Summary
Her præsenterer vi en metode til at få billeder af tarmen ved laserinduceret sår. Ved at udsætte musetarmen for en multifotonlaser induceres tabet af en enkelt eller flere krypter lokalt. Ved gentagne gange at afbilde det beskadigede område over måneder fanges realtidsdynamikken i tarmgendannelse.
Abstract
Undersøgelse af tarmgendannelse in vivo er en udsøgt teknisk udfordring. Mangel på langsgående billeddannelsesprotokoller har forhindret dybere indsigt i celle- og vævsskaladynamikken, der orkestrerer tarmregenerering. Her beskriver vi en intravital mikroskopimetode, der lokalt inducerer vævsskader på enkelt kryptskala og følger tarmepitelets regenerative respons hos levende mus. Enkelte krypter eller større tarmfelter blev ableret af en højintensiv multifoton infrarød laser på en tids- og rumstyret måde. Efterfølgende langvarig gentagen intravital billeddannelse muliggjorde sporing af de beskadigede områder over tid og muliggjorde overvågning af kryptdynamik under vævsgendannelse over en periode på flere uger. Krypt remodeling begivenheder såsom krypt fission, fusion, og forsvinden blev observeret i det nærliggende væv ved laser-induceret skade. Denne protokol muliggør undersøgelse af kryptdynamik både i homeostatiske og patofysiologiske indstillinger, såsom aldring og tumorinitiering.
Introduction
Tarmens epitelforing udfordres konstant af mavesyrer, toksiner og mikrobiota, der kan forårsage forstyrrelse af epitelbarrieren. Tarmstruktur og vævsorganisation er specialiseret til konstant selvfornyelse og reparation af skader. Tyndtarmens enkeltlags epitel er organiseret i krypt-villus enheder1. I homeostase giver selvfornyende Lgr5+ tarmstamceller, der befinder sig i bunden af krypten, anledning til differentieret afkom. De differentierede datterceller rejser til spidsen af villusaksen på transportbåndsmåde, hvor de kastes, så tarmforingen genopfyldes på 3-5 dage 2,3. På lang sigt bidrager ikke alle Lgr5+-celler lige meget til vævsfornyelsen, da dette også afhænger af cellernes evne til at bevæge sig mod transportbåndet mod kryptens bund (dvs. retrograd bevægelse)4,5. Ved ablation af Lgr5+ celler ved for eksempel stråling bevæger stamceller uden for kryptens bund sig faktisk ind i basen for at dedifferentiere og genopbygge stamcellepuljen 6,7,8.
Akut betændelse kan forårsage tab af Lgr5+ stamceller 9,10. Ud over stamcelletab kan mange eksterne faktorer forårsage akut skade på epitelet på kryptskalaen. Stråling, kemiske behandlinger og antibiotika har vist sig at skade tarmkrypter og villi11. Større felter af krypter og villi kan blive påvirket af bakterielle, virale og parasitære infektioner12. Tarmen har en bemærkelsesværdig evne til at komme sig efter indre og ydre skader på kryptskala ved kryptfission (en opdeling af en krypt i to)13. Ved såret gennemgår krypter i området ved siden af skaden fission for at genopbygge kryptnumrene. Dette fænomen forekommer også, men i mindre grad, under homeostase14,15. For at opveje en potentiel stigning i kryptantallet under homeostase kan krypter også smelte sammen (fusionere to krypter til en)16,17. Hvorvidt kryptfusion også spiller en rolle i genoprettelsen af kryptnumre efter sår er ukendt. Desuden mangler dynamikken og de lovgivningsmæssige faktorer i denne proces stadig at blive belyst.
Skademodeller er uundværlige for at studere vævsregenerering in vivo. Forskellige skademodeller er blevet brugt til at studere tarmvævsregenerering. Tidligere eksperimentelle strategier anvendte højdosisstråling til at nedbryde stamcellepuljer18 eller behandling med dextransulfatnatrium (DSS) for at fremkalde kronisk og akut colitis og krypttab hos mus19,20. Enkeltcelleablation ved genetiske eller optiske midler er blevet brugt til at forfine vævsskade og betragtes som et attraktivt værktøj til at adskille stam- og stamcellers rolle 21,22 og studere vaskulær regenerering23. Derudover er der udviklet et biopsiskadesystem til at fremkalde skader i større felter med flere krypter og villi24. Det er vigtigt, at svaret på den skadelige fornærmelse kan variere langs tarmens proksimale-distale akse, som rapporteret for stråling, hvilket forårsagede mere skade i tyndtarmen end i tyktarmen25. Dette understreger behovet for målrettede metoder, der styrer både omfanget af den skadelige fornærmelse og dens lokalisering i tarmkanalen.
Skadens omfang og helbredelse er traditionelt blevet vurderet ved hjælp af statiske midler, som giver begrænset information om dynamikken i vævsgendannelse. Intravital mikroskopi (IVM) har åbnet unikke muligheder for at kvantificere stamcelleadfærd, epitelremodellering og regenerering i mange organer 26,27,28,29,30 og har givet effektiv indsigt i tarmbiologi 4,5,21,31,32,33,34, 35,36.
