Summary
הפרוטוקול הנוכחי מתאר את השימוש בפורמט אמוניום לחלוקת פאזה ב- QuEChERS, יחד עם ספקטרומטריית כרומטוגרפיה-מסה של גז, כדי לקבוע בהצלחה שאריות חומרי הדברה אורגנוכלורין בדגימת קרקע.
Abstract
כיום, שיטת QuEChERS מייצגת את פרוטוקול הכנת הדגימות הנפוץ ביותר בעולם לניתוח שאריות חומרי הדברה במגוון רחב של מטריצות הן במעבדות רשמיות והן במעבדות לא רשמיות. שיטת QuEChERS המשתמשת בפורמט אמוניום הוכיחה בעבר את עצמה כיתרון בהשוואה לגרסה המקורית ולשתי הגרסאות הרשמיות. מצד אחד, תוספת פשוטה של 0.5 גרם של פורמט אמוניום לכל גרם של מדגם מספיק כדי לגרום להפרדת פאזה ולהשיג ביצועים אנליטיים טובים. מצד שני, פורמט אמוניום מפחית את הצורך בתחזוקה בניתוחים שגרתיים. כאן, שיטת QuEChERS שונה באמצעות פורמט אמוניום יושמה לניתוח סימולטני של שאריות חומרי הדברה אורגנוכלורין (OCP) בקרקע חקלאית. באופן ספציפי, 10 גרם של המדגם היה hydrated עם 10 מ"ל של מים ולאחר מכן מופק עם 10 מ"ל של אצטוניטריל. לאחר מכן, הפרדת פאזה בוצעה באמצעות 5 גרם של פורמט אמוניום. לאחר צנטריפוגה, הסופרנטנט היה נתון לשלב ניקוי מיצוי פאזה מוצקה מפוזרת עם מגנזיום גופרתי נטול מים, אמין ראשוני-משני ואוקטדצילסילן. ספקטרומטריית גז כרומטוגרפיה-מסה שימשה כטכניקה האנליטית. שיטת QuEChERS המשתמשת בפורמט אמוניום מודגמת כחלופה מוצלחת לחילוץ שאריות OCP מדגימת קרקע.
Introduction
הצורך להגדיל את ייצור המזון הוביל לשימוש אינטנסיבי ונרחב בחומרי הדברה ברחבי העולם בעשורים האחרונים. חומרי הדברה מוחלים על הגידולים כדי להגן עליהם מפני מזיקים ולהגדיל את תנובת היבולים, אך שאריותיהם בדרך כלל מגיעות לסביבת הקרקע, במיוחד באזורים חקלאיים1. יתר על כן, לחלק מחומרי ההדברה, כגון חומרי הדברה אורגנוכלורין (OCPs), יש מבנה יציב מאוד, ולכן השאריות שלהם אינן מתפרקות בקלות ונמשכות בקרקע במשך זמן רב2. בדרך כלל, הקרקע יש יכולת גבוהה לצבור שאריות חומרי הדברה, במיוחד כאשר יש לו תוכן גבוה של חומר אורגני3. כתוצאה מכך, הקרקע היא אחד התאים הסביבתיים המזוהמים ביותר על ידי שאריות חומרי הדברה. לדוגמה, אחד המחקרים המלאים עד כה מצא כי 83% מתוך 317 קרקעות חקלאיות מרחבי האיחוד האירופי היו מזוהמות עם אחד או יותר שאריות הדברה4.
זיהום קרקע על ידי שאריות חומרי הדברה עלול להשפיע על מינים שאינם מטרה, על תפקוד הקרקע ועל בריאות הצרכנים דרך שרשרת המזון בגלל הרעילות הגבוהה של השאריות 5,6. כתוצאה מכך, הערכת שאריות חומרי הדברה בקרקע חיונית להערכת ההשפעות השליליות הפוטנציאליות שלהם על הסביבה ועל בריאות האדם, במיוחד במדינות מתפתחות בשל היעדר תקנות מחמירות על השימוש בחומרי הדברה7. זה הופך את ניתוח ריבוי שאריות חומרי ההדברה לחשוב יותר ויותר. עם זאת, הניתוח המהיר והמדויק של שאריות חומרי הדברה בקרקע הוא אתגר קשה בשל מספרם הרב של החומרים המפריעים, כמו גם רמת הריכוז הנמוכה והתכונות הפיסיקוכימיות המגוונות של אנליטים אלה4.
