración esquemática de hepatectomía al 86% en ratones. Los lóbulos oscuros representan el futuro remanente hepático. (D) Volumen preciso de tejido resecado después de la hepatectomía del 70% y 86%. (E) Abdomen de ratón inmediatamente después de la hepatectomía al 70%; (F) abdomen de ratón inmediatamente (izquierda) y 48 h (derecha) después de hepatectomía al 86%. Tenga en cuenta el color pálido del remanente esteatósico (flecha blanca). n = 6-7/grupo. Abreviaturas: sHx = hepatectomía estándar; eHx = hepatectomía prolongada; LW = peso del hígado. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
2. Preparación de las soluciones de perfusión
- Prepare los tampones de perfusión, digestión y conservación (ver Tabla 1).
- Ajustar el pH de todas las soluciones tampón a 37 °C añadiendo hidróxido de sodio (NaOH) o cloruro de hidrógeno (HCl) según sea necesario. El pH óptimo para los tampones es 7.4.
- Coloque el tampón de preservación y el Medio E de Williams en hielo.
- Prepare el tampón de citometría de flujo y guárdelo en hielo.
Tabla 1: Soluciones y tampones utilizados para la digestión y purificación de hepatocitos. Haga clic aquí para descargar esta tabla.
3. Preparación de equipos de perfusión
- Calentar el baño maría a 42 °C y colocar el tampón de perfusión (50 mL) y el tampón de digestión (10-20 mL) en el baño maría. No agregue colagenasa al tampón de digestión todavía.
- Prepare la bomba peristáltica e inserte el tubo. La configuración completa de la perfusión se muestra en la Figura 2.
- Conecte una cánula 26 G IV al extremo de salida del tubo mediante un conector de bloqueo Luer. Inserte el extremo de entrada del tubo en el tubo tampón de perfusión precalentado en el baño de agua. Enjuague el tubo con etanol al 70%, seguido de 50 ml de cloruro de sodio estéril (NaCl 0,9%). Prepare el tubo con tampón de perfusión caliente (velocidad de bombeo de 3 ml / min).
- Sedar al ratón con anestesia por inhalación de isoflurano (800 mL/minO2, 3% -5% isoflurano para inducción y 2% para mantenimiento durante el procedimiento). Manipule el isoflurano debajo de una campana de laboratorio y proporcione una ventilación adecuada.
- Administrar buprenorfina por vía subcutánea 30 min antes de la cirugía a una dosis de 0,1 mg/kg de peso corporal.
- Para prevenir la hipotermia, coloque el ratón sedado en una almohadilla de calentamiento y coloque un tejido de tela enrollado debajo de la parte superior del abdomen para elevar el hígado por encima de los otros órganos y facilitar el acceso a la vena cava inferior.
NOTA: No utilice tejido demasiado grueso ya que es posible que los vasos se retuerzan y la eficacia de la perfusión se vea afectada. - Agregue ungüento para los ojos para prevenir el daño corneal.
- Antes de comenzar la cirugía, asegúrese de que el animal esté adecuadamente anestesiado probando el reflejo de retirada del pedal (pellizco de la almohadilla del pie en ambas patas traseras). En caso de una respuesta, suministre anestesia adicional y vuelva a realizar la prueba antes de comenzar el procedimiento.
- Limpie el abdomen con etanol al 70%.
- Vuelva a abrir la incisión de la línea media cortando la sutura y separando suavemente los bordes de la herida. Si la hepatectomía tiene más de 24-48 h, retire la sutura y corte la piel con tijeras.
- Fije una sutura de polipropileno 5-0 al esternón, tire de él cranealmente y fíjelo en esta posición. Use un retractor o clips simples para mantener el abdomen abierto. La cavidad abdominal debe estar expuesta tanto como sea posible para optimizar el acceso y la visualización.
- Mueva los intestinos hacia la derecha usando hisopos de algodón para revelar la vena porta y la vena cava. Use un paño húmedo para retener los intestinos.
- Coloque un objeto pesado de aproximadamente 2 cm de altura (por ejemplo, un anillo de peso recubierto de silicona para matraces volumétricos) adyacente a las patas traseras del ratón (Figura suplementaria S2A). Coloque el tubo con la cánula 26 G IV conectada sobre el objeto y coloque la aguja cuidadosamente sobre la vena cava. Ajuste la longitud del tubo.
- Coloque la solución madre de colagenasa preparada en el tubo tampón de digestión precalentado. Añadir 250 μL de la solución madre a 10 ml de tampón de digestión. Prepare 10-20 ml de tampón de digestión por animal. Para animales más grandes o perfusión de hígados enteros, prepare hasta 30 ml de tampón de digestión.
NOTA: Se recomienda agregar la solución madre de colagenasa al tampón de digestión calentado aproximadamente 30 minutos antes del inicio del proceso de digestión.
Figura 2: Descripción general de la configuración de perfusión. (A) Mesa quirúrgica con el equipo necesario para la perfusión. (B) Los materiales necesarios para la preparación del hígado, así como la extracción y aislamiento de hepatocitos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
4. Canulación y perfusión
- Ajuste la velocidad de la bomba a 3 ml/min y encienda la bomba. Deje que el tampón de perfusión precalentado llegue a la aguja. Deseche los primeros 2-3 ml de tampón de perfusión.
- Realizar la canulación de la vena cava inferior.
- Mientras el tampón pasa a través de la aguja, inserte la cánula 26 G IV en un ángulo poco profundo en la vena cava debajo del riñón. Asegúrese de que el bisel de la aguja apunte hacia arriba.