Her beskriver vi en metode til at forårsage rumligt tidsmæssigt definerede tarmskader og fange genopretningen af tarmepitelforingen. Vi bruger to fotonbaserede laserablation til at beskadige tarmkrypter og følger det øjeblikkelige sårrespons og langsigtet genopretning ved gentagen intravital mikroskopi. Vores protokol gør det muligt at kortlægge den regenerative remodellering af tarmvævsarkitekturen som reaktion på lokal vævsskade. Kryptdynamik, herunder fissions- og fusionsbegivenheder, kan let kvantificeres og spores over tid. Anvendelsen af laserablation og gentagen intravital billeddannelse kan bruges som en platform til at undersøge vævsskaladynamikken i tarmarkitekturen under homeostase og patofysiologi, såsom tumorinitiering.
Protocol
Alle dyreforsøg beskrevet i denne undersøgelse blev udført i overensstemmelse med retningslinjerne og godkendelsen fra dyrevelfærdsorganet (AWB) fra det nederlandske kræftinstitut (NKI).
BEMÆRK: Kontakt instituttets dyreetiske komité, før du udfører dyreforsøg.
1. Forberedelse til operation og intravital billeddannelse
- Prækirurgiske behandlinger
- Inducer 8-12 uger gamle K19-CreERT237: Rosa26-mTmG 38 og Lgr5eGFP-IRES-CreERT218: Rosa26-Confetti39 mus ved at injicere tamoxifen opløst i solsikkeolie intraperitonealt 4-6 uger før operationen (figur 1).
- Påfør analgesi. Injicer 200 μL buprenorphin (0,1 mg/kg legemsvægt) fortyndet i NaCl 0,9 % pr. 30 g mus subkutant 30 minutter før operationen. Administrer carprofen (0,067 mg/ml) i en flaske indeholdende 125 ml ikke-syrnet autoklaveret drikkevand 24 timer før operationen. Alternativt kan du administrere en carprofeninjektion subkutant (5 mg/kg) 30 minutter før operationens start.
- Forberedelse til operation
- Indfør autoklaverede sterile kirurgiske værktøjer i biohazard-kabinettet.
- Tænd for varmepuden, og indstil temperaturen til 37 °C.
- Forberedelse til intravital billeddannelse
- Tænd mikroskopets temperaturstyrede kammer mindst 4 timer før billeddannelse for at give tilstrækkelig tid til temperaturstabilisering.
BEMÆRK: Den nødvendige tid kan variere afhængigt af den anvendte maskine. - Hold temperaturen inde i klimakammeret stabil ved 37 °C.
- Tænd for to-fotonmikroskopet, scanneren og laseren.
- Start billedbehandlingssoftwaren.
- Indstil laserens bølgelængde til 960 nm, og åbn lukkeren.
- Tænd mikroskopets temperaturstyrede kammer mindst 4 timer før billeddannelse for at give tilstrækkelig tid til temperaturstabilisering.
2. Kirurgi og intravital billeddannelse
- Kirurgisk eksponering af tarmen
- Bedøv musen med 2% -3% isofluran og læg den på en varmepude, dækket af en steril klud. Kontroller dybden af anæstesi ved at vurdere hyppigheden og kvaliteten af vejrtrækning (et åndedræt / sekund) og ved at kontrollere musens refleks.
- Dæk musens øjne med øjensalve.
- Der injiceres 200 μL forvarmet sterilt saltvand subkutant.
- Barber maven og fjern håret. Skift den sterile klud i det kirurgiske område.
- Indsæt en rektal sonde for at overvåge musens temperatur.
BEMÆRK: Temperaturen skal være ca. 37 °C. - Tag et nyt par sterile handsker på.
- Rengør det kirurgiske område på en cirkulær måde med skiftevis skrubber af antiseptisk opløsning efterfulgt af 80% ethanol tre gange. Fjern overskydende ethanol med en steril vatpind.
BEMÆRK: Det er vigtigt at overvåge musen for hypotermi på dette tidspunkt. - Dæk musen med en steril kirurgisk drapering.
- Kontroller musens refleks.
- Lav et ~ 10 mm lodret midterlinjesnit gennem huden ved hjælp af en steril skalpel.
- Skær linea alba ved hjælp af en saks til at adskille rectus abdominis muskler og åbne maven.
- Find musens cecum ved hjælp af sterile vatpinde gennemblødt i sterilt forvarmet saltvand for at bruge det som referencepunkt.
- Lav et lille snit i et stykke sterilt gasbind, våd det i forvarmet sterilt saltvand, og læg det over snittet.
- Tag tarmen ud med sterile vatpinde gennemblødt i forvarmet sterilt saltvand. Hold tarmen hydreret ved at tilføje sterilt forvarmet saltvand.
- Placer et sterilt specialfremstillet billedkammer ved siden af musen.
- Overfør musen til den forvarmede sterile billedbehandlingsboks.
- Placer tarmen på billeddannelsesboksens sterile glas. Anbring musens hoved i billeddannelsesrøret som vist i figur 1.