מבין כל שיטות ניתוח שאריות חומרי ההדברה, שיטת QuEChERS הפכה לאפשרות המהירה, הקלה, הזולה ביותר, היעילה ביותר, החזקה והבטוחה ביותר8. שיטת QuEChERS כוללת שני שלבים. בשלב הראשון מבוצעת מיצוי בקנה מידה זעיר המבוסס על חלוקה באמצעות המלחה בין שכבה מימית לשכבת אצטוניטריל. בשלב השני, מתבצע תהליך ניקוי תוך שימוש במיצוי פאזה מוצקה מתפזרת (dSPE); טכניקה זו משתמשת בכמויות קטנות של מספר שילובים של סורבנטים נקבוביים כדי להסיר רכיבים מפריעי מטריצה ומתגברת על החסרונות של SPE9 קונבנציונאלי. לפיכך, ה- QuEChERS היא גישה ידידותית לסביבה עם מעט ממסים / כימיקלים הולכים לפסולת המספקת תוצאות מדויקות מאוד וממזערת מקורות פוטנציאליים של שגיאות אקראיות ושיטתיות. למעשה, הוא יושם בהצלחה לניתוח שגרתי בתפוקה גבוהה של מאות חומרי הדברה, עם ישימות חזקה כמעט בכל סוגי הדגימות הסביבתיות, החקלאיות והביולוגיות 8,10. עבודה זו נועדה ליישם ולאמת שינוי חדש של שיטת QuEChERS שפותחה בעבר והוצמדה ל- GC-MS כדי לנתח OCPs בקרקע חקלאית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הכנת פתרונות המלאי
הערה: מומלץ ללבוש כפפות ניטריל, מעיל מעבדה ומשקפי בטיחות במהלך כל הפרוטוקול.
- הכינו תמיסת מלאי באצטון במינון של 400 מ"ג/ל' מתערובת מסחרית של OCPs (ראו טבלת חומרים) במינון של 2,000 מ"ג/ל' בהקסאן:טולואן (1:1) בבקבוק נפחי של 25 מ"ל. טבלה 1 מציגה כל אחד מה- OCPs שנבחרו.
- הכינו את תמיסות המלאי הבאות באצטון בריכוזים של 50 מ"ג/ל', 1 מ"ג/ל' ו-0.08 מ"ג/ל' בצלוחיות נפחיות נפחיות של 10 מ"ל, ואחסנו אותן בבקבוקוני זכוכית ענבריים בטמפרטורה של 18°C-.
הערה: ניתן להשתמש באותם פתרונות לאורך כל העבודה, אך חשוב לאחסן אותם בתנאים אלה מיד לאחר כל שימוש. - הכינו את תמיסות המלאי באצטון בריכוזים של 20 מ"ג/ל' ו-0.4 מ"ג/ל' מסטנדרט מסחרי של 4,4'-DDE-d8 ב-100 מ"ג/ל' באצטון בבקבוקונים נפחיים של 10 מ"ל, ואחסנו בקבוקוני זכוכית ענבריים בטמפרטורה של 18°C-. השתמש בתקן 4,4'-DDE-d8 כתקן פנימי (IS).
2. איסוף דגימות
- לאסוף כ 0.5 ק"ג של השכבה העליונה 10 ס"מ של אדמה חקלאית במיכל זכוכית. מטרת הקרקע של מחקר זה נאספה באזור חקלאי מסורתי של גידולי תפוחי אדמה.
הערה: בוצע דגימת משטח עם מרית. עם זאת, עומק הקרקע יכול להשפיע על המאפיינים הפיסיקוכימיים שלה. לכן, אם תכולת הפחמן האורגני משתנה עם העומק, יש צורך לקחת דגימות בעומקים שונים. - קח את דגימת הקרקע למעבדה, נפה אותה עם מסננת בקוטר 1 מ"מ, ואחסן אותה עד לניתוח ב 4 מעלות צלזיוס במיכל זכוכית ענבר.
הערה: ניתן להשתמש באותה דגימת קרקע לאורך כל העבודה, אך חשוב לאחסן אותה בתנאים אלה מיד לאחר כל שימוש.
3. הכנת דוגמאות בשיטת QuEChERS המתוקנת באמצעות פורמט אמוניום
הערה: איור 1 מציג ייצוג סכמטי של שיטת QuEChERS ששונתה.
- שקלו 10 גרם מדגימת הקרקע בצינור צנטריפוגה של 50 מ"ל, והוסיפו 50 מיקרוגרם מתמיסת IS ב-20 מ"ג/ל' כדי להניב 100 מיקרוגרם/ק"ג. למטרות התאוששות, הוסיפו גם את תמיסות ההדברה שהוכנו בשלב 1.2 כדי להניב 10 מיקרוגרם/ק"ג, 50 מיקרוגרם/ק"ג ו-200 מיקרוגרם/ק"ג (n = 3 כל אחת).
- נערו את הצינור באמצעות מערבולת במשך 30 שניות כדי לשלב טוב יותר את הספייק בדגימה.
- מוסיפים 10 מ"ל מים. יש לנער את השפופרת באמצעות שייקר אוטומטי בגודל 10 x גרם למשך 5 דקות.
- מוסיפים 10 מ"ל של אצטוניטריל. לנער את הצינור שוב ב 10 x גרם במשך 5 דקות.
- הוסיפו 5 גרם של אמוניום (ראו טבלת חומרים), נערו את השפופרת במרץ במשך דקה אחת ביד, וצנטריפוגה בגודל 1,800 x גרם למשך 5 דקות.
- העבר 1 מ"ל של תמצית אצטוניטריל לצינור צנטריפוגה של 2 מ"ל המכיל 150 מ"ג של MgSOנטול מים 4, 50 מ"ג של אמין ראשוני-משני (PSA), ו-50 מ"ג אוקטדצילסילאן (C18) (ראו טבלת חומרים) למטרות ניקוי על ידי מיצוי פאזה מוצקה-מפוזרת (d-SPE)8, מערבולת במשך 30 שניות, וצנטריפוגה ב-1,800 x גרם למשך 5 דקות.
