Summary
In dieser Arbeit stellen wir eine Methode vor, um Bilder des Darms nach laserinduzierter Verwundung zu erhalten. Indem der Darm der Maus einem Multiphotonenlaser ausgesetzt wird, wird der Verlust einer oder mehrerer Krypten lokal induziert. Durch die wiederholte Abbildung des geschädigten Bereichs über Monate hinweg wird die Echtzeitdynamik der Darmerholung erfasst.
Abstract
Die Untersuchung der intestinalen Erholung in vivo ist eine exquisite technische Herausforderung. Das Fehlen von longitudinalen Bildgebungsprotokollen hat einen tieferen Einblick in die Dynamik auf Zell- und Gewebeebene verhindert, die die Darmregeneration orchestriert. In dieser Arbeit beschreiben wir eine intravitale Mikroskopiemethode, die lokal Gewebeschäden auf der Skala der einzelnen Krypten induziert und die regenerative Reaktion des Darmepithels in lebenden Mäusen verfolgt. Einzelne Krypten oder größere Darmfelder wurden mit einem hochintensiven Multiphotonen-Infrarotlaser zeit- und raumgesteuert abgetragen. Die anschließende repetitive intravitale Langzeitbildgebung ermöglichte die Verfolgung der geschädigten Bereiche über die Zeit und die Überwachung der Kryptendynamik während der Gewebeerholung über einen Zeitraum von mehreren Wochen. Kryptenumbauereignisse wie Kryptenspaltung, Fusion und Verschwinden wurden im benachbarten Gewebe nach laserinduzierter Schädigung beobachtet. Dieses Protokoll ermöglicht die Untersuchung der Kryptendynamik sowohl in homöostatischen als auch in pathophysiologischen Umgebungen, wie z.B. dem Altern und der Tumorinitiation.
Introduction
Die Epithelschleimhaut des Darms wird ständig durch Magensäuren, Toxine und Mikrobiota herausgefordert, die zu einer Störung der Epithelbarriere führen können. Darmstruktur und Gewebeorganisation sind darauf spezialisiert, sich ständig selbst zu erneuern und Schäden zu reparieren. Das einschichtige Epithel des Dünndarms ist in Krypten-Zotten-Einheiten1 organisiert. In der Homöostase führen selbsterneuernde Lgr5+-Darmstammzellen, die sich an der Basis der Krypta befinden, zu differenzierten Nachkommen. Die differenzierten Tochterzellen wandern in einem Förderband zur Spitze der Zottenachse, wo sie abgestoßen werden, so dass die Darmschleimhaut in 3-5 Tagen wieder aufgefüllt ist 2,3. Langfristig tragen nicht alle Lgr5+-Zellen gleichermaßen zur Gewebeerneuerung bei, da dies auch von der Fähigkeit der Zellen abhängt, sich gegen das Förderband in Richtung der Basis der Krypta zu bewegen (d.h. retrograde Bewegung)4,5. Tatsächlich wandern nach der Ablation von Lgr5+-Zellen, z. B. durch Bestrahlung, Vorläuferzellen außerhalb der Basis der Krypta in die Basis, um den Stammzellpool zu dedifferenzieren und wieder aufzufüllen 6,7,8.
Eine akute Entzündung kann zum Verlust von Lgr5+-Stammzellen führen 9,10. Neben dem Verlust von Stammzellen können viele äußere Faktoren eine akute Schädigung des Epithels auf der Kryptenebene verursachen. Es hat sich gezeigt, dass Bestrahlung, chemische Behandlungen und Antibiotika Darmkrypten und Zotten schädigen11. Größere Felder von Krypten und Zotten können von bakteriellen, viralen und parasitären Infektionen betroffen sein12. Der Darm besitzt eine bemerkenswerte Fähigkeit, sich von inneren und äußeren Schäden auf der Kryptenebene durch Kryptenspaltung (eine Teilung einer Krypta in zwei) zu erholen13. Nach der Verwundung werden Krypten in der Nähe des Schadens gespalten, um die Kryptennummern wieder aufzufüllen. Dieses Phänomen tritt auch, wenn auch in geringerem Ausmaß, während der Homöostaseauf 14,15. Um einen möglichen Anstieg der Kryptenzahl während der Homöostase auszugleichen, können Krypten auch verschmelzen (Verschmelzung zweier Krypten zu einer)16,17. Ob die Kryptenfusion auch eine Rolle bei der Wiederherstellung der Kryptennummern nach einer Verwundung spielt, ist nicht bekannt. Darüber hinaus müssen die Dynamik und die regulatorischen Faktoren dieses Prozesses noch aufgeklärt werden.