- Fastgør om nødvendigt musen med steril fleksibel film og tape.
- Placer billeddannelsesboksen, der indeholder musen, i mikroskopkammeret.
- Intravital billeddannelse
- Overvåg musen under billeddannelse ved at kontrollere hyppigheden og dybden af vejrtrækning og temperatur via en rektal sonde hvert 15. minut. Procentdelen af isofluran bør holdes mellem 1 % -2 %. Juster om nødvendigt.
- Find en region i tarmen ved hjælp af mikroskopets okular.
- Få et vidvinkelbillede af interesseområdet ved hjælp af mikroskopets interne kamera, som det ses i figur 2A.
- Billede af interesseområdet ved hjælp af 960 nm laser af multifotonmikroskopet. Juster lasereffekten og bølgelængden i henhold til de fluoroforer, der blev brugt i eksperimentet.
- Få en 10-20 trin z-stak på 3 μm af interesseområdet.
- Laser ablation
- Vælg en enkelt placering eller flere placeringer fra det felt, der blev afbildet tidligere.
- Brug blegemiddelpunktkalibreringsfunktionen i billedbehandlingssoftwaren med en zoom på 32 og 124 x 124 pixel med en scanningshastighed på 400 Hz ved hjælp af tovejsscanningsegenskaben i 3-10 sekunder, afhængigt af størrelsen af den skade, der sigtes mod. Indledningen af skader i kryptområdet kan genkendes ved en stigning i autofluorescens i både de grønne og røde kanaler.
- Gentag de to foregående trin for flere områder i den samme mus.
- Efter ablation skal du erhverve z-stakke af de beskadigede områder for at bekræfte placeringen og omfanget af skaden.
- Lukning af det kirurgiske sted
- Placer musen, mens den stadig er under anæstesi, i et sterilt sutureringsområde.
- Indsæt den udsatte tarm tilbage i maven ved hjælp af sterile vatpinde gennemblødt i forvarmet sterilt saltvand.
- Sutur linea alba ved at udføre en simpel kontinuerlig sutur ved hjælp af en absorberbar 5-0 sutur. Luk suturens ekstremiteter med kirurgiske knuder.
- Gentag det samme trin med hudlaget.
- Sluk for isofluranstationen, og rengør og steriliser billedbehandlingsboksen og indlægget.
- Rengør kirurgiværktøjerne med det kirurgiske instrumentrensemiddel, enzymatiske rengøringsmiddel og smøremiddel til kirurgiske instrumenter. Når det er tørret, steriliseres kirurgiværktøjerne sammen med operationsboksen i autoklaven.
- Pleje efter operationen
- Lad musen komme sig efter operationen, mens buret placeres på varmepuden i ~ 1 time.
BEMÆRK: Placer musen sammen med andre burkammerater, hvis det er muligt. Ensomme boliger er ikke nødvendige for genopretning. - Kontroller musens temperatur hvert 15. minut under genopretning.
- Der injiceres 200 μL buprenorphin (0,1 mg/kg legemsvægt) fortyndet i NaCl 0,9 % pr. 30 g mus subkutant 6-12 timer efter operationen.
- Indgiv carprofen (0,067 mg/ml) i en flaske indeholdende 125 ml ikke-syrnet autoklaveret drikkevand i 72 timer efter operationen.
- Vej musen og overvåg velfærden hver dag i 1 uge efter operationen.
- Lad musen komme sig efter operationen, mens buret placeres på varmepuden i ~ 1 time.
3. Gentagen kirurgi og intravital billeddannelse
- Kirurgi
- På det andet tidspunkt (mindst 1 uge efter den første billedbehandlingssession) gentages trin 1.1.2, 1.2, 1.3 og 2.1.
- Intravital billeddannelse
- Gentag trin 2.2.1-2.2.3.
- Brug mønsteret af blodkar til at finde de samme interesseområder afbildet på det første tidspunkt.
- Gentag trin 2.2.4 og 2.2.5.
- Lukning af det kirurgiske sted
- Gentag trin 2.4.1.
- Hvis musen ikke er beregnet til at blive afbildet på et andet tidspunkt, skal du ofre musen ved at udføre cervikal dislokation under terminal anæstesi. Ellers skal du fortsætte med næste trin.
BEMÆRK: I henhold til retningslinjerne i EU-direktiv 2010/63/EU, bilag IV, er cervikal dislokation en acceptabel metode. - Gentag trin 2.4.2-2.4.6.
- Pleje efter operationen
- Gentag trin 2.5.1-2.5.5.