- העבר 200 μL של התמצית לבקבוקון דגימה אוטומטית עם תווית מתאימה עם תוספת התמזגות של 300 μL, ובצע ניתוח אינסטרומנטלי באמצעות מערכת GC-MS (שלב 4).
הערה: כיול תואם מטריצה מתבצע בעקבות אותם שלבים כמו בעבר באמצעות תמציות ריקות, אך 5 מ"ל של supernatant מנוקה בצינורות 15 mL בשלב d-SPE (שלב 3.6) ואת פתרונות ספייק ו- IS לא מתווספים עד שלב 3.7. הוסף את פתרונות הכיול הסטנדרטיים בבקבוקוני הדגימה האוטומטית כדי להניב 5 מיקרוגרם/ק"ג, 10 מיקרוגרם/ק"ג, 50 מיקרוגרם/ק"ג, 100 מיקרוגרם/ק"ג, 200 מיקרוגרם/ק"ג ו-400 מיקרוגרם/ק"ג, התאדה ליובש והוסף 200 μL של תמציות המטריצה.
4. ניתוח אינסטרומנטלי על ידי GC-MS
- בצע את ניתוחי GC-MS באמצעות מערכת GC-MS עם ספקטרומטר מסה מרובע יחיד וממשק יינון אלקטרונים (−70 eV) (ראה טבלת חומרים).
- הגדר את קו ההעברה של MS ב- 280 °C ואת מקור היונים ב- 230 °C.
- השתמש בעמודה של 5%-פניל-פולי-פוליסילוקסן 30 מ' x 250 מיקרומטר x 0.25 מיקרומטר (ראה טבלת חומרים) ובטוהר גבוה במיוחד הוא כגז המוביל בקצב זרימה קבוע של 1.2 מ"ל/דקה.
- מתחזקים את תנור ה-GC בטמפרטורה של 60°C בתחילה למשך 2 דקות, לאחר מכן מעלים את הטמפרטורה ל-160°C ב-25°C/min, ומחזיקים למשך דקה אחת. לאחר מכן, הגדל את הטמפרטורה ל 175 °C ב 15 °C / min, ולהחזיק במשך 3 דקות. לאחר מכן, הגדל ל 220 °C ב 40 °C / min, ולהחזיק במשך 3 דקות. שוב, הגדילו ל-250 מעלות צלזיוס ב-30 מעלות צלזיוס לדקה, והחזיקו למשך 2 דקות. לבסוף, קח את הטמפרטורה ל 310 °C ב 30 °C (80 °F/min), ולהחזיק במשך 2 דקות. זמן הניתוח הכולל הוא 22.125 דקות.
- בצע כוונון אוטומטי מלא ובדיקת אוויר ומים של הטרשת הנפוצה לפני כל רצף.
- פתח את תוכנת הרכישה MassHunter השולטת בכל הפרמטרים של מערכת GC-MS.
הערה: מערכת המכשירים כוללת את תוכנת הרכישה MassHunter כברירת מחדל. - פתח את האפשרות "תצוגה" בסרגל הכלים ולחץ על בקרת ואקום, לחץ על כוונון ולחץ על כוונון אוטומטי. הכוונון האוטומטי יסתיים לאחר מספר דקות.
- פתח את האפשרות "הצג" ולחץ על בקרת מכשירים.
- לחץ על כן, ושמור את קובץ המנגינה החדש עבור הכוונון האוטומטי.
- פתח את האפשרות "תצוגה" בסרגל הכלים ולחץ על בקרת ואקום, לחץ שוב על כוונון ולחץ על בדיקת אוויר ומים. בדיקת האוויר והמים תסתיים לאחר מספר שניות.
- פתח את האפשרות "הצג" ולחץ על בקרת מכשירים.
- לחץ על כן, ושמור את קובץ המנגינה החדש לבדיקת האוויר והמים.
- פתח את תוכנת הרכישה MassHunter השולטת בכל הפרמטרים של מערכת GC-MS.
- בצע את ההזרקה באמצעות דגימה אוטומטית (ראה טבלת חומרים) בטמפרטורה של 280 מעלות צלזיוס במצב ללא פיצול, תוך שמירה על נפח ההזרקה של 1.5 μL. לאחר 0.75 דקות של ההזרקה, פתח את הפיצול בקצב זרימה של 40 מ"ל לדקה.
הערה: בין הזרקות, יש לשטוף את מזרק 10 μL שלוש פעמים עם אתיל אצטט ושלוש פעמים עם ציקלוהקסן. כל הזריקות הן כפולות. - נתחו את האנליזות במצב ניטור יונים נבחרים (SIM). זהו המצב הסטנדרטי המשמש במערכות MS עם מרובע יחיד.
הערה: טבלה 1 מציגה את זמני השמירה (min) ואת פרמטרי הכימות בהתבסס על שימוש בכמות אחת ושני יוני זיהוי עבור ה- OCPs וה- IS. הניתוח הכמותי מבוסס על היחס בין שטח השיא של היון הכמותי לבין היון של IS.