- Use un hisopo de algodón para tirar suavemente de la vena cava caudalmente por debajo del sitio de punción para que la tensión proporcionada facilite la inserción de la cánula en la vena. Busque sangre en la cámara de destello del catéter cuando la aguja entre en la luz.
- Avance la aguja 2-3 mm adicionales para asegurarse de que la punta del catéter de plástico también haya entrado en la vena.
- Deslice el catéter de plástico sobre la aguja y dentro de la vena cava otros 5 mm. Retire la aguja lentamente y con mucho cuidado.
NOTA: No se recomienda fijar la cánula con una ligadura. Este paso requiere mucho tiempo ya que el recipiente primero debe ser diseccionado para este propósito. Si la cánula está colocada libremente y apoyada con un objeto, no es necesaria ninguna fijación adicional (consulte la configuración de perfusión en la Figura suplementaria S2). Para estabilizar el sitio de la canulación y evitar el reflujo, se puede agregar una sola gota de n-butil-cianoacrilato monomérico en el sitio de la canulación .
- Cuando la sangre salga de la cánula, llénela con tampón de perfusión caliente con una jeringa.
- Vuelva a conectar el tubo a la cánula, que sigue funcionando a una velocidad de bombeo de 3 ml/min. Deje que el tampón de perfusión entre en el hígado.
- Después de 2-3 s, busque manchas blancas que se forman en el hígado y / o expansión / hinchazón de la vena porta, que indican que el tampón de perfusión fluye a través del hígado y entra en los lobulillos hepáticos desde la vena central (Figura 3).
- Espere a que la vena porta se hinche visiblemente dentro de 1-2 s después de la aparición de manchas blancas en la superficie del hígado. Corte la vena porta con tijeras lo más distalmente posible del hilio hepático. Use un clip de microrecipiente para etiquetar (no ocluir) el sitio de corte (Figura 3B).
NOTA: Esto simplifica la evaluación del flujo a través del hígado durante el proceso de perfusión. El hígado elimina la sangre instantáneamente y se vuelve amarillo-blanco en pocos segundos (Figura 3C). Un corte adicional a través de la piel en el lado derecho de la abertura abdominal facilita la salida de la sangre, así como la solución de perfusión (Figura 3B y Figura suplementaria S2B, C). - Aumentar el flujo hasta 4-7 mL/min dependiendo del peso del animal, el tamaño del hígado y la extensión de la hepatectomía previa.
- Pinza la vena porta con pinzas o pinza vascular durante 7-10 s. Asegúrese de que no esté pasando líquido.
NOTA: El hígado se hincha visiblemente durante el pinzamiento y se relaja al liberarse. Esto es crucial para limpiar todo el hígado y limpiarlo de cualquier resto de sangre. - Realice una segunda pinza después de aproximadamente 30 s y asegúrese de que el hígado se hinche y se relaje. Continúe enjuagando al animal hasta que el amortiguador que fluye fuera de la vena porta esté despejado, pero al menos durante 3-4 minutos.
NOTA: La velocidad de la bomba depende del tubo, así como del tamaño del hígado. Debe evaluarse individualmente. - En este punto del procedimiento, la eutanasia debería haber ocurrido secundaria a la exanguinación. Confirme que la circulación sistémica se ha detenido (sin latidos cardíacos ni parpadeo del corazón). Para asegurar la muerte, el neumotórax bilateral se realiza en esta etapa del procedimiento como método físico secundario de eutanasia.
NOTA: Reduzca ligeramente la velocidad de la bomba si la circulación sistémica se ha detenido (sin latidos cardíacos ni parpadeo del corazón).
Figura 3: Proceso de perfusión desde la canulación hasta la digestión. (A) Anatomía del hígado del ratón con la vena cava inferior (flecha blanca) y la vena porta (flecha amarilla). (B) Canulación de la vena cava inferior. La cánula se asegura con una ligadura (flecha blanca), y la ubicación del flujo de salida a través de la vena porta abierta se marca (no se sujeta) con una abrazadera de microvaso. (C) Tenga en cuenta la aparición de estructuras irregulares antes de que el tampón de perfusión haya limpiado el hígado de toda la sangre restante (flecha blanca). La piel se incide (flecha amarilla) y se coloca un hisopo de algodón para asegurar el drenaje de la sangre y el líquido de perfusión. El pinzamiento intermitente se puede realizar con una pinza vascular o pinzas. (D) El hígado debe ser limpiado de toda la sangre (*). Después de que el tampón de digestión que contiene colagenasa haya entrado en el hígado, ya no se relajará después del pinzamiento y los lóbulos del hígado aumentarán de tamaño. (E) Después de un tiempo, se puede observar una apariencia burbujeante en la superficie del hígado (*). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
5. Digestión
- Pause la bomba de perfusión y transfiera rápidamente el tubo de entrada del tampón de perfusión al tampón de digestión precalentado. Reinicie la bomba.
- Antes de que el tampón de digestión llegue al hígado, sujete la vena porta una vez más durante 3-4 s. Asegúrese de que el hígado se relaje al liberar la pinza y que el líquido de perfusión permanezca limpio.
NOTA: El tampón de digestión contiene rojo fenol y es fácilmente distinguible del tampón de perfusión transparente. Esto permite un fácil seguimiento dentro del tubo. - Tan pronto como el tampón de digestión haya llegado al hígado, sujete la vena porta una vez más con un clip de microvaso.