Verletzungsmodelle sind unverzichtbar, um die Geweberegeneration in vivo zu untersuchen. Verschiedene Verletzungsmodelle wurden verwendet, um die Regeneration von Darmgewebe zu untersuchen. Frühere experimentelle Strategien verwendeten hochdosierte Strahlung zur Erschöpfung von Stammzellpools18 oder die Behandlung mit Dextransulfat-Natrium (DSS), um chronische und akute Kolitis und Kryptenverlust bei Mäusen zu induzieren 19,20. Die Einzelzellablation mit genetischen oder optischen Mitteln wurde zur Verfeinerung von Gewebeschäden eingesetzt und gilt als attraktives Werkzeug, um die Rolle von Stamm- und Vorläuferzellen zu entwirren 21,22 und die vaskuläre Regenerationzu untersuchen 23. Zusätzlich wurde ein Biopsie-Verletzungssystem entwickelt, um Schäden in größeren Feldern mehrerer Krypten und Zotten zu induzieren24. Wichtig ist, dass die Reaktion auf die schädigende Beleidigung entlang der proximal-distalen Achse des Darms variieren kann, wie bei der Bestrahlung berichtet wird, die im Dünndarm mehr Schaden angerichtet hat als im Dickdarm25. Dies unterstreicht die Notwendigkeit gezielter Methoden, die sowohl das Ausmaß des schädigenden Infults als auch seine Lokalisation im Darmtrakt kontrollieren.
Das Ausmaß der Schädigung und die Erholung wurden bisher mit statischen Methoden bewertet, die nur begrenzte Informationen über die Dynamik der Gewebeerholung liefern. Die intravitale Mikroskopie (IVM) hat einzigartige Möglichkeiten eröffnet, das Verhalten von Stammzellen, den epithelialen Umbau und die Regeneration in vielen Organen zu quantifizieren 26,27,28,29,30, und hat wirkungsvolle Einblicke in die Darmbiologie geliefert 4,5,21,31,32,33,34, 35,36.
In dieser Arbeit beschreiben wir eine Methode, um eine raum-zeitlich definierte Darmschädigung zu verursachen und die Erholung der Darmepithelschleimhaut zu erfassen. Wir verwenden eine zweiphotonenbasierte Laserablation, um Darmkrypten zu schädigen und die sofortige Wundreaktion und langfristige Genesung durch wiederholte intravitale Mikroskopie zu verfolgen. Unser Protokoll erlaubt es, den regenerativen Umbau der Darmgewebearchitektur als Reaktion auf lokale Gewebeschäden abzubilden. Die Dynamik von Krypten, einschließlich Spaltungs- und Fusionsereignissen, kann leicht quantifiziert und im Laufe der Zeit verfolgt werden. Die Anwendung der Laserablation und der repetitiven intravitalen Bildgebung kann als Plattform genutzt werden, um die Dynamik der Darmarchitektur auf Gewebeebene während der Homöostase und Pathophysiologie, wie z.B. der Tumorinitiation, zu untersuchen.
Protocol
Alle in dieser Studie beschriebenen Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien und der Genehmigung der Tierschutzbehörde (AWB) des Niederländischen Krebsinstituts (NKI) durchgeführt.
HINWEIS: Konsultieren Sie die Tierethikkommission des Instituts, bevor Sie Tierversuche durchführen.
1. OP-Vorbereitung und intravitale Bildgebung
- Präoperative Behandlungen
- Induzieren Sie 8-12 Wochen alte K19-CreERT237: Rosa26-mTmG 38 und Lgr5eGFP-IRES-CreERT218: Rosa26-Confetti39 Mäuse durch Injektion von in Sonnenblumenöl gelöstem Tamoxifen intraperitoneal 4-6 Wochen vor der Operation (Abbildung 1).
- Wenden Sie eine Analgesie an. 30 Minuten vor der Operation werden 200 μl Buprenorphin (0,1 mg/kg Körpergewicht), verdünnt in NaCl 0,9 % pro 30 g Maus, subkutan injiziert. Carprofen (0,067 mg/ml) 24 Stunden vor der Operation in einer Flasche mit 125 ml nicht angesäuertem autoklaviertem Trinkwasser verabreichen. Alternativ kann 30 Minuten vor Beginn der Operation eine subkutane Carprofen-Injektion (5 mg/kg) verabreicht werden.
- Vorbereitung auf die Operation
- Führen Sie autoklavierte, sterile chirurgische Instrumente in den Biohazard-Schrank ein.
- Schalten Sie das Heizkissen ein und stellen Sie die Temperatur auf 37 °C ein.
- Vorbereitung für die intravitale Bildgebung
- Schalten Sie die temperierte Kammer des Mikroskops mindestens 4 h vor der Bildgebung ein, um genügend Zeit für die Temperaturstabilisierung zu haben.
HINWEIS: Die benötigte Zeit kann je nach verwendetem Gerät variieren. - Halten Sie die Temperatur in der Klimakammer stabil bei 37 °C.
- Schalten Sie das Zwei-Photonen-Mikroskop, den Scanner und den Laser ein.
- Starten Sie die Imaging-Software.
- Stellen Sie die Wellenlänge des Lasers auf 960 nm ein und öffnen Sie den Verschluss.
- Schalten Sie die temperierte Kammer des Mikroskops mindestens 4 h vor der Bildgebung ein, um genügend Zeit für die Temperaturstabilisierung zu haben.
2. Chirurgie und intravitale Bildgebung
- Chirurgische Freilegung des Darms
- Betäuben Sie die Maus mit 2%-3% Isofluran und legen Sie sie auf ein Heizkissen, das mit einem sterilen Tuch bedeckt ist. Überprüfen Sie die Narkosetiefe, indem Sie die Häufigkeit und Qualität der Atmung (ein Atemzug/Sekunde) und den Reflex der Maus beurteilen.