5. איסוף נתונים
- פתח את תוכנת הרכישה MassHunter השולטת בכל הפרמטרים של מערכת GC-MS.
- פתח את האפשרות "רצף" בסרגל הכלים וערוך את הרצף, כולל שם המדגם, מספר הבקבוקון, מספר הזריקות, השיטה האינסטרומנטלית ושם הקובץ שייווצר. הוסף שורות רבות ככל הנדרש.
- לחץ על אישור, ושמור את הרצף החדש.
- פתח שוב את האפשרות "רצף" בסרגל הכלים ולחץ על הפעל רצף בתפריט הנפתח. חלון חדש ייפתח כדי לאשר את שיטת ההזרקה ואת התיקיה שבה יישמרו הדגימות. לחץ שוב על רצף ריצה , וההזרקה תתחיל.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
האימות המלא של השיטה האנליטית בוצע במונחים של ליניאריות, אפקטים מטריצה, התאוששות, וחזרתיות.
עקומות כיול תואמות מטריצה עם דגימות ריקות מחודדות בשש רמות ריכוז (5 מיקרוגרם/ק"ג, 10 מיקרוגרם/ק"ג, 50 מיקרוגרם/ק"ג, 100 מיקרוגרם/ק"ג, 200 מיקרוגרם/ק"ג ו-400 מיקרוגרם/ק"ג) שימשו להערכת הלינאריות. מקדמי הקביעה (R2) היו גבוהים או שווים ל-0.99 עבור כל ה-OCPs. רמת הכיול הנמוכה ביותר (LCL) נקבעה על 5 מיקרוגרם/ק"ג, העומדת במגבלה המרבית המותרת שנקבעה על 10 מיקרוגרם/ק"ג למטרות ניטור ביישומי מזון11.
הערכת אפקט המטריצה בוצעה על ידי השוואת השיפועים של עקומות כיול OCP בממס טהור ועקומות כיול תואמות מטריצה. אפקט המטריצה חושב באמצעות המשוואההבאה 12:
אפקט מטריצה (%) = (שיפוע עקומת הכיול התואמת למטריצה − שיפוע עקומת הכיול המבוססת על ממס טהור)/(שיפוע עקומת הכיול המבוססת על ממס טהור) × 100.
איור 2 מציג את התפלגויות אפקט המטריצה עבור ה-OCPs שנחקרו על-ידי יישום שיטת QuEChERS שונה באמצעות פורמט אמוניום לדגימות קרקע. אחוזי אפקט מטריצה חיובית תואמים לשיפור אות, בעוד שאחוזים שליליים פירושם שיש דיכוי אותות. באופן ספציפי, (1) ערכים הנעים בין −20% ל- 20% מתאימים לאפקט מטריצה רכה; (2) ערכים הנעים בין −20% ל-50% או בין 20% ל-50% תואמים לאפקט מטריצה בינונית; (3) וערכים גבוהים מ- 50% או נמוכים מ- −50% פירושם שקיים אפקט מטריצה חזק. כפי שנצפה, יותר OCPs סבלו מהשפעות מטריצה רכות או בינוניות, בעוד שפחות OCPs סבלו מהשפעות מטריצה חזקות.
ההתאוששות ויכולת החזרה הוערכו על ידי זריקת דגימות ריקות עם חומרי הדברה בשלוש רמות ריכוז (10 מיקרוגרם/ק"ג, 50 מיקרוגרם/ק"ג ו-200 מיקרוגרם/ק"ג). איור 3 מציג את ערכי ההתאוששות הכוללים ואת ערכי סטיית התקן היחסית (RSD) עבור כל חומרי ההדברה ורמות הספיקינג (n = 9). כפי שניתן לראות, הרוב הגדול של ה- OCPs שנחקרו הציגו אחוזי התאוששות ממוצעים בטווח של 70%-120%, עם RSDs נמוכים מ -20%, למעט heptachlor, endrin, ו- β-endosulfan, אשר נתן התאוששות ממוצעת מעט גבוהה יותר.