NOTA: Al pinzar, el hígado se hincha pero no se relaja al soltar la pinza. Esto es normal. - Para facilitar el proceso de digestión, cierre la vena cava superior con una pinza vascular directamente debajo del diafragma para permitir que el tampón de digestión pase de la vena cava inferior al hígado y a la salida a través de la vena porta abierta.
NOTA: Este pinzamiento asegura que se desvíe la circulación sistémica y se evite el contacto innecesario con componentes sanguíneos residuales/inhibidores. Este paso es opcional, ya que es difícil acercarse a la vena cava superior detrás del tejido hepático agrandado después de una cirugía simulada, pero el acceso es mucho más fácil en ratones hepatectomizados. - Digerir durante aproximadamente 4 min a un caudal de 5 mL/min. A medida que avanza la digestión, busque signos de que el hígado comienza a hincharse y pequeñas secciones claras / transparentes en la superficie del hígado. Además, observe que el hígado adquiere la textura de un trozo de tela húmedo y parece casi empapado (Figura 3E). Pruebe la consistencia tocando cuidadosamente con un hisopo de algodón húmedo.
- Continuar con la perfusión hasta que se pueda observar una marcada diferencia en la textura superficial del hígado. Observe que el hígado asume un color muy claro y una apariencia burbujeante (Figura 3E), y la cápsula de Glisson (es decir, el saco hepático) se separa del parénquima. Detenga el proceso de digestión tan pronto como el hígado haya adquirido estas propiedades, ya que la digestión excesiva puede dañar los hepatocitos. Retire la aguja antes de que el aire entre en el hígado.
NOTA: Por lo general, se necesitan 10-20 ml de tampón de digestión para alcanzar una digestión suficiente. Esto depende del tamaño del animal, la extensión de la hepatectomía, la configuración del tubo y la calidad de la solución de colagenasa. Si es necesario, aumente el tiempo de perfusión en lugar de la velocidad de perfusión. Demasiada presión en el sistema vascular puede hacer que el hígado reviente y el líquido de perfusión/digestión se pierda en el espacio retroperitoneal.
6. Preparación del hígado
- Retire el hígado suavemente de la cavidad abdominal. Tenga mucho cuidado ya que ahora es muy endeble y frágil.
- Agarre el tejido conectivo central entre los lóbulos con fórceps y levántelo ligeramente hacia arriba, usándolo como punto de anclaje.
- Corte todas las conexiones del hígado a otros órganos, retire la vesícula biliar y coloque el hígado en el tampón de preservación helado.
NOTA: Idealmente, la extracción de hepatocitos y el procesamiento posterior deben realizarse inmediatamente para mantener la viabilidad de los hepatocitos. Sin embargo, si es necesario, el hígado puede almacenarse durante un corto período de tiempo a 4 °C (por ejemplo, para el transporte). Este retraso no debe exceder los 30-40 minutos.
7. Extracción de hepatocitos
- Transfiera el hígado a una placa de Petri de 10 cm y agregue 10 ml de Medium E de Williams helado.
- Rompa la cápsula de Glisson con pinzas de punta fina en algunos lugares a lo largo de la superficie del hígado. Agarre una parte central (por ejemplo, tejido conectivo en el hilio hepático) con dos pares de pinzas y separe lentamente, permitiendo que la cápsula se desgarre sin dañar los hepatocitos. Liberar las células agitando suavemente la cápsula (Figura suplementaria S3).
NOTA: Idealmente, el hígado se desgarra fácilmente y libera las células. No aplique fuerza. Un raspador de células puede ayudar a eliminar completamente todas las células y aumentar el rendimiento celular. No corte el hígado en pedazos con tijeras. - Filtrar 5 ml de pulpa hepática a través de un filtro de células de 100 μm en un tubo de 50 ml. Enjuague el filtro con 10 ml de medio fresco helado. Filtre los 5 ml restantes de pulpa a través del filtro celular.
NOTA: Utilice una pipeta serológica de 25 ml para transferir la pulpa hepática con los hepatocitos disociados (Figura 4A). Las pipetas más pequeñas con aberturas más pequeñas aumentan el esfuerzo cortante y dañan irreversiblemente los hepatocitos. - Agregue un total de 30 ml de medio frío para enjuagar la placa de Petri, filtre y agregue la suspensión al tubo de 50 ml hasta que esté llena. Todas las células aisladas están ahora en suspensión (Figura 4B).
Figura 4: Purificación por centrifugación suave . (A) Homogeneizado hepático que queda después de la etapa de extracción. (B) Vista microscópica (aumento de 20x) del homogeneizado; Tenga en cuenta la marcada contaminación con escombros. (C) Pasos de centrifugación de purificación y (D) vistas microscópicas de los sobrenadantes que deben desecharse. (E) Vista microscópica de la fracción de hepatocitos purificada. Barras de escala = 100 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
8. Aislamiento de hepatocitos
- Girar a 50 × g durante 5 min a 4 °C (menor aceleración y menor frenado posible).
NOTA: Los hepatocitos son más densos que las células hepáticas no parenquimatosas. Debido a la baja fuerza de centrifugación, solo los hepatocitos se peletan, mientras que otras células (por ejemplo, células inmunes, eritrocitos y células sinusoidales) permanecen en el sobrenadante. - Aspire la mayor parte del sobrenadante, dejando 1 ml para resuspender las células girando suavemente el tubo.