Representative Results
For at demonstrere den type resultater, der kan opnås ved laserablationsmetoden kombineret med intravital billeddannelse, udførte vi et eksperiment som vist i figur 1. Først injicerede vi K19-CreERT2;mTmG (K19cre-mTmG) og Lgr5eGFP-IRES-CreERT2; Rosa26-Confetti (Lgr5cre-Confetti) mus med tamoxifen til stokastisk mærkning af celler med en af konfettifarverne (eller grønt fluorescerende protein [GFP] i tilfælde af mTmG-mus). K19-cre inducerer afstamningssporing fra alle epitelceller, mens Lgr5-cre kun inducerer sporing fra stamceller 8,18,37. Tamoxifeninjektionen blev administreret 4-6 uger før operationen og den første billeddannelsessession for at opnå krypter, hvor alle cellerne er monoklonale for en bestemt farve. Robust identifikation af de samme vævsområder over flere uger er afgørende for at spore skæbnen for de samme krypter over tid. Iboende vævsarkitektoniske træk, såsom vaskulaturen, kan bruges som pålidelige vævsmærker og blev her optaget med mikroskopets interne kamera. Derudover hjalp mærkning af en lille brøkdel af krypter med (mindst to) forskellige farver med at genkende de samme krypter i hver billedbehandlingssession og følge deres adfærd under den regenerative proces efter laserskader. Ved kirurgisk eksponering af musens tarm og erhvervelse af både kamera- og fluorescerende billeder af interesseområdet (figur 2A) kan blegemiddelpunktindstillingerne for multifotonlaseren bruges til at ablate en eller flere krypter (figur 2B, C). Indledningen af skader kunne genkendes ved en stigning i autofluorescens i både de grønne og røde kanaler. For at studere dynamikken i kryptgendannelse blev operationen og billeddannelsesproceduren gentaget uger / måneder efter den første billeddannelsessession, og vævets iboende strukturer (vaskulatur og mønstre af klonalt mærkede krypter) blev brugt som vartegn for at finde nøjagtig samme placering af skaden (figur 2). Når denne metode blev anvendt i Lgr5Cre-konfettimus, hvor Lgr5-eGFP udtrykkes på en ujævn måde, kunne ændringer i kryptantal og former efter den laserinducerede skade fanges (figur 3). Mens nogle regioner ikke viste nogen ændringer i antallet og strukturen af krypter (figur 3B), viste andre regioner omfattende kryptombygning, som det ses i antallet af kryptfissions- og fusionshændelser (figur 3C) og tabet af krypter 2 uger efter den laserinducerede skade (figur 3D). Ved at introducere forskellige størrelser af skader og kvantificere fissions-, fusions- og forsvindingshændelser efter ablation, som i eksemplet vist i (figur 3E), kan dynamikken i skadeinduceret regenerering kortlægges i forskellige musemodeller.
Figur 1: Skematisk gengivelse af den eksperimentelle opsætning. In vivo-mærkning af tarmceller opnås ved at injicere tamoxifen intraperitonealt i genetisk modificerede musemodeller for at inducere Cre-medieret rekombination i tarmkrypter. Efter dage eller uger (når krypterne er monoklonale for en bestemt farve) udsættes tarmen kirurgisk og udsættes for laserablation ved hjælp af et multifotonmikroskop med et temperaturstyret kammer. Omfanget af kryptskader karakteriseres umiddelbart efter ablation, og musen får lov til at komme sig efter proceduren. Gentagen kirurgisk eksponering og IVM bruges til at overvåge intestinal genopretning over tid. Mønsteret og fordelingen af blodvaskulaturen og forskelligt farvede krypter bruges til at finde tilbage de samme regioner uger eller måneder efter ablation. Krypt remodeling (fx fission eller fusion) kan observeres på skadestedet uger efter ablation. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Langsgående billeddannelse af vævsregenerering ved laserinduceret skade i tarmen. Når tarmen er placeret på nøjagtig samme måde, kan tarmens blodkar bruges som et kort til at finde og afbilde nøjagtigt de samme regioner. (A) Kameraoversigtsbilleder af tarmen. Stiplede hvide linjer repræsenterer mønsteret af vaskulaturen ved siden af skadestedet (hvid boks), der bruges som et vartegn for at finde det samme laserablerede område på et andet tidspunkt. De nederste to billeder viser den hvide boks, der er zoomet ind på. Pilen viser det nøjagtige sted for laserablation på dag 1 og 1 måned senere. (B) Fluorescerende billeder af en enkelt kryptskade fanget af multifotonmikroskop. Pilen i den blå boks viser skadestedet på dag 1 og 1 måned senere. (C) Fluorescerende billeder af et beskadiget kryptfelt. Pilene i den blå boks markerer skadeområdet på dag 1 og 1 måned senere. Skalastænger: 1 mm (A, øverst); 0,25 mm (A, bund); 200 μm (stort overblik B og C); og 50 μm (zoomede billeder B og C). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Intravital billeddannelse af kryptskæbner efter laserablation. (A) Ved hjælp af konfettimodellen kan krypter mærket med forskellige farver følges over tid for at kortlægge dynamikken i genopretning. Den hvide pil viser stedet for laserablation. Den gule boks repræsenterer en naboregion (<100 μm fra skadestedet), mens de blå og lilla kasser repræsenterer regioner langt (>100 μm) fra det laserablerede område. Forskellige former for regenerering observeres. (B) Nogle regioner forbliver uændrede som i den lilla boks. (C) Andre regioner udviser krypt remodeling i form af krypt fission eller fusion; De stiplede hvide linjer og pile skildrer kryptfissionsbegivenheder, og de orange stiplede linjer og pile skildrer kryptfusionsbegivenheder. (D) I nogle regioner observeres kryptens forsvinden, som i den gule boks, hvor krypten fremhævet med en orange stiplet linje forsvandt. (E) Et eksempel på kvantificering, der viser antallet af kryptoombygningshændelser, der er observeret i de tilstødende områder (dvs. mindre end 100 μm) og langt fra (dvs. mere end 100 μm) skadestedet. Skalastænger: 200 μm (A); 50 μm (B-D). Klik her for at se en større version af denne figur.
