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Biology

가벼운 함정으로 Marine Gnathiid Isopod 물고기 기생충 수집

Published: September 25, 2023 doi: 10.3791/65059

Summary

우리는 숨참기 다이빙 또는 스쿠버 다이빙을 통해 현장 현장에 배치된 가벼운 함정을 사용하여 해양 gnathiid isopod 물고기 기생충을 수집하는 방법을 제시합니다.

Abstract

가벼운 함정을 사용하여 해양 gnathiid isopod 물고기 기생충을 수집하는 방법이 제시됩니다. Gnathiid isopods는 주로 밤에 숙주 물고기의 혈액과 체액을 먹는 해양 물고기 기생충의 주요 그룹입니다. 육지의 진드기와 모기처럼, 그들은 일시적으로 숙주와 어울리고 대부분의 삶을 저수지에서 자유롭게 보냅니다. 높은 이동성과 일시적이고 주로 야행성 숙주와의 연관성을 감안할 때, 그들은 자유 생활 숙주를 포획하여 쉽게 수집 할 수 없습니다. 그러나 그들은 수중 광원에 쉽게 끌려 라이트 트랩에서 수집 할 수있는 기회를 만듭니다. 여기에서는 gnathiid isopods의 자유 생활 단계를 수집하기 위해 특별히 개조 된 라이트 트랩의 배치 및 처리와 관련된 설계 및 개별 단계가 요약되어 있습니다. 다양한 샘플링 요구 사항에 대한 샘플 결과 및 기본 프로토콜의 가능한 수정이 제시되고 논의됩니다.

Introduction

기생 갑각류는 암초 물고기의 생태와 생활사에서 중요합니다. 숙주에서 제거하는 바이오매스와 에너지는 상당하며 행동, 생리학 및 생존에 영향을 미친다1. Gnathiid isopod 갑각류는 열대 및 아열대 암초 시스템에서 가장 두드러진 물고기 기생충 그룹을 대표하며, 풍부하고 다양하며2,3 청정 물고기 4,5의 주요 먹이입니다. Gnathiids의 크기는 일반적으로 1-3mm입니다. 그들은 3 개의 어린 단계 만이 물고기의 혈액과 체액을 먹는 특이한 삶의 역사를 가지고 있습니다 6,7. 그들은 밤 8,9 가장 활동적이며, 시각이 어느 정도 역할을 하는 것처럼 보이지만, 숙주 찾기10는 숙주를 찾기 위해 후각 신호에 크게 의존한다(11,12). 세 가지 어린 먹이 단계 각각은 단일 숙주 물고기를 먹으며 각 사료는 털갈이 단계로 구분됩니다. 최종 사료 공급 후, 3 단계 유충은 먹이를 먹지 않는 성인으로 변태하여 번식 한 다음 죽습니다. 먹이를 먹는 것은 숙주와의 짧은 교제만 필요로 하는 반면, 각 수유 간격은 며칠 동안 지속된다는 점을 감안할 때, gnathiids는 대부분의 삶을 저수지에서 자유롭게 생활합니다.

Gnathiids는 여러 가지 방식으로 호스트에 영향을 미칩니다1. 청산어류와 내담자 사이의 상호작용을 유도하는 역할 외에도13,14,15, 그나티드는 성체 어류 숙주에서 코티솔 수치를 증가시키고 헤마토크릿을 감소시킬 수 있으며16 많은 수의 경우 사망에 이르게 할 수도 있다 17. 어린 물고기의 경우, 단 하나의 gnathiid조차도 치명적일 수 있습니다18,19,20, 물고기가 살아남더라도 공간을 놓고 경쟁하고 포식자를 탈출하는 능력은 손상됩니다 20,21,22. gnathiids를 피하는 것은 일부 암초 물고기에서 야행성 이동의 이점 중 하나가 될 수도 있습니다23.

깨끗한 물고기 외에도 gnathiid 개체군은 다른 미세 육식성 물고기24와 산호25,26의 영향을받을 수 있습니다. 해양 온난화와 살아있는 산호의 관련 손실은 gnathiids27,28,29에 반대되는 영향을 미치는 것으로 보입니다.

그들의 명확한 생태 학적 중요성과 인위적인 환경 변화가 인구에 미치는 영향을 감안할 때, 산호초에 대한 생태 학적 연구에 그들을 포함시켜야 할 강력한 이유가 있습니다. 그러나 그들의 독특한 생활사와 이를 연구하는 소수의 연구자는 연구를 위해 수집하기 위한 신뢰할 수 있고 재현 가능한 샘플링 방법의 개발, 구현 및 보급에 장벽을 만듭니다.