- Añadir 40 ml de medio E de Williams frío y girar de nuevo a 50 × g durante 10 min a 4 °C (baja aceleración, freno bajo) para eliminar aún más los hepatocitos muertos y los restos celulares y los hepatocitos viables y grasos de pellets (Figura 4C).
- Deseche la mayor parte del sobrenadante, dejando 1 ml para resuspender las células girando el tubo.
- Añadir 40 ml de medio E de Williams frío y girar de nuevo a 50 × g durante 5 min a 4 °C (baja aceleración, bajo freno).
- Aspire la mayor parte del sobrenadante, dejando 1 ml para resuspender las células girando suavemente el tubo.
NOTA: No detenga este proceso hasta que las celdas estén fijadas o analizadas. Los hepatocitos son muy frágiles y cualquier retraso en el proceso de perfusión, digestión y purificación puede dañar las células. - Determinar la concentración celular final después de la adición de azul de tripano, utilizando una cámara de conteo mejorada con Neubauer.
NOTA: La mayoría de los desechos y células no parenquimatosas ahora se han eliminado, lo que resulta en un pellet limpio de aproximadamente 10-15 × 106 hepatocitos que quedan después de la hepatectomía al 70%. - Dependiendo de la concentración deseada, agregue más medio helado. Utilice la suspensión de células de hepatocitos para cualquier análisis posterior o inicie un cultivo celular primario.
NOTA: En esta etapa, solo quedan unas pocas células inmunes y no parenquimatosas (<5%) en la suspensión. Si se desea una purificación adicional, realice una selección negativa de células CD31+ y CD45+ mediante clasificación celular activada magnética o fluorescente (MACS/FACS). Hasta la fecha, no existe un marcador de superficie confiable y robusto para las células del parénquima hepático.
9. Preparación de los hepatocitos aislados para citometría de flujo
- Centrifugar los hepatocitos a 100 × g durante 5 min.
- Deseche el sobrenadante y agregue la cantidad deseada de tampón de citometría de flujo, dependiendo de la concentración de la suspensión celular.
- Agregue 1 ml de suspensión celular en un tubo de citometría de flujo. Centrifugar durante 5 min a 100 × g y desechar el sobrenadante.
- Agregue 100-200 μL del colorante de viabilidad verde Alexa Fluor 488 Zombie diluido (concentración 1:400) a las células y agítelas suavemente. Resuspender cuidadosamente los hepatocitos agitando manualmente o usando un mezclador de vórtice a baja velocidad (máximo 2-3) durante 2 s.
NOTA: No utilice puntas de pipeta pequeñas para resuspender las células. Son muy frágiles y el esfuerzo cortante aplicado causa daño y reduce la viabilidad celular. Si el pipeteo no es evitable, utilice una pipeta de 1.000 μL después de cortar la parte más pequeña de la punta para agrandar el diámetro y pipetear las células muy lentamente. - Coloque los tubos sobre hielo o guárdelos a temperatura ambiente, dependiendo de la mancha deseada. Incubar las células durante 20-30 minutos en la oscuridad.
- Agregue 2 ml de tampón de citometría de flujo y lave las células 3x. Centrifugar las células después de cada paso de lavado a 100 × g durante 5 min.
- Añadir 2 ml de tampón de fijación (1:1 4% PFA y PBS). Resuspender cuidadosamente los hepatocitos agitando manualmente o usando un mezclador de vórtice a baja velocidad (máximo 2-3) durante 2 s.
- Fijar las celdas durante 30 min.
- Centrifugar a 100 × g durante otros 5 minutos, desechar el sobrenadante y añadir tampón de citometría de flujo.
NOTA: Las células pueden almacenarse en tampón de citometría de flujo antes del análisis hasta 72 h después del aislamiento.
10. Análisis de hepatocitos con citometría de flujo
- Analice los hepatocitos utilizando un clasificador celular activado por fluorescencia.
NOTA: Considere el tamaño relativamente grande de los hepatocitos y ajuste los voltajes. Comience con un voltaje bajo y no supere los 350 V para la dispersión directa (FSC) y 220 V para la dispersión lateral (SSC).- Ajuste los voltajes para FSC y SSC al tamaño grande estimado de las celdas. Identificar la población de hepatocitos y registrar todos los eventos utilizando SSC-A y FSC-A (Figura 5A).
- Observe que los desechos y las células no parenquimatosas se muestran en la esquina inferior izquierda del gráfico de densidad FSC versus SSC y se excluyen (Figura 5A).
- Como las celdas dobletes pueden afectar el análisis, construya un diagrama de densidad de altura de dispersión lateral (SSC-H) versus área de dispersión lateral (SSC-A) para excluir dobletes, como se muestra en la Figura 5B.
- Seleccione la población final de hepatocitos mediante la activación de las células CD31- (marcador endotelial) y CD45- (marcador inmune) (Figura 5C).
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Representative Results
El TRAS alcanza su punto máximo a las 16 h después de la hepatectomía y desaparece gradualmente 32-48 h después de la hepatectomía estándar, pero persiste más allá de 48 h después de la hepatectomía prolongada. Macroscópicamente, TRAS es fácilmente visible como una tez pálida del remanente hepático (Figura 1F) y se puede observar en ratones hepatectomizados entre 16 h y 48 h después de la cirugía.