Discussion
Denne protokol kombinerer mikroskopisk laserablation og langsgående intravital mikroskopi for at følge tarmregenerering fra tidlig skaderespons til langsigtet vævsremodellering. Teknikken er etableret i streng overholdelse af etiske overvejelser for at inducere og afbilde mikroskopisk laserablation, og når den følges nøjagtigt, vil den opretholde dyrenes velbefindende. Under operationen er det vigtigt at sikre, at tarmens integritet er godt bevaret. Dette kan opnås ved forsigtigt at håndtere vævet med sterile våde vatpinde, som forhindrer blødning eller udtørring af vævet. Omfanget af laserinduceret mikroskopisk skade bør også vurderes nøje ved at afbilde de forskellige tarmlag i området efter laserablation. Hvis forskeren ønsker at tilpasse hyppigheden af de forsøgstrin, der er beskrevet i denne protokol, bør instituttets dyreetiske komité høres før forsøget for at fastslå konsekvensen for velfærden.
Gentagen intravital mikroskopi gør det muligt at overvåge vævsgendannelse i samme mus over tid. Gentagen kirurgisk eksponering af tarmen giver let optisk adgang til hele tarmkanalen. Vævets iboende egenskaber, såsom vaskulaturen, tjener som landemærker til at identificere de samme tarmområder i hver billeddannelsessession. Således kan det samme vævsområde afbildes over flere uger, hvilket gør det muligt at kvantificere langsigtet vævsregenerering i det samme tarmområde i den samme mus. Den rumlige tidsmæssige kontrol, der tilbydes af den kombinerede kirurgi og billeddannelsesmetode, giver den fordel, at det samme organ kan afbildes under både homeostatiske og regenererende forhold i den samme mus, hvilket står i modsætning til tidligere helorganskademodeller, hvor kontroller og regenererende prøver stammer fra forskellige mus 11,12,18,19,20 . Derfor minimerer vores eksperimentelle indstilling det nødvendige antal dyr, der er nødvendige for eksperimentet, og reducerer variationen inden for dyrene.
Protokolfejlfinding bør starte med en gennemgang af muse- og tarmhåndteringsteknikken og en kontrol af mikroskopiudstyr og indstillinger. Der er mange kritiske trin i denne protokol, der kræver ekstra opmærksomhed. For det første skal alt arbejde udføres i et rent sterilt miljø ved hjælp af aseptisk teknik for at sikre dyrenes trivsel og vedvarende høje datakvalitet, og musetemperaturen skal opretholdes under operationen og hver billeddannelsessession. Det er vigtigt at holde vævet hydreret med sterilt, forvarmet saltvand under billeddannelse og forhindrer vævsfibrose.
For at sikre, at eksperimentet udføres på en reproducerbar måde, er det vigtigt at justere laserne før brug for optimal erhvervelse og at måle multifotonlaserens effekt i begyndelsen af hver session. Parametre som typen af mål, forstørrelse, boligtid, lasereffekt og bølgelængde har indflydelse på omfanget af mikroskopisk laserablation og bør overvejes. I denne undersøgelse udføres både laserablation og billeddannelse med en lasereffekt på 1,2 W (ud af linsen) ved en 960 nm bølgelængde gennem et Fluotar VISIR 25x / 0,95 VANDMÅL. Ændring af bølgelængden eller optiske scanningsegenskaber påvirker omfanget af mikroskopiske skader. En lavere bølgelængde (såsom 840 nm) oversættes til fotoner med højere energi og ofte i et højere output fra laseren og kan øge mikroskopisk skade. En højere zoom resulterer i mere energi pr. region og derfor mindre tid til at ablate krypter og omvendt. Pixelboligtiden kan også øges eller formindskes for at ændre ablationshastigheden og omfanget af skaden. Når det afbildede væv ikke er stabilt (f.eks. På grund af peristaltiske bevægelser), skal ablation udføres hurtigt. Til dette formål bør ablationshastigheden optimeres ved f.eks. at øge zoom- og/eller laseroutputtet.