- Bedecken Sie die Augen der Maus mit Augensalbe.
- Injizieren Sie 200 μl vorgewärmte sterile Kochsalzlösung subkutan.
- Rasieren Sie den Bauch und entfernen Sie die Haare. Wechseln Sie das sterile Tuch im Operationsbereich.
- Führen Sie eine rektale Sonde ein, um die Temperatur der Maus zu überwachen.
Anmerkungen: Die Temperatur sollte ca. 37 °C betragen. - Ziehen Sie ein neues Paar sterile Handschuhe an.
- Reinigen Sie den Operationsbereich kreisförmig mit abwechselnden Peelings aus antiseptischer Lösung, gefolgt von dreimal 80%igem Ethanol. Entfernen Sie überschüssiges Ethanol mit einem sterilen Wattestäbchen.
HINWEIS: Es ist wichtig, die Maus zu diesem Zeitpunkt auf Unterkühlung zu überwachen. - Decken Sie die Maus mit einem sterilen OP-Tuch ab.
- Überprüfen Sie den Reflex der Maus.
- Machen Sie mit einem sterilen Skalpell einen ~10 mm vertikalen Mittellinienschnitt durch die Haut.
- Schneiden Sie die Linea alba mit einer Schere ein, um die geraden Bauchmuskeln zu trennen und den Bauch zu öffnen.
- Finden Sie den Blinddarm der Maus mit sterilen Wattestäbchen, die in steriler, vorgewärmter Kochsalzlösung getränkt sind, um ihn als Referenzpunkt zu verwenden.
- Machen Sie einen kleinen Schnitt in ein Stück sterile Gaze, befeuchten Sie es mit vorgewärmter steriler Kochsalzlösung und legen Sie es über den Einschnitt.
- Nehmen Sie den Darm mit sterilen Wattestäbchen heraus, die in vorgewärmter steriler Kochsalzlösung getränkt sind. Halten Sie den Darm mit Feuchtigkeit versorgt, indem Sie sterile, vorgewärmte Kochsalzlösung hinzufügen.
- Platzieren Sie eine sterile, speziell angefertigte Bildgebungskammer neben der Maus.
- Legen Sie die Maus in die vorgewärmte sterile Belichtungsbox.
- Legen Sie den Darm auf das sterile Glas der Bildgebungsbox. Legen Sie den Kopf der Maus in das Inhalationsröhrchen der Bildgebungsbox, wie in Abbildung 1 gezeigt.
- Befestigen Sie die Maus bei Bedarf mit steriler flexibler Folie und Klebeband.
- Legen Sie die Bildbox mit der Maus in die Mikroskopkammer.
- Intravitale Bildgebung
- Überwachen Sie die Maus während der Bildgebung, indem Sie alle 15 Minuten die Frequenz und Tiefe der Atmung sowie die Temperatur über eine rektale Sonde überprüfen. Der Isoflurananteil sollte zwischen 1 % und 2 % gehalten werden. Passen Sie bei Bedarf an.
- Finden Sie eine Region im Darm mit dem Okular des Mikroskops.
- Erzielen Sie mit der internen Kamera des Mikroskops eine Weitwinkelansicht des interessierenden Bereichs, wie in Abbildung 2A dargestellt.
- Abbildung der interessierenden Region mit dem 960-nm-Laser des Multiphotonenmikroskops. Passen Sie die Laserleistung und Wellenlänge entsprechend den im Experiment verwendeten Fluorophoren an.
- Erfassen Sie einen 10-20-stufigen Z-Stapel von 3 μm des interessierenden Bereichs.
- Laserablation
- Wählen Sie eine einzelne Position oder mehrere Positionen aus der zuvor abgebildeten Kachel aus.
- Verwenden Sie die Bleichpunktkalibrierungsfunktion in der Bildbearbeitungssoftware bei einem Zoom von 32 und 124 x 124 Pixel Auflösung mit einer Scangeschwindigkeit von 400 Hz, wobei Sie die bidirektionale Scan-Eigenschaft für 3-10 s verwenden, je nach Größe des angestrebten Schadens. Die Schädigung im Kryptenbereich ist an einer Erhöhung der Autofluoreszenz sowohl im grünen als auch im roten Kanal zu erkennen.
- Wiederholen Sie die beiden vorherigen Schritte für mehrere Regionen in derselben Maus.
- Erfassen Sie nach der Ablation Z-Stapel der beschädigten Regionen, um die Lage und das Ausmaß der Schädigung zu bestätigen.
- Verschluss des Operationsfeldes
- Legen Sie die Maus noch unter Narkose in einen sterilen Nahtbereich.
- Führen Sie den freiliegenden Darm mit sterilen Wattestäbchen, die mit vorgewärmter steriler Kochsalzlösung getränkt sind, wieder in den Bauch ein.
- Nähen Sie die Linea alba, indem Sie eine einfache durchgehende Naht mit einer resorbierbaren 5-0-Naht durchführen. Verschließen Sie die Enden der Naht mit chirurgischen Knoten.