El rendimiento final estimado es de 10-15 × 10 6 hepatocitos después de la hepatectomía al 70% y 4-9 × 106 después de la hepatectomía extendida del 86% en ratones, con una viabilidad final media del 78% y 65%, respectivamente. Esto corresponde al porcentaje esperado en comparación con un rendimiento total de 50-70 × 106 de un hígado de ratón entero (Figura 6A, C). Después de las hepatectomías parciales, los hepatocitos muestran un aumento del tamaño celular en comparación con los hígados normales, lo que corresponde a su mayor contenido de lípidos (Figura 6B). La estrategia de compuerta se muestra en la figura suplementaria S4.
Figura 6: Rendimiento de hepatocitos, tamaño celular y viabilidad. (A) Recuento de células de un hígado de ratón entero y de restos 24 h después de la hepatectomía del 70% y 86%. (B) Volumen celular calculado de hepatocitos aislados. Tenga en cuenta el marcado aumento en el tamaño de las células 24 h después de la hepatectomía, tanto para el 70% como para el 86%. (C) Viabilidad celular de hepatocitos aislados después de cada paso del proceso de purificación. La viabilidad se midió mediante citometría de flujo utilizando el colorante de viabilidad verde Alexa Fluor 488 Zombie. Los porcentajes se toman de todos los singletes de hepatocitos. Para la estrategia de compuerta, véanse la figura suplementaria S6 y la figura suplementaria S4. Las barras de error se refieren a desviaciones estándar con n = 6-8/grupo. Abreviaturas: sHx = hepatectomía estándar; eHx = hepatectomía prolongada; sin resección = cirugía simulada. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Se puede observar un aumento del contenido de lípidos en los hepatocitos murinos 24 h después de la hepatectomía parcial por un aumento de la granularidad (Figura 7; para la estrategia de compuerta, ver Figura complementaria S5) u observado directamente por la presencia de vesículas lipídicas dentro de los hepatocitos agrandados (Figura 8 y Archivo Suplementario 1).
Figura 7: Aumento de la granularidad y tamaño celular medido por citometría de flujo. (A) Aumento de la granularidad entre hepatocitos aislados 24 h después de la hepatectomía como marcador indirecto de la presencia de vesículas lipídicas. (B) Histograma que muestre SSC. (C) Los porcentajes representan la fracción de células con alta intensidad granular citoplasmática, medida por la señal SSC. Las barras de error se refieren a desviaciones estándar con n = 6-8/grupo. Abreviaturas: sHx = hepatectomía estándar; eHx = hepatectomía prolongada; sin resección = cirugía simulada; FSC = señal de dispersión directa; SSC = dispersión lateral. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 8: Tinción IV en Sudán como marcador del contenido de grasa de hepatocitos frescos aislados. (A) Hepatocitos de un hígado de ratón entero fresco sin cirugía previa. Aumento del tamaño y contenido de grasa de los hepatocitos 24 h (B) después de la hepatectomía al 70% y (C) 86% de la hepatectomía. Tenga en cuenta la presencia concomitante de hepatocitos esteatósicos más grandes y hepatocitos no esteatósicos más pequeños. Barras de escala = 30 μm (B-D). Las barras de error se refieren a desviaciones estándar con n = 6-8/grupo. Abreviaturas: sHx = hepatectomía estándar; eHx = hepatectomía prolongada; sin resección = cirugía simulada. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Un porcentaje muy bajo de células inmunes y no parenquimatosas permanecen en la suspensión final. La purificación adicional se logra mediante FACS o MACS, si se desea. La selección negativa de células CD31+ y CD45+ por citometría de flujo se utiliza para demostrar y cuantificar las células no parenquimatosas (Figura 5).
Figura 5: Estrategia de activación por citometría de flujo y selección de células parenquimatosas CD31 y CD45. (A) Diagrama de acceso con todos los eventos registrados; Considere el tamaño relativamente grande de los hepatocitos y use voltajes ajustados. No supere los 350 V para FSC y 220 V para SSC. B) Singlete gating. (C) Los hepatocitos se seleccionan mediante células CD31- (marcador endotelial) y CD45- (marcador inmune). Esta selección se puede realizar en un clasificador celular activado por fluorescencia para seleccionar células parenquimatosas para análisis posteriores posteriores, si es necesario; n = 4-5/grupo. Abreviaturas: FSC = dispersión hacia adelante; SSC = dispersión lateral. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Para demostrar la eficacia del protocolo modificado en la retención de células esteatósicas, los hepatocitos se aislaron utilizando el enfoque clásico de gradiente de densidad7 (Figura 9A). A diferencia del procedimiento modificado (Figura 9B), una capa de células grasas era claramente visible en la parte superior del gradiente de densidad. El análisis de las células confirmó una ausencia macroscópica de hepatocitos cargados de lípidos en el pellet después de la centrifugación por gradiente de densidad. En contraste, las células de la capa grasa fueron enriquecidas con hepatocitos esteatósicos y una fracción sustancial de células no parenquimatosas y muertas (Figura 9A). Por lo tanto, el aislamiento clásico priva a la cosecha de células esteatósicas, mientras que este protocolo modificado que omite el gradiente de densidad retiene subpoblaciones cargadas de lípidos, lo que permite la exploración imparcial de la regeneración hepática sin inclinarse hacia los hepatocitos magros.