איור 1: ייצוג של שיטת QuEChERS ששונתה תוך שימוש בפורמט אמוניום להפקת שאריות חומרי הדברה מדגימת הקרקע. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 2: התפלגות השפעות המטריצה לעומת זמני שמירה (דקות) עבור 17 OCPs. אפקט מטריצה רכה מתאים לערכים שבין −20% ל-20%; אפקט מטריצה בינונית מתאים לערכים הנעים בין −20% ל-−50% או בין 20% ל-50%; אפקט מטריצה חזק מתאים לערכים הגדולים מ- 50% או פחות מ- −50%. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 3: התאוששות ממוצעת של 17 OCPs לאחר עלייה של 10 מיקרוגרם/ק"ג, 50 מיקרוגרם/ק"ג ו-200 מיקרוגרם/ק"ג (n = 9) בדגימת הקרקע. מספר האנליטים בטווח ההתאוששות המקובל (70%-120%) וה-RSD (<20%) מסופקים, יחד עם אלה המסומנים מחוץ לטווח זה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
| אנליזה | זמן שמירה (מינימום) | יון קוונטיפייר | יון מזהה 1 | יון כשיר 2 |
| α-BHC | 11.35 | 181 | 219 | 111 |
| β-BHC | 11.90 | 181 | 219 | 109 |
| לינדן | 12.01 | 181 | 183 | 219 |
| δ-BHC | 12.39 | 181 | 219 | 111 |
| הפטכלור | 13.24 | 272 | 100 | 274 |
| אולדרין | 13.94 | 263 | 66 | 265 |
| הפטכלור אפוקסיד | 14.86 | 353 | 355 | 81 |
| α-אנדוסולפן | 15.71 | 241 | 239 | 195 |
| 4,4'-DDE-d8 (IS) | 16.09 | 254 | 184 | 326 |
| 4,4'-DDE | 16.12 | 246 | 318 | 248 |
| דילדרין | 16.18 | 79 | 263 | 81 |
| אנדרין | 16.57 | 263 | 317 | 345 |
| β-אנדוסולפן | 16.73 | 195 | 241 | 159 |
| 4,4'-DDD | 16.89 | 235 | 237 | 165 |
| אנדוסולפן סולפט | 17.61 | 387 | 227 | 272 |
| 4,4'-DDT | 17.65 | 235 | 237 | 165 |
| קטון אנדרין | 18.64 | 317 | 67 | 315 |
| מתוקסיכלור | 18.86 | 227 | 228 | 212 |
טבלה 1: זמני שמירה (דקות) ופרמטרים לכימות עבור ניתוח GC-MS של OCPs. אלפא-בנזןהקסכלוריד (α-BHC); בטא-בנזןהקסכלוריד (β-BHC); לינדן; דלתא-בנזןהקסכלוריד (δ-BHC); הפטכלור; אולדרין; הפטכלור אפוקסיד; α-אנדוסולפן; 4,4'-דיכלורודיפנילדיכלורואתילן-d8 (4,4'-DDE-d8) (IS); 4,4'-דיכלורודיפנילדיכלורואתילן (4,4'-DDE); דילדרין; אנדרין; β-אנדוסולפן; 4,4'-דיכלורודיפנילדיכלורואתאן (4,4'-DDD); אנדוסולפן סולפט; 4,4'-דיכלורודיפנילטריכלורואתאן (4,4'-DDT); אנדרין קטון; מתוקסיכלור.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
9 המקורי ושתי הגרסאות הרשמיות13,14 של שיטת QuEChERS משתמשים במגנזיום גופרתי יחד עם נתרן כלורי, אצטט או מלחי ציטראט כדי לקדם הפרדת אצטוניטריל/תערובת מים במהלך המיצוי. עם זאת, מלחים אלה נוטים להיות מופקדים כמוצקים על פני השטח במקור ספקטרומטריית המסות (MS), מה שגורם לצורך בתחזוקה מוגברת של שיטות מבוססות כרומטוגרפיה נוזלית (LC)-MS. במונחים של התגברות על חסרונות אלה, González-Curbelo et al.15 דיווחו כי פורמט האמוניום הנדיף יותר פעל היטב כדי לגרום להפרדת פאזות ולמיצוי שאריות חומרי הדברה הן עבור ספקטרומטריית מסת LC והן עבור ספקטרומטריית מסת טנדם GC (MS/MS). מחקרים מאוחרים יותר השתמשו גם ב-0.5 גרם של אמוניום פורמטה לגרם דגימה כדי לחלץ שאריות חומרי הדברה ממטריצות מורכבות שונות16,17,18,19. בנוסף, השימוש בפורמט אמוניום הוכח כמספק כמויות נמוכות יותר של חומר המופק במשותף20, מה שמצדיק את השימוש בו לשיטות מבוססות GC-MS. המחקר הנוכחי, לראשונה, מדווח על גרסה זו לניתוח שאריות חומרי הדברה בקרקעות21.
לניתוח GC של שאריות חומרי הדברה במטריצות מורכבות כגון קרקעות יש מגבלות מסוימות בגלל פעולתם של מרכיבי המטריצה המופקים במשותף על התגובה האינסטרומנטלית של חומרי ההדברה, מה שגורם לקביעה לא מדויקת ולרגישות נמוכה יותר22,23. לפיכך, נעשו מספר שיפורים כדי למזער את אפקט המטריצה, כולל שלבי ניקוי אופטימליים21. עם זאת, אפקט המטריצה עדיין מתרחש ויש לתקן אותו ככל האפשר. במובן זה, כיול תואם מטריצה היה הגישה העיקרית המשמשת מכיוון שהיא מעשית מאוד בפיצוי על שיפור האות הכרומטוגרפי ביחס לזה של ממסים טהורים24. לפיכך, במחקר זה, הלינאריות הוערכה על ידי בניית עקומות הכיול באצטוניטריל טהור ושימוש בתמציות קרקע, וערכי R2 גבוהים או שווים ל-0.99 עבור כל ה-OCPs התקבלו באמצעות שתי הגישות. עם זאת, כאשר הושוו שתי עקומות הכיול, נמצאו השפעות מטריצה ניכרות בטווח של -49% עד 191% (איור 2). למרות שמספר חומרי ההדברה שסבלו מאפקט מטריצה חזק היה רק 3 מתוך 17 (אנדרין, אנדרין קטון ומתוקסיכלור), מחקרים מאוחרים יותר בוצעו באמצעות עקומות כיול תואמות מטריצה כדי לפצות על השפעות המטריצה במידה רבה יותר.