At finde den samme tarmregion over flere billeddannelsessessioner er et andet kritisk trin, der skal udføres korrekt for at sikre eksperimentets succes. For at gøre dette skal tarmen placeres på nøjagtig samme måde på alle tidspunkter. Vi anbefaler altid at bruge cecum som referencepunkt for at finde de samme regioner i tynd- og tyktarmen. Forsigtigt at strække vævet af interesse med vatpinde sikrer, at interesseområdet er inden for rækkevidde af den objektive arbejdsafstand og maksimerer antallet af regioner, der kan spores tilbage. Derudover anbefaler vi, at du altid ablaterer og afbilder flere mikroskopiske positioner i hver mus for at tage højde for områder, der muligvis ikke er lokaliseret tilbage i en senere billedbehandlingssession. Hvis regionerne ikke kan findes, selvom tarmens placering er korrekt, kan det hjælpe med at omplacere musen og ændre orienteringen af det udsatte område. Sporing af krypter over tid kan være besværligt for eksperimenter, hvor større tarmfelter i flere tilstødende krypter ableres. Sådanne skadelige fornærmelser kan fremkalde vævsombygning ud over epitelmonolaget, hvilket kan kulminere i modifikation af vævsmærkerne, der bruges til sporing af regionen over tid. Valg af landemærker i tilstrækkelig afstand til det beskadigede sted og indfangning af større synsfelter, der overgår det beskadigede område med flere hundrede mikrometer, øger chancen for vellykkede langsigtede eksperimenter. Ud over forkert placering af tarmen på mikroskoptrinnet kan peristaltiske bevægelser i mave-tarmkanalen forstyrre billeddannelsen. Dette problem kan forbedres på to måder. Hvis bevægelsesfrekvensen ikke er for høj, kan processen gentages i samme område med øget eksponeringstid. Alternativt kan højere mængder anæstesi bruges til at mindske peristaltikken. Vi anbefaler, at højere doser isofluran begrænses til korte justeringer. Alt i alt skal billedbehandlingssessionerne holdes så korte som muligt, optimalt under 3 timer, for at sikre hurtig restitution.
Den kombinerede laserablation og langsgående intravital mikroskopi-tilgang har flere fordele sammenlignet med andre skademodeller. Tidligere (kemiske) skadesmodeller manglede evnen til lokalt at begrænse den skadelige fornærmelse 6,11,12,19,20. Laserablation overvinder denne mangel ved at begrænse skaden til et defineret interesseområde. Dette gør det muligt for forskere at kontrollere placeringen af skaden samt skadeomfanget. Skadens sværhedsgrad kan moduleres til ablate krypter eller hele mikroskopiske tarmfelter for at informere om regenerative reaktioner på kryptskalaen. Ud over rumlig kontrol giver laserablation også mulighed for præcist at time skadens begyndelse og derved overgå præcisionen af tidligere lægemiddel-, kemikalie- og infektionsmodeller 9,10,11,12,19,20. Vores protokol udvider tidligere undersøgelser, der brugte laserinduceret termisk ablation som en metode til at fremkalde lokaliseret skade i tarmen21,23. Tidligere laserinducerede skademodeller afbildede lokale områder i tyndtarmen21 eller den luminale overflade af den distale tyktarm23. Den kombinerede kirurgi og laserablationsmetode gør det muligt at visualisere tarmepitelet (især krypter) i høj opløsning og at udføre laserablation og opfølgende billeddannelse af vævsgendannelse i enhver position af tyndtarmen, cecum og proksimal tyktarm. Det fanger genopretningen af de samme tarmområder over tid, hvilket gør det muligt at visualisere forskellige lag af tarmen (slimhinde, submucosa, muscularis og serosa) i henhold til den eksperimentelle opsætning. Vores teknik er hovedsageligt skræddersyet til langvarig gentagen billeddannelse i en periode på flere uger / måneder. For at studere krypters kortsigtede genoprettelsesdynamik (f.eks. i flere på hinanden følgende dage efter skade) kan laserablationsmetoden beskrevet her kombineres med intravitale billeddannelsesvinduer27,28,40.