Figura 9: Rendimientos de hepatocitos esteatósicos siguiendo el protocolo clásico de aislamiento de gradiente de densidad en comparación con el protocolo mejorado. (A) Con el método clásico de purificación de gradiente de densidad (concentración final de solución de gradiente de densidad al 90% en solución salina tamponada con fosfato), los hepatocitos muertos se recogen en una capa celular sobre la solución de gradiente de densidad. (B) Esta capa no solo consiste en células no parenquimatosas y hepatocitos no viables, sino también en hepatocitos grasos, grandes y viables. (C) El pellet obtenido después de la centrifugación por gradiente de densidad contiene hepatocitos magros de menor tamaño y está desprovisto en su mayoría de células esteatósicas. Esta es la fracción "pura" que se aísla con el protocolo clásico. (D) Con el protocolo mejorado, los hepatocitos llenos de lípidos no se pierden y todos los hepatocitos se peletizan. El sobrenadante (E) consiste principalmente en hepatocitos muertos y fragmentados y células no parenquimatosas, mientras que el pellet (F) es una mezcla de hepatocitos de tamaño y contenido lipídicos variables. Barras de escala = 100 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Expediente complementario 1: Protocolos suplementarios. A) Tinción lipídica con Sudán IV; (B) hepatectomía estándar y extendida en ratones. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Figura complementaria S1: Descripción general de la configuración de perfusión. (1) Canular la vena cava inferior. (2) Perfundir el hígado con tampón de perfusión caliente para quelar el calcio. (3) Calentar el tampón de digestión con colagenasas y Ca2+ para disociar las células in vivo. Retire el hígado y (4) guárdelo en un tampón de conservación helado (máximo 30 min). Haga clic aquí para descargar este archivo.
Figura suplementaria S2: Configuración de perfusión. (A) Mesa de perfusión con una boquilla de isoflurano, lámpara de calentamiento de luz roja y tubo de perfusión. Se puede colocar un objeto pesado debajo del tubo para estabilizarlo y reducir el riesgo de desplazamiento. (B) Durante los primeros minutos de la perfusión, algo de sangre saldrá a través de la vena porta y se acumulará en la cavidad abdominal abierta. (C) La pared abdominal se incide en un lado para drenar la sangre. Un hisopo de algodón facilita el drenaje. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Figura suplementaria S3: Cápsula de Glisson. (A) La cápsula de Glisson se rompe con pinzas de punta fina en algunos lugares a lo largo de la superficie del hígado, y las células hepáticas se liberan agitando suavemente la cápsula. (B) El hígado debe desgarrarse fácilmente. (C) El saco hepático vacío (cápsula de Glisson) con hepatocitos liberados en suspensión. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Figura complementaria S4: Estrategia de activación por citometría de flujo para el cribado de viabilidad. (A) Todos los eventos fueron registrados. B) Singlete gating. (C) Tinción viva/muerta con colorante de viabilidad verde Alexa Fluor 488 Zombie. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Figura complementaria S5: Estrategia de activación por citometría de flujo para la medición de granularidad. (A) Todos los eventos fueron registrados. B) Singlete gating. (C) Diagrama de puntos de dispersión lateral (SSC; eje x ) frente a dispersión hacia adelante (FSC; y axis) para analizar los niveles de granularidad. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Figura complementaria S6: Purificación de hepatocitos. A) Pellet de celda después de la primera etapa de centrifugación; Tenga en cuenta la capa grasa en la parte superior del medio. (B) Pellet de hepatocitos después de la segunda ronda de centrifugación. (C) Hepatocitos purificados al final del proceso de purificación. Haga clic aquí para descargar este archivo.
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Discussion
El protocolo publicado proporciona un método fiable y sencillo para aislar un alto rendimiento de hepatocitos murinos normales y esteatósicos para análisis descendentes unicelulares o análisis masivos de células después de la clasificación FACS. La clara ventaja sobre la purificación del gradiente de densidad es que el contenido de lípidos celulares no tiene esencialmente ningún impacto en el rendimiento efectivo de los hepatocitos. Por lo tanto, la fracción de hepatocitos esteatósicos se retendrá e incluirá en los análisis posteriores. Esto no solo es crucial para el estudio de las enfermedades hepáticas esteatogénicas, sino también primordial para cualquier análisis de procesos posteriores a hepatectomías mayores, donde los hepatocitos muestran una esteatosis temporal y espacialmente dinámica dentro de los primeros 2-3 días de regeneración. A pesar de que los análisis (unicelulares) de hepatocitos aislados ya se han realizado después de las hepatectomías 19,20,21, debe suponerse que la población celular analizada estaba, al menos parcialmente, privada de hepatocitos cargados de lípidos y los resultados, por lo tanto, no fueron completamente representativos y sesgados hacia los hepatocitos magros.
Actualmente, la función de TRAS no está completamente aclarada. Por ejemplo, las diferencias espaciales en el contenido de lípidos dentro de los lóbulos hepáticos siguen siendo poco conocidas. Por lo tanto, se necesita un método que permita la detección cuantitativa y cualitativa sin excluir con precisión estas células de los análisis (por ejemplo, para transcriptómica de células individuales, citometría de flujo y metabolómica).
En general, el rendimiento de hepatocitos con este protocolo mejorado es marcadamente superior a otros métodos para el aislamiento de hepatocitos que contienen grasa (por ejemplo, de ratones con esteatohepatitis no alcohólica, NASH) utilizando purificación de gradiente de densidad15. Sin embargo, el rendimiento celular, la viabilidad y el contenido de grasa pueden variar entre las preparaciones. Varios factores parecen ser responsables.