לא נקבעו מגבלות מרביות על שאריות חומרי הדברה בקרקע, אך LCL של 5 מיקרוגרם/ק"ג נקבע לכל ה-OCPs, שהוא נמוך יותר מה-MRL הסטנדרטי התובעני מאוד שנקבע על 10 מיקרוגרם/ק"ג על ידי החקיקה הבינלאומית לניתוח שאריות חומרי הדברה במוצרי מזון חקלאי (תקנה 396/2005)11. בנוסף, ה-LCL של 5 מיקרוגרם/ק"ג סיפק יחס אות לרעש (S/N) של כ-10 עבור כל ה-OCPs. הרגישות הגבוהה של שיטה זו דומה או אפילו טובה יותר מזו שהתקבלה במחקרים אחרים שניתחו גם OCPs בקרקעות באמצעות שיטת QuEChERS ואחריה GC-MS. לדוגמה, במחקר אחד, 34 OCPs נותחו באמצעות הגרסה הרשמית של שיטת QuEChERS המשתמשת במאגר ציטראט, וגבולות הכימות (LOQs) היו שווים או גבוהים מ-7 מיקרוגרם/ק"ג25. בפרט, ערכי ה-LOQ של α-BHC, β-BHC, לינדן ו-δ-BHC היו בין 206 מיקרוגרם/ק"ג ל-384 מיקרוגרם/ק"ג. בעבודה אחרת נותחו לינדן ודילדרין באותה גרסה של שיטת QuEChERS, והתקבלו ערכי LOQ של 42 מיקרוגרם/ק"ג ו-292 מיקרוגרם/ק"ג, בהתאמה26. כמו כן, עבודת מחקר נוספת קבעה גם אולדרין והפטכלור באמצעות QuEChERS ו- GC-MS, עם ערכי LOQ של 13 ו -23 מיקרוגרם לק"ג,בהתאמה 27.
הערכת ההתאוששות והשכפול פותחה בשלוש רמות ריכוז (נמוכה, בינונית וגבוהה) במשולש (n = 9). לשם כך, ערכי ההתאוששות הכוללים נקבעו על ידי השוואת יחסי שטח השיא של חומרי ההדברה/IS (4,4'-DDE-d8) שהתקבלו מדגימות הקרקע שעלו בתחילת היישום של שיטת QuEChERS באמצעות פורמט אמוניום עם אלה של כיול תואם מטריצה. בכל המקרים, כל שכפול הוזרק פעמיים באותו רצף. יש לציין כי השימוש ב-IS, תקן המסומן באופן איזוטופי, מאפשר לפצות על ההפסדים האפשריים של חומרי ההדברה המתרחשים במהלך כל ההליך, כמו גם על אפקט המטריצה ו/או השונות האפשרית במכשיר. על פי התוצאות, רוב חומרי ההדברה עמדו בקריטריוני הקבלה של ערכי התאוששות של 70%-120% עם RSD ≤20% בכל רמת ספיקינג28, שהדגימו את היעילות והחזרתיות של השיטה. עם זאת, ערכי ההחלמה הכוללים (n = 9) היו מעט גבוהים מ-120% עבור הפטכלור (122%), אנדרין (121%) ואנדוסולפן β (130%), למרות שהם היו עקביים (RSDs <13%). במובן זה, בהתחשב בערכי ההתאוששות הכוללים בשלוש רמות ספייקינג, נקבע קריטריון קבילות של 30%-140% עם ערכי RSD ≤20%28.
לסיכום, שיטת QuEChERS המשתמשת בפורמט אמוניום בשילוב עם GC-MS יכולה לקבוע בהצלחה OCPs בדגימות קרקע חקלאיות. במחקר זה הוכח כי תוספת פשוטה של 5 גרם של אמוניום פורמטה כדי לגרום להפרדת פאזות בין שכבות המים והאצטוניטריל הבטיחה מיצוי מתאים עם התאוששות גבוהה של חומרי ההדברה שנבחרו. עם זאת, אפקט המטריצה המשיך להתקיים, ולכן גישות אחרות, כגון תוספת של מגנים אנליטיים, יש ללמוד בעבודות הבאות. בכל מקרה, חלופה זו לגרסאות הרשמיות של QuEChERS עשויה לשמש כדי למנוע את המוצקים הבלתי רצויים שהופקדו במערכת האנליטית עקב השימוש במלחי מגנזיום ונתרן, במיוחד בניתוח שגרתי מבוסס LC-MS. במקרה האחרון, זה יהיה אפילו יותר מעניין שכן אמוניום formate הוא סיוע ליינון יינון אלקטרוספריי חיובי עשוי לשפר את היווצרותם של אמוניום adducts במקום תוספות נתרן.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין לי ניגודי עניינים לחשוף.