- Wiederholen Sie den gleichen Schritt mit der Hautschicht.
- Schalten Sie die Isofluran-Station aus und reinigen und sterilisieren Sie die Belichtungsbox und das Inlay.
- Reinigen Sie die chirurgischen Werkzeuge mit dem chirurgischen Instrumentenreiniger, dem enzymatischen Reiniger und dem Schmiermittel für chirurgische Instrumente. Nach dem Trocknen sterilisieren Sie die Operationswerkzeuge zusammen mit der OP-Box im Autoklaven.
- Nachsorge
- Lassen Sie die Maus sich von der Operation erholen, während der Käfig für ~1 Stunde auf das Heizkissen gelegt wird.
Anmerkungen: Platzieren Sie die Maus nach Möglichkeit mit anderen Käfigkameraden. Eine Einzelhaltung ist für die Genesung nicht notwendig. - Überprüfen Sie die Temperatur der Maus während der Wiederherstellung alle 15 Minuten.
- 200 μl Buprenorphin (0,1 mg/kg Körpergewicht) verdünnt in NaCl 0,9 % pro 30 g Maus 6-12 h postoperativ subkutan injizieren.
- Verabreichen Sie Carprofen (0,067 mg/ml) 72 Stunden nach der Operation in einer Flasche mit 125 ml nicht angesäuertem autoklaviertem Trinkwasser.
- Wiegen Sie die Maus und überwachen Sie das Wohlbefinden 1 Woche lang täglich nach der Operation.
- Lassen Sie die Maus sich von der Operation erholen, während der Käfig für ~1 Stunde auf das Heizkissen gelegt wird.
3. Repetitive Chirurgie und intravitale Bildgebung
- Chirurgie
- Wiederholen Sie zum zweiten Zeitpunkt (mindestens 1 Woche nach der ersten Bildgebungssitzung) die Schritte 1.1.2, 1.2, 1.3 und 2.1.
- Intravitale Bildgebung
- Wiederholen Sie die Schritte 2.2.1-2.2.3.
- Verwenden Sie das Muster der Blutgefäße, um die gleichen Bereiche von Interesse zu finden, die zum ersten Zeitpunkt abgebildet wurden.
- Wiederholen Sie die Schritte 2.2.4 und 2.2.5.
- Verschluss des Operationsfeldes
- Wiederholen Sie Schritt 2.4.1.
- Wenn die Maus nicht zu einem anderen Zeitpunkt abgebildet werden soll, opfern Sie die Maus, indem Sie eine zervikale Luxation unter terminaler Betäubung durchführen. Fahren Sie andernfalls mit dem nächsten Schritt fort.
HINWEIS: Gemäß den Leitlinien der EU-Richtlinie 2010/63/EU, Anhang IV, ist die Zervixluxation eine akzeptable Methode. - Wiederholen Sie die Schritte 2.4.2-2.4.6.
- Nachsorge
- Wiederholen Sie die Schritte 2.5.1-2.5.5.
Representative Results
Um die Art der Ergebnisse zu demonstrieren, die mit der Laserablationsmethode in Kombination mit der intravitalen Bildgebung erzielt werden können, haben wir ein Experiment durchgeführt, wie in Abbildung 1 gezeigt. Zuerst injizierten wir K19-CreERT2;mTmG (K19cre-mTmG) und Lgr5eGFP-IRES-CreERT2; Rosa26-Confetti (Lgr5cre-Confetti)-Mäuse mit Tamoxifen, um Zellen stochastisch mit einer der Konfettifarben (oder grün fluoreszierendem Protein [GFP] im Falle von mTmG-Mäusen) zu markieren. K19-cre induziert die Rückverfolgung der Abstammungslinie aus allen Epithelzellen, während Lgr5-cre nur die Rückverfolgung aus Stammzellen induziert 8,18,37. Die Tamoxifen-Injektion wurde 4-6 Wochen vor der Operation und der ersten Bildgebungssitzung verabreicht, um Krypten zu erhalten, in denen alle Zellen monoklonal für eine bestimmte Farbe sind. Eine robuste Identifizierung der gleichen Geweberegionen über mehrere Wochen hinweg ist unerlässlich, um das Schicksal derselben Krypten im Laufe der Zeit zu verfolgen. Inhärente Gewebearchitekturmerkmale, wie z. B. das Gefäßsystem, können als zuverlässige Gewebeorientierungspunkte verwendet werden und wurden hier mit der internen Kamera des Mikroskops aufgenommen. Darüber hinaus half die Markierung eines kleinen Bruchteils der Krypten mit (mindestens zwei) verschiedenen Farben, dieselben Krypten in jeder Bildgebungssitzung zu erkennen und ihr Verhalten während des regenerativen Prozesses nach Laserschäden zu verfolgen. Nach der chirurgischen Freilegung des Darms der Maus und der Aufnahme von Kamera- und Fluoreszenzbildern der interessierenden Region (Abbildung 2A) können Bleichpunkteinstellungen des Multiphotonenlasers verwendet werden, um eine oder mehrere Krypten abzutragen (Abbildung 2B, C). Die Initiierung der Schädigung konnte durch eine Zunahme der Autofluoreszenz sowohl im grünen als auch im roten Kanal erkannt werden. Um die Dynamik der Kryptenerholung zu untersuchen, wurde das Operations- und Bildgebungsverfahren Wochen/Monate nach der ersten Bildgebungssitzung wiederholt und gewebeinhärente Strukturen (Gefäße und Muster klonal markierter Krypten) als Orientierungspunkte verwendet, um die exakt gleiche Stelle der Verletzung zu finden (Abbildung 2). Bei Anwendung dieser Methode in Lgr5Cre-Konfetti-Mäusen, bei denen Lgr5-eGFP lückenhaft exprimiert wird, konnten Veränderungen in der Anzahl und Form der Krypten nach der laserinduzierten Schädigung erfasst werden (Abbildung 3). Während einige Regionen keine Veränderungen in der Anzahl und Struktur der Krypten zeigten (Abbildung 3B), zeigten andere Regionen einen umfangreichen Kryptenumbau, wie die Anzahl der Kryptenspaltungs- und Fusionsereignisse (Abbildung 3C) und der Verlust der Krypten 2 Wochen nach der laserinduzierten Verletzung (Abbildung 3D) zeigten. Durch die Einführung unterschiedlicher Schadensgrößen und die Quantifizierung der Spaltungs-, Fusions- und Verschwindensereignisse nach der Ablation, wie im Beispiel (Abbildung 3E), kann die Dynamik der verletzungsinduzierten Regeneration in verschiedenen Mausmodellen abgebildet werden.