Primero, diferentes lotes de colagenasa o mezclas de colagenasa variarán en su actividad enzimática; Sin embargo, las diferencias de lote a lote no son tan críticas como con las colagenasas tradicionales. Sin embargo, puede ser necesario ajustar la concentración de trabajo. Las diferencias pueden minimizarse aún más mediante un almacenamiento adecuado hasta su uso (liofilizados secos y soluciones madre rehidratadas a -15 a -25 °C) y evitando ciclos repetitivos de congelación-descongelación, pero no pueden eliminarse por completo. Por lo tanto, se recomienda utilizar solo colagenasas de un lote específico para una serie experimental determinada. Además, la actividad enzimática depende de la temperatura a la que el tampón de digestión llega al hígado, con una temperatura óptima entre 35 °C y 37 °C para una mezcla de colagenasas I y II22. Las temperaturas más bajas reducirán la actividad enzimática, mientras que las temperaturas superiores a 50 ° C pueden conducir a la desnaturalización irreversible de la proteína. Pruebe esto por adelantado y optimice las condiciones experimentales ajustando la temperatura inicial del tampón de digestión, la longitud y el diámetro del tubo de plástico y la velocidad de flujo. Por ejemplo, cabe esperar una caída de la temperatura del tampón de hasta 10 °C dentro de una longitud de tubo de 60 cm. Corrija la temperatura usando almohadillas de calentamiento y lámparas infrarrojas, si es necesario. Las colagenasas muestran su capacidad óptima de digestión a un pH de 7,4; por lo tanto, se recomienda ajustar el pH de las soluciones tampón ya a una temperatura de trabajo de aproximadamente 37 °C antes de su uso.
En segundo lugar, es primordial enjuagar el hígado (o todo el ratón) con tampón de perfusión antes de comenzar el proceso de digestión para eliminar posibles inhibidores como el suero o la albúmina. Idealmente, la perfusión se inicia solo después de que la circulación sistémica se haya detenido, para garantizar que el tampón de digestión se mueva solo desde la vena cava a través del hígado hasta la salida a través de la vena porta abierta. La vena cava superior se puede cerrar con una pequeña pinza vascular. Esto evita el contacto con componentes/inhibidores sanguíneos residuales. Otro método para enjuagar de manera óptima el hígado es el pinzamiento intermitente de la vena porta. Esto debe hacerse con cuidado y, una vez que el tampón de digestión ha llegado al hígado, debe realizarse solo una vez para evitar dañar las células ya digeridas.
En tercer lugar, los hepatocitos regeneradores son sensibles, y la experiencia ha demostrado que requieren tiempos de digestión más cortos y un manejo más cuidadoso para evitar la digestión excesiva y el daño a las células. Para cosechar el hígado lo más suavemente posible, se recomienda agarrar el hilo hepático con una pinza y luego, primero cortar la vena cava superior y liberar el hígado de las conexiones a la vena y el diafragma. Posteriormente, se puede cortar la vena cava inferior y la vena porta, lo que permite la movilización del hígado y lo libera fácilmente de los ligamentos gastrointestinales, el esófago por un lado y el riñón derecho por el otro lado. En ratones hepatectomizados, es posible agarrar cuidadosamente una de las ligaduras de los lóbulos medianos para extirpar el hígado. Si se intenta extraer el hígado por la fuerza, la cápsula de Glisson puede romperse y las células aisladas podrían perderse.
Finalmente, es esencial que el procedimiento de perfusión y el procesamiento posterior de los hepatocitos no se interrumpan o retrasen, ya que esto afectará inmediata e inevitablemente la viabilidad. Idealmente, la perfusión se realiza en un equipo de al menos dos personas y en un animal a la vez. Estos requisitos de tiempo y mano de obra, sin embargo, son una de las limitaciones de este método, aunque esto también se aplica a los métodos alternativos.
Otra limitación es la pureza final de la suspensión celular resultante, ya que la ventaja de no perder hepatocitos esteatósicos a un gradiente de densidad da como resultado una pequeña proporción de células no parenquimatosas y/o inmunes restantes. En la muestra mostrada, la fracción de CD45+ (células inmunes) y CD31+ (células endoteliales) está por debajo del 5%, y al seleccionar el tamaño celular primero durante la citometría de flujo, los porcentajes de CD45+ y CD31+ son 1.2% y 2.2%, respectivamente (Figura 5). Para la mayoría de las aplicaciones, este nivel de pureza es suficiente, pero los métodos altamente sensibles o el uso posterior en cultivos celulares primarios probablemente requieren un grado más alto. Numerosos estudios han utilizado CD31 y CD45 como marcadores sistémicos para clasificar las poblaciones de células hepáticas por MACS 23,24 o FACS25.
Este método de aislamiento mejorado es ideal para el estudio de la regeneración hepática, particularmente el período temprano que se presenta con cantidades significativas de hepatocitos esteatósicos. PHLF, con esteatosis persistente, es un tema particularmente relevante que requiere investigación. Después de hepatectomías prolongadas que dejan restos marginales, PHLF puede desarrollarse y, de hecho, representa la causa más común de muerte debido a la cirugía hepática. Su patobiología es sólo parcialmente comprendida, y actualmente no hay tratamiento disponible26. Dado que PHLF limita significativamente la aplicación de la cirugía hepática (como para la curación de neoplasias hepáticas), explorar sus causas e identificar posibles medidas es una clara necesidad médica.