Acknowledgments
אני רוצה להודות לחאבייר הרננדס-בורחס וססיליה אורטגה-זמורה על תמיכתם שלא תסולא בפז. אני גם רוצה להודות לאוניברסיטת EAN ולאוניברסיטת לה לגונה.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL disposable glass conical centrifuge tubes | PYREX | 99502-15 | |
| 2 mL centrifuge tubes | Eppendorf | 30120094 | |
| 50 mL centrifuge tubes with screw caps | VWR | 21008-169 | |
| 5977B mass-selective detector | Agilent Technologies | 1617R019 | |
| 7820A gas chromatography system | Agilent Technologies | 16162016 | |
| Acetone | Supelco | 1006582500 | |
| Acetonitrile | VWR | 83642320 | |
| Ammonium formate | VWR | 21254260 | |
| Automatic shaker KS 3000 i control | IKA | 3940000 | |
| Balance | Sartorius Lab Instruments Gmbh & Co | ENTRIS224I-1S | |
| Bondesil-C18, 40 µm | Agilent Technologies | 12213012 | |
| Bondesil-PSA, 40 µm | Agilent Technologies | 12213024 | |
| Cyclohexane | VWR | 85385320 | |
| EPA TCL pesticides mix | Sigma Aldrich | 48913 | |
| Ethyl acetate | Supelco | 1036492500 | |
| G4567A automatic sampler | Agilent Technologies | 19490057 | |
| HP-5ms Ultra Inert (5%-phenyl)-methylpolysiloxane 30 m x 250 µm x 0.25 µm column | Agilent Technologies | 19091S-433UI | |
| Magnesium sulfate monohydrate | Sigma Aldrich | 434183-1KG | |
| Mega Star 3.R centrifuge | VWR | 521-1752 | |
| Milli-Q gradient A10 | Millipore | RR400Q101 | |
| p,p'-DDE-d8 | Dr Ehrenstorfer | DRE-XA12041100AC | |
| Pipette tips 2 - 200 µL | BRAND | 732008 | |
| Pipette tips 5 mL | BRAND | 702595 | |
| Pipette tips 50 - 1000 uL | BRAND | 732012 | |
| Pippette Transferpette S variabel 10 - 100 µL | BRAND | 704774 | |
| Pippette Transferpette S variabel 100 - 1000 µL | BRAND | 704780 | |
| Pippette Transferpette S variabel 20 - 200 µL | BRAND | 704778 | |
| Pippette Transferpette S variabel 500 - 5000 µL | BRAND | 704782 | |
| Vials with fused-in insert | Sigma Aldrich | 29398-U | |
| OCPs | CAS registry number | ||
| α-BHC | 319-84-6 | ||
| β-BHC | 319-85-7 | ||
| Lindane | 58-89-9 | ||
| δ-BHC | 319-86-8 | ||
| Heptachlor | 76-44-8 | ||
| Aldrin | 309-00-2 | ||
| Heptachlor epoxide | 1024-57-3 | ||
| α-Endosulfan | 959-98-8 | ||
| 4,4'-DDE-d8 (IS) | 93952-19-3 | ||
| 4,4'-DDE | 72-55-9 | ||
| Dieldrin | 60-57-1 | ||
| Endrin | 72-20-8 | ||
| β-Endosulfan | 33213-65-9 | ||
| 4,4'-DDD | 72-54-8 | ||
| Endosulfan sulfate | 1031-07-8 | ||
| 4,4'-DDT | 50-29-3 | ||
| Endrin ketone | 53494-70-5 | ||
| Methoxychlor | 72-43-5 |
References
- Sabzevari, S., Hofman, J. A worldwide review of currently used pesticides' monitoring in agricultural soils. Science of The Total Environment. 812, 152344 (2022).
- Tzanetou, E. N., Karasali, H. A. Comprehensive review of organochlorine pesticide monitoring in agricultural soils: The silent threat of a conventional agricultural past. Agriculture. 12 (5), 728 (2022).
- Farenhorst, A. Importance of soil organic matter fractions in soil-landscape and regional assessments of pesticide sorption and leaching in soil. Soil Science Society of America Journal. 70 (3), 1005-1012 (2006).
- Silva, V., et al. Pesticide residues in European agricultural soils - A hidden reality unfolded. Science of The Total Environment. 653, 1532-1545 (2019).
- Vischetti, C., et al. Sub-lethal effects of pesticides on the DNA of soil organisms as early ecotoxicological biomarkers. Frontiers in Microbiology. 11, 1892 (2020).
- Alengebawy, A., Abdelkhalek, S. T., Qureshi, S. R., Wang, M. -Q. Heavy metals and pesticides toxicity in agricultural soil and plants: Ecological risks and human health implications. Toxics. 9 (3), 42 (2021).
- Zikankuba, V. L., Mwanyika, G., Ntwenya, J. E., James, A. Pesticide regulations and their malpractice implications on food and environment safety. Cogent Food & Agriculture. 5 (1), 1601544 (2019).
- Varela-Martínez, D. A., González-Sálamo, J., González-Curbelo, M. Á, Hernández-Borges, J. Quick, Easy, Cheap, Effective, Rugged and Safe (QuEChERS) extraction. Handbooks in Separation Science. , Elsevier. Amsterdam, the Netherlands. 399-437 (2020).