Abbildung 1: Schematische Darstellung des Versuchsaufbaus: Die In-vivo-Markierung von Darmzellen wird durch intraperitoneale Injektion von Tamoxifen in genetisch veränderte Mausmodelle erreicht, um eine Cre-vermittelte Rekombination in intestinalen Krypten zu induzieren. Nach Tagen oder Wochen (wenn die Krypten für eine bestimmte Farbe monoklonal sind) wird der Darm operativ freigelegt und einer Laserablation mit einem Multiphotonenmikroskop mit einer temperaturkontrollierten Kammer unterzogen. Das Ausmaß der Kryptenschädigung wird unmittelbar nach der Ablation charakterisiert und die Maus kann sich von der Prozedur erholen. Wiederholte chirurgische Exposition und IVM werden verwendet, um die Darmerholung im Laufe der Zeit zu überwachen. Anhand des Musters und der Verteilung der Blutgefäße und verschiedenfarbiger Krypten werden noch Wochen oder Monate nach der Ablation die gleichen Regionen wiedergefunden. Kryptenumbau (z.B. Spaltung oder Fusion) kann Wochen nach der Ablation an der Schädigungsstelle beobachtet werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Längsschnittliche Bildgebung der Geweberegeneration nach laserinduzierter Schädigung im Darm. Wenn der Darm genau auf die gleiche Weise positioniert ist, können die Blutgefäße des Darms als Karte verwendet werden, um genau dieselben Regionen zu finden und abzubilden. (A) Kamera-Übersichtsbilder des Darms. Gestrichelte weiße Linien stellen das Muster des Gefäßsystems dar, das an die Schadensstelle angrenzt (weißes Kästchen), das als Orientierungspunkt verwendet wird, um dieselbe laserabgetragene Region zu einem anderen Zeitpunkt zu finden. Die unteren beiden Bilder zeigen die vergrößerte Ansicht des weißen Kastens. Der Pfeil zeigt die genaue Stelle der Laserablation an Tag 1 und 1 Monat später. (B) Fluoreszenzbilder einer einzelnen Kryptenschädigung, aufgenommen mit einem Multiphotonenmikroskop. Der Pfeil im blauen Kasten zeigt den Ort des Schadens an Tag 1 und 1 Monat später. (C) Fluoreszierende Bilder eines beschädigten Kryptenfeldes. Die Pfeile im blauen Kästchen markieren den Bereich des Schadens an Tag 1 und 1 Monat später. Maßstabsbalken: 1 mm (A, oben); 0,25 mm (A, unten); 200 μm (große Übersicht B und C); und 50 μm (gezoomte Bilder B und C). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: Intravitale Bildgebung von Kryptenschicksalen nach Laserablation. (A) Mit Hilfe des Konfetti-Modells können Krypten, die mit verschiedenen Farben beschriftet sind, über die Zeit verfolgt werden, um die Dynamik der Genesung abzubilden. Der weiße Pfeil zeigt den Ort der Laserablation. Das gelbe Kästchen stellt eine benachbarte Region dar (<100 μm von der Schadensstelle), während die blauen und violetten Kästchen Regionen darstellen, die weit (>100 μm) von der laserabgetragenen Region entfernt sind. Es werden unterschiedliche Regenerationsmodi beobachtet. (B) Einige Bereiche bleiben unverändert, wie im violetten Kästchen. (C) Andere Regionen weisen einen Krypta-Umbau in Form von Kryptenspaltung oder -fusion auf; Die gestrichelten weißen Linien und Pfeile stellen Krypta-Spaltungsereignisse dar und die orangefarbenen gestrichelten Linien und Pfeile stellen Krypta-Fusionsereignisse dar. (D) In einigen Regionen wird das Verschwinden der Krypta beobachtet, wie in dem gelben Kasten, in dem die Krypta, die mit einer orangefarbenen gestrichelten Linie hervorgehoben ist, verschwunden ist. (E) Eine beispielhafte Quantifizierung, die die Anzahl der Kryptenumbauereignisse zeigt, die in den benachbarten Gebieten (d.h. weniger als 100 μm) und weit entfernt (d.h. mehr als 100 μm) der Schädigungsstelle beobachtet wurden. Maßstabsbalken: 200 μm (A); 50 μm (B-D). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Discussion