Denne protokol kan bruges til en lang række forskningsapplikationer fra forskellige videnskabelige områder, der spænder over regenerering, immunologi og kræftforskning. Langsgående billeddannelse af tarmregenerering kaster lys over den cellulære dynamik, der bevarer epitelintegritet og barrierefunktion, muliggør værtsforsvar mod patogener i tarmens lumen, og som ligger til grund for clearance og spredning af onkogene mutationer. Hvert videnskabeligt spørgsmål vil stille unikke krav til omfanget af laserinduceret skade og billeddannelsens varighed. Fluorescerende reportermus og injicerede farvestoffer kan drastisk udvide og forfine de data, der kan erhverves ved at tillade visualisering af enhver celle og struktur af interesse. For eksempel kan en Lgr5-CreERt2:Rosa26-Confetti-mus bruges til at visualisere stamcelleafkom, mens Rosa26-mTmG-reporteren informerer om vævsarkitektur. Sammen gør disse nylige teknologiske fremskridt intravitale tarmeksperimenter til et lukrativt værktøj til at fremme vores forståelse af tarmbiologi og sygdom.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Denne undersøgelse blev støttet af den nederlandske organisation for videnskabelig forskning NWO (Vici grant 09150182110004 til J.v.R. og Veni grant 09150161910151 til H.A.M.), OCENW. GROOT.2019.085 (til J.v.R) og et EMBO postdoc-stipendium (bevilling ALTF 452-2019 til H.A.M).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anesthesia induction box | Veterinary Technics | ||
| Autoclave | Certoclav | ||
| Betadine | Mylan | 202809 | |
| Diaper (underpad) | Absorin comfort | ||
| Dumont forceps | Fine Scientific Tools | 11255-20 or 11272-40 | Inox, style #55, used to hold the peritoneum |
| Enzymatic instrument cleaner | Roboz | EC-1000 | |
| Ethanol 80% | homemade | NA | |
| Eye ointment | Duratears Z (Alcon) | 288/28282-6 | |
| Fine Scissors Straight 9 cm | Fine Scientific Tools | 14060-09 | Used to cut skin and peritoneum of the mouse |
| Gauze 5 cmX5 cm | Cutisoft (Bsn medical) | 45847-00 | |
| Graefe Forceps Curved Serrated | Fine Scientific Tools | 11051-10 | Used to hold the skin |
| Hartman Hemostat Straight | Fine Scientific Tools | 13002-10 | Used for suturing |
| Heating pad | Comfort | T5-5000 | |
| Imaging box | Custom made | ||
| Incision film | Nobafilm | 172215 | |
| Inverted multi-photon microscope with automated stage | Leica Microsystems | NA | |
| Isoflurane (vetflurane) | Pharmachemie BV, Haarlem, Netherlands | 305788 | |
| Isoflurane vaporizer | Penlon sigma delta | ||
| Micropore paper tape | Micropore | ||
| NaCl 0.9% | Braun | Other brands available | |
| Needle 25G | BD | 300600 | |
| Paper tape tesa | Tesa | NA | |
| Parafilm | Bemis | PM-994 | semi-transparent tape |
| Razor blades | Supermax stainless steel | Other brands available | |
| Rectal probe | Kent Scientific | 20250-91 | |
| Rimadyl Cattle (carprofen) | Zoetis B.V | Registration# REG NL 10130 | |
| Student Fine Scissors Straight 11.5 cm | Fine Scientific Tools | 91460-11 | Used to cut gauze |
| Surgical instrument cleaner | Roboz | IC-1000 | |
| Surgical instrument lubricant | Roboz | IL-1000 | |
| Syringes (1 ml) | BD | 303172 | Other brands available |
| Tamoxifen | Sigma | T5648 | |
| Temgesic (Buprenorphine hydrochloride) | Indivior UK Limited/Reckitt Benckiser Healthcare | Registration# RVG 08725 | |
| Vicryl polyglactin suture 5-0 FS-2 needle | Ethicon | V292ZH | |
| VirkonS | Bio-services | antiseptic solution | |
| Wooden cotton swab (sterile) | Klinion | 531530 | Other brands available |
References
- Clevers, H. The intestinal crypt, a prototype stem cell compartment. Cell. 154 (2), 274-284 (2013).
- Darwich, A. S., Aslam, U., Ashcroft, D. M., Rostami-Hodjegan, A. Meta-analysis of the turnover of intestinal epithelia in preclinical animal species and humans. Drug Metabolism and Disposition. 42 (12), 2016-2022 (2014).
- Beumer, J., Clevers, H. Regulation and plasticity of intestinal stem cells during homeostasis and regeneration. Development. 143 (20), 3639-3649 (2016).
- Ritsma, L., et al. Intestinal crypt homeostasis revealed at single-stem-cell level by in vivo live imaging. Nature. 507 (7492), 362-365 (2014).
- Azkanaz, M., et al. Retrograde movements determine effective stem cell numbers in the intestine. Nature. 607 (7919), 548-554 (2022).
- van Es, J. H., et al. Dll1+ secretory progenitor cells revert to stem cells upon crypt damage. Nature Cell Biology. 14 (10), 1099-1104 (2012).
- Tomic, G., et al. Phospho-regulation of ATOH1 is required for plasticity of secretory progenitors and tissue regeneration. Cell Stem Cell. 23 (3), 436-443 (2018).
- Asfaha, S., et al. Krt19+/Lgr5- cells are radioresistant cancer-initiating stem cells in the colon and intestine. Cell Stem Cell. 16 (6), 627-638 (2015).
- Schmitt, M., et al. Paneth cells respond to inflammation and contribute to tissue regeneration by acquiring stem-like features through SCF/c-Kit signaling. Cell Reports. 24 (9), 2312-2328 (2018).
- Davidson, L. A., et al. Alteration of colonic stem cell gene signatures during the regenerative response to injury. Biochimica et Biophysica Acta. 1822 (10), 1600-1607 (2012).
- Ijiri, K., Potten, C. S. Further studies on the response of intestinal crypt cells of different hierarchical status to eighteen different cytotoxic agents. British Journal of Cancer. 55 (2), 113-123 (1987).
- Andersson-Rolf, A., Zilbauer, M., Koo, B. K., Clevers, H. Stem cells in repair of gastrointestinal epithelia. Physiology. 32 (4), 278-289 (2017).
- Totafurno, J., Bjerknes, M., Cheng, H. The crypt cycle. Crypt and villus production in the adult intestinal epithelium. Biophysical Journal. 52 (2), 279-294 (1987).