- Anastassiades, M., Lehotay, S. J., Štajnbaher, D., Schenck, F. J. Fast and easy multiresidue method employing acetonitrile extraction/partitioning and "dispersive solid-phase extraction" for the determination of pesticide residues in produce. Journal of AOAC International. 86 (2), 412-431 (2003).
- González-Curbelo, M. Á, et al. Evolution and applications of the QuEChERS method. Trends in Analytical Chemistry. 71, 169-185 (2015).
- European Union. European Regulation (EC) NO 396/2005 of the European Parliament and of the Council of 23 February 2005 on maximum residue levels of pesticides in or on food and feed of plant and animal origin and amending Council Directive 91/414/EEC. Official Journal of the European Union. 70, 1-16 (2005).
- Kwon, H., Lehotay, S. J., Geis-Asteggiante, L. Variability of matrix effects in liquid and gas chromatography-mass spectrometry analysis of pesticide residues after QuEChERS sample preparation of different food crops. Journal of Chromatography A. 1270, 235-245 (2012).
- Lehotay, S. J., et al. Determination of pesticide residues in foods by acetonitrile extraction and partitioning with magnesium sulfate: Collaborative study. Journal of AOAC International. 90 (2), 485-520 (2007).
- European Committee for Standardization (CEN). Standard Method EN 15662. Food of plant origin-Determination of pesticide residues using GC-MS and/or LC-MS/MS following acetonitrile extraction/partitioning and clean-up by dispersive SPE-QuEChERS method. European Committee for Standardization. , (2008).
- González-Curbelo, M. Á, Lehotay, S. J., Hernández-Borges, J., Rodríguez-Delgado, M. Á Use of ammonium formate in QuEChERS for high-throughput analysis of pesticides in food by fast, low-pressure gas chromatography and liquid chromatography tandem mass spectrometry. Journal of Chromatography A. 1358, 75-84 (2014).
- Han, L., Sapozhnikova, Y., Lehotay, S. J. Method validation for 243 pesticides and environmental contaminants in meats and poultry by tandem mass spectrometry coupled to low-pressure gas chromatography and ultrahigh-performance liquid chromatography. Food Control. 66, 270-282 (2016).
- Lehotay, S. J., Han, L., Sapozhnikova, Y. Automated mini-column solid-phase extraction clean-up for high-throughput analysis of chemical contaminants in foods by low-pressure gas chromatography-tandem mass spectrometry. Chromatographia. 79 (17), 1113-1130 (2016).
- Lehotay, S. J. Possibilities and limitations of isocratic fast liquid chromatography-tandem mass spectrometry analysis of pesticide residues in fruits and vegetables. Chromatographia. 82 (1), 235-250 (2019).
- Han, L., Matarrita, J., Sapozhnikova, Y., Lehotay, S. J. Evaluation of a recent product to remove lipids and other matrix co-extractives in the analysis of pesticide residues and environmental contaminants in foods. Journal of Chromatography A. 1449, 17-29 (2016).
- Varela-Martínez, D. A., González-Curbelo, M. Á, González-Sálamo, J., Hernández-Borges, J. Analysis of pesticides in cherimoya and gulupa minor tropical fruits using AOAC 2007.1 and ammonium formate QuEChERS versions: A comparative study. Microchemical Journal. 157, 104950 (2020).
- González-Curbelo, M. Á, Varela-Martínez, D. A., Riaño-Herrera, D. A. Pesticide-residue analysis in soils by the QuEChERS method: A review. Molecules. 27 (13), 4323 (2022).
- Anastassiades, M., Maštovská, K., Lehotay, S. Evaluation of analyte protectants to improve gas chromatographic analysis of pesticides. Journal of Chromatography A. 1015 (1-2), 163-184 (2003).
- Maštovská, K., Lehotay, S., Anastassiades, M. Combination of analyte protectants to overcome matrix effects in routine GC analysis of pesticide residues in food matrixes. Analytical Chemistry. 77 (24), 8129-8137 (2005).
- Rahman, M., Abd El-Aty, A., Shim, J. Matrix enhancement effect: A blessing or a curse for gas chromatography? - A review. Analytica Chimica Acta. 801, 14-21 (2013).
- Rouvire, F., Buleté, A., Cren-Olivé, C., Arnaudguilhem, C. Multiresidue analysis of aromatic organochlorines in soil by gas chromatography-mass spectrometry and QuEChERS extraction based on water/dichloromethane partitioning. Comparison with accelerated solvent extraction. Talanta. 93, 336-344 (2012).
- Lesueur, C., Gartner, M., Mentler, A., Fuerhacker, M. Comparison of four extraction methods for the analysis of 24 pesticides in soil samples with gas chromatography-mass spectrometry and liquid chromatography-ion trap-mass spectrometry. Talanta. 75 (1), 284-293 (2008).
- Ðurović-Pejčev, R. D., Bursić, V. P., Zeremski, T. M. Comparison of QuEChERS with traditional sample preparation methods in the determination of multiclass pesticides in soil. Journal of AOAC International. 102 (1), 46-51 (2019).
- European Commission. SANTE/11312/2021. Guidance document on analytical quality control and method validation procedures for pesticide residues analysis in food and feed. European Commission. , (2021).