Dieses Protokoll kombiniert mikroskopische Laserablation und longitudinale intravitale Mikroskopie, um die intestinale Regeneration von der frühen Schadensreaktion bis hin zum langfristigen Gewebeumbau zu verfolgen. Die Technik wurde unter strikter Einhaltung ethischer Erwägungen entwickelt, um eine mikroskopische Laserablation zu induzieren und abzubilden, und wenn sie präzise angewendet wird, wird das Wohlbefinden der Tiere erhalten. Während der Operation ist es wichtig, darauf zu achten, dass die Integrität des Darms gut erhalten bleibt. Dies kann durch eine schonende Behandlung des Gewebes mit sterilen feuchten Wattestäbchen erreicht werden, wodurch ein Ausbluten oder Austrocknen des Gewebes verhindert wird. Das Ausmaß der laserinduzierten mikroskopischen Schädigung sollte auch sorgfältig beurteilt werden, indem die verschiedenen Darmschichten des Bereichs nach der Laserablation abgebildet werden. Wenn der Forscher die Häufigkeit der in diesem Protokoll beschriebenen Versuchsschritte anpassen möchte, sollte die Tierethikkommission des Instituts vor dem Versuch konsultiert werden, um die Auswirkungen auf das Wohlergehen festzustellen.
Die repetitive intravitale Mikroskopie ermöglicht es, die Gewebeerholung in derselben Maus über einen längeren Zeitraum zu überwachen. Wiederholte chirurgische Freilegung des Darms gewährt leicht einen optischen Zugang zum gesamten Darmtrakt. Gewebeinhärente Merkmale, wie z. B. das Gefäßsystem, dienen als Orientierungspunkte, um in jeder Bildgebungssitzung dieselben Darmregionen zu identifizieren. So kann die gleiche Geweberegion über mehrere Wochen abgebildet werden, was es ermöglicht, die langfristige Geweberegeneration im gleichen Darmbereich derselben Maus zu quantifizieren. Die räumlich-zeitliche Kontrolle, die die kombinierte chirurgische und bildgebende Methode bietet, bringt den Vorteil, dass dasselbe Organ sowohl unter homöostatischen als auch unter regenerierenden Bedingungen in derselben Maus abgebildet werden kann, was im Gegensatz zu früheren Modellen zur Schädigung ganzer Organe steht, bei denen Kontrollen und regenerierende Proben von verschiedenen Mäusen stammen 11,12,18,19,20 . Daher minimiert unser Versuchssetting die erforderliche Anzahl von Tieren, die für den Versuch benötigt werden, und reduziert die Variation innerhalb des Tieres.
Die Fehlerbehebung im Protokoll sollte mit einer Überprüfung der Maus- und Darmhandhabungstechnik sowie einer Kontrolle der Mikroskopiegeräte und -einstellungen beginnen. Es gibt viele kritische Schritte in diesem Protokoll, die besondere Aufmerksamkeit erfordern. Um das Wohlergehen der Tiere und eine gleichbleibend hohe Datenqualität zu gewährleisten, müssen alle Arbeiten in einer sauberen, sterilen Umgebung mit aseptischer Technik durchgeführt werden, und die Temperatur der Maus sollte während der Operation und jeder Bildgebungssitzung aufrechterhalten werden. Es ist wichtig, das Gewebe während der Bildgebung mit steriler, vorgewärmter Kochsalzlösung mit Feuchtigkeit zu versorgen und Gewebefibrose zu verhindern.
Um sicherzustellen, dass das Experiment reproduzierbar durchgeführt wird, ist es wichtig, die Laser vor dem Einsatz für eine optimale Aufnahme auszurichten und die Leistungsabgabe des Multiphotonenlasers zu Beginn jeder Sitzung zu messen. Parameter wie die Art des Objektivs, die Vergrößerung, die Verweilzeit, die Laserleistung und die Wellenlänge haben Einfluss auf das Ausmaß der mikroskopischen Laserablation und sollten berücksichtigt werden. In dieser Studie werden sowohl die Laserablation als auch die Bildgebung mit einer Laserleistung von 1,2 W (außerhalb des Objektivs) bei einer Wellenlänge von 960 nm durch ein Fluotar VISIR 25x/0,95 WATER-Objektiv durchgeführt. Die Änderung der Wellenlänge oder der optischen Abtasteigenschaften wirkt sich auf das Ausmaß der mikroskopischen Schädigung aus. Eine niedrigere Wellenlänge (z. B. 840 nm) führt zu Photonen mit höherer Energie und oft zu einer höheren Leistung des Lasers und kann mikroskopische Schäden verstärken. Ein höherer Zoom führt zu mehr Energie pro Region und damit zu weniger Zeit zum Abtragen von Krypten und umgekehrt. Die Verweildauer der Pixel kann auch erhöht oder verringert werden, um die Geschwindigkeit der Ablation und das Ausmaß des Schadens zu ändern. Wenn das abgebildete Gewebe nicht stabil ist (z. B. aufgrund peristaltischer Bewegungen), muss die Ablation schnell durchgeführt werden. Dazu sollte die Ablationsgeschwindigkeit optimiert werden, indem z.B. der Zoom- und/oder Laserausgang erhöht wird.