- Dekaney, C. M., Gulati, A. S., Garrison, A. P., Helmrath, M. A., Henning, S. J. Regeneration of intestinal stem/progenitor cells following doxorubicin treatment of mice. American Journal of Physiology. Gastrointestinal and Liver Physiology. 297 (3), G461-G470 (2009).
- Cairnie, A. B., Millen, B. H. Fission of crypts in the small intestine of the irradiated mouse. Cell and Tissue Kinetics. 8 (2), 189-196 (1975).
- Bruens, L., Ellenbroek, S. I. J., van Rheenen, J., Snippert, H. J. In vivo imaging reveals existence of crypt fission and fusion in adult mouse intestine. Gastroenterology. 153 (3), 674-677 (2017).
- Baker, A. M., et al. Crypt fusion as a homeostatic mechanism in the human colon. Gut. 68 (11), 1986-1993 (2019).
- Barker, N., et al. Identification of stem cells in small intestine and colon by marker gene Lgr5. Nature. 449 (7165), 1003-1007 (2007).
- Okayasu, I., et al. A novel method in the induction of reliable experimental acute and chronic ulcerative colitis in mice. Gastroenterology. 98 (3), 694-702 (1990).
- Rakoff-Nahoum, S., Paglino, J., Eslami-Varzaneh, F., Edberg, S., Medzhitov, R. Recognition of commensal microflora by toll-like receptors is required for intestinal homeostasis. Cell. 118 (2), 229-241 (2004).
- Choi, J., et al. Intestinal crypts recover rapidly from focal damage with coordinated motion of stem cells that is impaired by aging. Scientific Reports. 8 (1), 10989 (2018).
- Tian, H., et al. A reserve stem cell population in small intestine renders Lgr5-positive cells dispensable. Nature. 478 (7368), 255-259 (2011).
- Choi, M., Yun, S. H. In vivo femtosecond endosurgery: an intestinal epithelial regeneration-after-injury model. Optics Express. 21 (25), 30842-30848 (2013).
- Seno, H., et al. Efficient colonic mucosal wound repair requires Trem2 signaling. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (1), 256-261 (2009).
- Hua, G., et al. Distinct levels of radioresistance in Lgr5+ colonic epithelial stem cells versus Lgr5+ small intestinal stem cells. Cancer Research. 77 (8), 2124-2133 (2017).
- Rompolas, P., et al. Live imaging of stem cell and progeny behaviour in physiological hair-follicle regeneration. Nature. 487 (7408), 496-499 (2012).
- Alieva, M., Ritsma, L., Giedt, R. J., Weissleder, R., van Rheenen, J. Imaging windows for long-term intravital imaging: General overview and technical insights. Intravital. 3 (2), e29917 (2014).
- Rakhilin, N., et al. An intravital window to image the colon in real time. Nature Communications. 10 (1), 5647 (2019).
- Messal, H. A., et al. Antigen retrieval and clearing for whole-organ immunofluorescence by FLASH. Nature Protocols. 16 (1), 239-262 (2021).
- Farrelly, O., et al. Two-photon live imaging of single corneal stem cells reveals compartmentalized organization of the limbal niche. Cell Stem Cell. 28 (7), 1233-1247 (2021).
- Krndija, D., et al. Active cell migration is critical for steady-state epithelial turnover in the gut. Science. 365 (6454), 705-710 (2019).
- Bruens, L., et al. Calorie restriction increases the number of competing stem cells and decreases mutation retention in the intestine. Cell Reports. 32 (3), 107937 (2020).
- Bietar, B., Zhou, J., Lehmann, C. Utility of intestinal intravital microscopy for the study of CNS injury-induced immunodepression syndrome (CIDS). Clinical Hemorheology and Microcirculation. 79 (1), 137-147 (2021).
- Erreni, M., Doni, A., Weigert, R. Method for acute intravital imaging of the large intestine in live mice. Methods in Molecular Biology. 2304, 285-299 (2021).
- Hiltensperger, M., et al. Skin and gut imprinted helper T cell subsets exhibit distinct functional phenotypes in central nervous system autoimmunity. Nature Immunology. 22 (7), 880-892 (2021).
- Martínez-Sánchez, L. D. C., et al. Epithelial RAC1-dependent cytoskeleton dynamics controls cell mechanics, cell shedding and barrier integrity in intestinal inflammation. Gut. 72 (2), 275-294 (2022).
- Means, A. L., Xu, Y., Zhao, A., Ray, K. C., Gu, G. A CK19(CreERT) knockin mouse line allows for conditional DNA recombination in epithelial cells in multiple endodermal organs. Genesis. 46 (6), 318-323 (2008).
- Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45 (9), 593-605 (2007).
- Snippert, H. J., et al. Intestinal crypt homeostasis results from neutral competition between symmetrically dividing Lgr5 stem cells. Cell. 143 (1), 134-144 (2010).
- Messal, H. A., van Rheenen, J., Scheele, C. L. An intravital microscopy toolbox to study mammary gland dynamics from cellular level to organ scale. Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 26 (1), 9-27 (2021).