También existe la necesidad de estudiar las enfermedades que comparten la esteatosis hepática como punto de partida. Un ejemplo destacado es la enfermedad del hígado graso no alcohólico (NAFLD), que puede progresar a NASH y, finalmente, a carcinoma hepatocelular (CHC)27. La propagación de estilos de vida sedentarios junto con la dieta occidental ha llevado a una epidemia mundial de NAFLD y, en consecuencia, se prevé que la incidencia de CHC aumente28,29. La esteatosis, a su vez, también está estrechamente relacionada con la obesidad, el síndrome metabólico y la diabetes tipo 2, todas ellas enfermedades con una incidencia creciente30. Por lo tanto, la esteatosis representa una carga creciente para el sistema de salud actual, que requiere medios efectivos para su gestión. Este método mejorado de perfusión de colagenasa de dos pasos permite el estudio de hepatocitos esteatósicos a nivel unicelular y, por lo tanto, debería ayudar a explorar las causas y consecuencias de la acumulación de lípidos hepatocelulares.
Este protocolo presenta una técnica fácil, rápida y fiable para el aislamiento in vivo de hepatocitos regeneradores de ratones tras hepatectomía parcial (70%) y prolongada (86%). Este enfoque no se basa en la purificación por gradiente y se puede utilizar para investigar los procesos de regeneración hepática con la inclusión de hepatocitos cargados de lípidos que generalmente se pierden durante los protocolos de aislamiento tradicionales. Además, este método también se puede aplicar para la investigación de diversas enfermedades hepáticas asociadas con cambios esteatósicos y no se limita a las especies de ratones.
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Disclosures
Los autores declaran que no tienen intereses contrapuestos.
Acknowledgments
Este estudio fue apoyado por el Fondo Nacional Suizo (subvención del proyecto 310030_189262).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Alexa Fluor 488 Zombie green | BioLegend | 423111 | Amine-reactive viability dye |
| Attane Isoflurane ad us. vet. 99.9% | Provet AG | QN01AB06 | CAUTION: needs ventilation |
| EDTA solution | Sigma-Aldrich | E8008-100ML | - |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | V001229 | Dilute with water to 70% |
| Fetal bovine serum (FCS) | Gibco | A5256701 | - |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS), Ca2+, Mg2+, phenol red | Sigma-Aldrich | H9269-6x600ML | For digestion/preservation |
| Hanks' Balanced Salt solution (HBSS), w/o Ca2+, w/o Mg2+, no phenol red | Sigma-Aldrich | H6648-6x500ML | For perfusion buffer |
| HEPES solution, 1 M | Sigma-Aldrich | 83264-100ML-F | - |
| Histoacryl tissue adhesive (butyl-2-cyanoacrylate) | B. Braun | 1050052 | For stabilization of cannulation site |
| Hoechst 33258 Staining Dye Solution | Abcam | ab228550 | - |
| Liberase Research Grade | Roche | 5401119001 | Lyophilized collagenases I/II |
| NaCl 0.9% 500 mL Ecotainer | B. Braun | 123 | - |
| Paralube Vet Ointment | Dechra | 17033-211-38 | - |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Gibco | A1286301 | - |
| Sudan IV – Lipid staining | Sigma-Aldrich | V001423 | - |
| Temgesic (Buprenorphine hydrochloride), Solution for Injection 0.3 mg/mL | Indivior Europe Ltd. | 345928 | Narcotics. Store securely. |
| Trypan blue, 0.4%, sterile-filtered | Sigma-Aldrich | T8154 | For cell counting |
| Williams’ Medium E | Sigma-Aldrich | W4128-500ML | - |
| Materials | |||
| 25 mL serological pipette, Greiner Cellstar | Merck | P7865 | - |
| 50 mL Falcon tubes | TPP | - | - |
| BD Neoflon, Pro IV Catheter 26 G | BD Falcon | 391349 | - |
| Cell scraper, rotating blade width 25 mm | TPP | 99004 | - |
| Falcon Cell Strainer 100 µm Nylon | BD Falcon | 352360 | - |
| Fenestrated sterile surgical drape | - | - | Reusable cloth material |
| Filling nozzle for size 16# tubing (ID 3.1 mm) | Drifton | FILLINGNOZZLE#16 | To go into the tubes |
| Flow cytometry tubes, 5 mL | BD Falcon | 352008 | - |
| Male Luer to Barb, Tubing ID 3.2 mm | Drifton | LM41 | Connection tube to syringe |
| Petri dishes, 96 x 21 mm | TPP | 93100 | - |
| Prolene 5-0 | Ethicon | 8614H | To retract the sternum |
| Prolene 6-0 | Ethicon | 8695H | For skin suture |
| Prolene 8-0 | Ethicon | EH7470E | Ligature gall bladder |
| Tube 16#, WT 1.6 mm, ID 3.2 mm, OD 6.4 mm | Drifton | SC0374T | Perfusion tube |
| Equipment | |||
| BD LSRFortessa Cell Analyzer Flow Cytometer | BD | - | - |
| Isis rodent shaver | Aesculap | GT421 | - |
| Isofluran station | Provet | - | - |
| Low-speed centrifuge – Scanspeed 416 | Labogene | - | - |
| Neubauer-improved counting chamber | Marienfeld | - | - |
| Oxygen concentrator – EverFlo | Philips | 1020007 | 0 – 5 L/min |
| Pipetboy – Pipettor Turbo-Fix | TPP | 94700 | - |
| Shenchen perfusion pump – YZ1515x | Shenchen | YZ1515x | - |
| Surgical microscope – SZX9 | Olympus | - | - |
| ThermoLux warming mat | Thermo Lux | - | - |
| Vortex Genie 2, 2700 UpM | NeoLab | 7-0092 | - |
| Water bath – Precision GP 02 | Thermo scientific | - | Adjust to 42 °C |
References
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