Die Entdeckung derselben Darmregion über mehrere Bildgebungssitzungen hinweg ist ein weiterer wichtiger Schritt, der ordnungsgemäß ausgeführt werden muss, um den Erfolg des Experiments sicherzustellen. Dazu muss der Darm zu jedem Zeitpunkt exakt gleich positioniert werden. Wir empfehlen, immer den Blinddarm als Bezugspunkt zu verwenden, um die gleichen Regionen im Dünn- und Dickdarm zu finden. Durch die sanfte Dehnung des Gewebes mit Wattestäbchen wird sichergestellt, dass sich der interessierende Bereich im Bereich des objektiven Arbeitsabstands befindet, und die Anzahl der Regionen, die zurückverfolgt werden können, maximiert. Darüber hinaus empfehlen wir, immer mehrere mikroskopische Positionen in jeder Maus abzutragen und abzubilden, um Regionen zu berücksichtigen, die in einer späteren Bildgebungssitzung möglicherweise nicht lokalisiert werden. Wenn die Regionen nicht gefunden werden können, obwohl die Positionierung des Darms korrekt ist, kann es helfen, die Maus neu zu positionieren und die Ausrichtung des exponierten Bereichs zu ändern. Das Verfolgen von Krypten im Laufe der Zeit kann bei Experimenten, bei denen größere Darmfelder mehrerer benachbarter Krypten abgetragen werden, mühsam sein. Solche schädlichen Beleidigungen können einen Gewebeumbau über die epitheliale Monoschicht hinaus hervorrufen, was in einer Modifikation der Gewebeorientierungspunkte gipfeln kann, die für die Verfolgung der Region im Laufe der Zeit verwendet werden. Die Wahl von Orientierungspunkten in ausreichendem Abstand zur Schadstelle und die Erfassung größerer Sichtfelder, die die Schadstelle um mehrere hundert Mikrometer übertreffen, erhöht die Chance auf erfolgreiche Langzeitexperimente. Neben einer falschen Positionierung des Darms auf dem Mikroskoptisch können peristaltische Bewegungen des Magen-Darm-Trakts die Bildgebung beeinträchtigen. Dieses Problem kann auf zwei Arten gemildert werden. Wenn die Häufigkeit der Bewegungen nicht zu hoch ist, kann der Vorgang in derselben Region mit einer längeren Belichtungszeit wiederholt werden. Alternativ können höhere Mengen an Anästhesie verwendet werden, um die Peristaltik zu verringern. Wir empfehlen, höhere Dosen von Isofluran auf kurze Anpassungen zu beschränken. Insgesamt sollten die Bildgebungssitzungen so kurz wie möglich gehalten werden, am besten unter 3 h, um eine schnelle Genesung zu gewährleisten.
Der kombinierte Ansatz der Laserablation und der longitudinalen intravitalen Mikroskopie hat im Vergleich zu anderen Schädigungsmodellen mehrere Vorteile. Bisherige (chemische) Schadensmodelle waren nicht in der Lage, die schädigende Beleidigung lokal einzugrenzen 6,11,12,19,20. Die Laserablation überwindet dieses Manko, indem sie die Schädigung auf eine definierte Region von Interesse beschränkt. Dies ermöglicht es den Forschern, den Ort der Verletzung sowie das Ausmaß des Schadens zu kontrollieren. Die Schwere der Schädigung kann moduliert werden, um Krypten oder ganze mikroskopisch kleine Darmfelder abzulieren, um über regenerative Reaktionen auf der Kryptenskala zu informieren. Neben der räumlichen Kontrolle ermöglicht die Laserablation auch ein präzises Timing des Auftretens von Schäden und übertrifft damit die Präzision früherer Arzneimittel-, Chemikalien- und Infektionsmodelle 9,10,11,12,19,20. Unser Protokoll baut auf früheren Studien auf, in denen laserinduzierte Thermoablation als Methode zur Induktion lokalisierter Schäden im Darm eingesetzt wurde21,23. Bisherige laserinduzierte Schädigungsmodelle bildeten lokale Bereiche im Dünndarm21 oder die luminale Oberfläche des distalen Kolons23 ab. Der kombinierte Ansatz der Chirurgie und Laserablation ermöglicht es, das Darmepithel (insbesondere Krypten) mit hoher Auflösung zu visualisieren und eine Laserablation und Nachsorgebildgebung der Gewebegewinnung in jeder Position des Dünndarms, des Blinddarms und des proximalen Dickdarms durchzuführen. Es erfasst die Erholung derselben Darmregionen im Laufe der Zeit und ermöglicht es, verschiedene Schichten des Darms (Mukosa, Submukosa, Muscularis und Serosa) gemäß dem Versuchsaufbau sichtbar zu machen. Unsere Technik ist hauptsächlich auf die Langzeit-Bildwiederholung über einen Zeitraum von mehreren Wochen/Monaten zugeschnitten. Um die kurzfristige Erholungsdynamik von Krypten (z.B. für mehrere aufeinanderfolgende Tage nach einer Schädigung) zu untersuchen, kann der hier beschriebene Laserablationsansatz mit intravitalen Bildgebungsfensternkombiniert werden 27,28,40.
Dieses Protokoll kann für eine Vielzahl von Forschungsanwendungen aus verschiedenen wissenschaftlichen Bereichen verwendet werden, die Regeneration, Immunologie und Krebsforschung umfassen. Die longitudinale Bildgebung der intestinalen Regeneration gibt Aufschluss über die zelluläre Dynamik, die die epitheliale Integrität und Barrierefunktion bewahrt, die Wirtsabwehr gegen Krankheitserreger im Darmlumen ermöglicht und die der Beseitigung und Ausbreitung onkogener Mutationen zugrunde liegt. Jede wissenschaftliche Fragestellung stellt einzigartige Anforderungen an das Ausmaß der laserinduzierten Schädigung und die Dauer der Bildgebung. Fluoreszierende Reportermäuse und injizierte Farbstoffe können die erfassten Daten drastisch erweitern und verfeinern, indem sie die Visualisierung jeder Zelle und Struktur von Interesse ermöglichen. So kann beispielsweise eine Lgr5-CreERt2:Rosa26-Confetti-Maus zur Visualisierung von Stammzellnachkommen verwendet werden, während der Rosa26-mTmG-Reporter über die Gewebearchitektur informiert. Zusammen machen diese jüngsten technologischen Fortschritte intravitale Darmexperimente zu einem lukrativen Werkzeug, um unser Verständnis der Darmbiologie und -krankheit zu verbessern.
Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Diese Studie wurde von der Niederländischen Organisation für wissenschaftliche Forschung NWO (Vici-Stipendium 09150182110004 an J.v.R. und Veni-Stipendium 09150161910151 an H.A.M.), dem OCENW, unterstützt. GROOT.2019.085 (an J.v.R) und ein EMBO-Postdoc-Stipendium (Stipendium ALTF 452-2019 an H.A.M.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anesthesia induction box | Veterinary Technics | ||
| Autoclave | Certoclav | ||
| Betadine | Mylan | 202809 | |
| Diaper (underpad) | Absorin comfort | ||
| Dumont forceps | Fine Scientific Tools | 11255-20 or 11272-40 | Inox, style #55, used to hold the peritoneum |
| Enzymatic instrument cleaner | Roboz | EC-1000 | |
| Ethanol 80% | homemade | NA | |
| Eye ointment | Duratears Z (Alcon) | 288/28282-6 | |
| Fine Scissors Straight 9 cm | Fine Scientific Tools | 14060-09 | Used to cut skin and peritoneum of the mouse |
| Gauze 5 cmX5 cm | Cutisoft (Bsn medical) | 45847-00 | |
| Graefe Forceps Curved Serrated | Fine Scientific Tools | 11051-10 | Used to hold the skin |
| Hartman Hemostat Straight | Fine Scientific Tools | 13002-10 | Used for suturing |
| Heating pad | Comfort | T5-5000 | |
| Imaging box | Custom made | ||
| Incision film | Nobafilm | 172215 | |
| Inverted multi-photon microscope with automated stage | Leica Microsystems | NA | |
| Isoflurane (vetflurane) | Pharmachemie BV, Haarlem, Netherlands | 305788 | |
| Isoflurane vaporizer | Penlon sigma delta | ||
| Micropore paper tape | Micropore | ||
| NaCl 0.9% | Braun | Other brands available | |
| Needle 25G | BD | 300600 | |
| Paper tape tesa | Tesa | NA | |
| Parafilm | Bemis | PM-994 | semi-transparent tape |
| Razor blades | Supermax stainless steel | Other brands available | |
| Rectal probe | Kent Scientific | 20250-91 | |
| Rimadyl Cattle (carprofen) | Zoetis B.V | Registration# REG NL 10130 | |
| Student Fine Scissors Straight 11.5 cm | Fine Scientific Tools | 91460-11 | Used to cut gauze |
| Surgical instrument cleaner | Roboz | IC-1000 | |
| Surgical instrument lubricant | Roboz | IL-1000 | |
| Syringes (1 ml) | BD | 303172 | Other brands available |
| Tamoxifen | Sigma | T5648 | |
| Temgesic (Buprenorphine hydrochloride) | Indivior UK Limited/Reckitt Benckiser Healthcare | Registration# RVG 08725 | |
| Vicryl polyglactin suture 5-0 FS-2 needle | Ethicon | V292ZH | |
| VirkonS | Bio-services | antiseptic solution | |
| Wooden cotton swab (sterile) | Klinion | 531530 | Other brands available |
References
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