라이트 트랩은 밤에 작은 해양 생물을 수집하기 위해 오랫동안 사용되어 왔습니다30,31. 그들은 절지 동물을 포함한 많은 야행성 활성 유기체가 빛에 끌린다는 사실을 이용하고 근거합니다. 전통적으로 그들은 물기둥(30)에서 플랑크톤 유기체를 수집하는데 사용되어 왔다. 그러나 기본 원칙은 벤토 근처에서 활동하는 자유 수영 유기체를 수집하는 데 적용될 수 있습니다. 여기에서 우리는 필리핀과 같은 외딴 산호초 환경에서 해저 근처의 그나티이드 등각류의 자유 생활 단계를 수집하는 데 적합한 가벼운 트래핑 방법을 제시합니다. 외딴 지역에서의 채취를 위해, 이러한 광 트랩(도 1)은 이들 유기체를 채집하기 위해 개발된 다른 방법들에 비해 몇 가지 이점을 제공한다32. 휴대성과 내구성이 뛰어나 세 부분만 필요하며 쉽게 구할 수 있고 저렴합니다. 그들은 또한 배치될 때 바닷물로 완전히 채워지기 때문에 부력이 음수입니다. 그들은 매력을 위해 빛에 의존하기 때문에 야행성 활동 종을 수집하는 데 밤에만 효과적입니다. 그들은 또한 표적 종보다 더 많은 것을 끌어들이기 때문에 표적 유기체를 얻기 위해 해부 범위 내에서 샘플을 분류해야 합니다. 지금까지 우리 팀과 공동 연구자들은 전 세계의 산호초 시스템에서 gnathiids를 수집하기 위해 세 가지 방법을 사용했습니다32. 여기에는 출현 함정, 활어 미끼 함정 및 가벼운 함정이 포함되며 각각 장점과 한계가 있습니다.

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Protocol

샘플 수집은 필리핀 법률 및 규정(RA 9147; FAO 233) 및 Silliman University(SU) 동물 윤리 위원회의 승인을 받았습니다.

1. 라이트 트랩

  1. 건축
    1. 원래 배관용으로 설계된 상업용 폴리염화비닐(PVC) 튜브로 라이트 트랩을 구성합니다. 30-40cm 길이로 자른 직경 10-15cm의 PVC를 사용합니다(그림 1).
    2. 튜브의 양쪽 끝에 투명 아크릴 깔때기가 삽입된 PVC "캡"을 개구부 중앙에 추가하고 투명 에폭시 접착제로 제자리에 접착제를 붙입니다(그림 1). 말리십시오.
    3. 튜브의 한쪽 끝에 나사로 고정되거나 제거 가능한 뚜껑이 있고 트랩이 "닫힌" 때(: O-링 추가) 양쪽 끝이 방수되는지 확인하십시오.
  2. 광원
    1. 배치하기 전에 수중 조명/토치( 재료 표 참조)를 켜고 투명 깔때기 중 하나를 향하여 튜브에 넣어 수중 토치의 빛이 튜브 한쪽 앞 영역을 비추도록 합니다. 필요한 경우 수중 토치 대신 화학 글로우 스틱을 사용할 수 있지만 광도는 더 낮습니다.
      참고: 빛은 그나티드를 포함한 다양한 작은 야행성 유기체(31)를 끌어당기고, 이들이 투명한 깔때기를 통해 튜브 안으로 헤엄치도록 유도한다. 일단 튜브에 들어가면 라이트 트랩(작은 깔때기 개구부)의 기하학적 구조와 광원의 지속적인 존재로 인해 탈출할 수 없습니다.
  3. 배치
    1. 배치 현장의 물에 있을 때는 조명을 켠 상태에서 라이트 트랩을 바닷물로 채우고 양쪽 끝을 고정합니다. 토치가 깔때기 끝 아래에 있거나 막히지 않도록 하려면 튜브의 "전면"을 위쪽으로 기울여 토치가 깔때기에서 뒤로 미끄러질 수 있도록 합니다.
    2. 해저, 모래 또는 잔해, 산호 머리 또는 물고기를 유인하는 것으로 알려진 기타 복잡한 구조물 옆에 덫을 놓으십시오. 라이트 콘을 물고기가 모이는 영역을 향해 "안쪽"으로 초점을 맞춥니다.
      알림: 얕은 물에서는 숨을 참는 다이빙으로 트랩을 설치할 수 있습니다. 더 깊은 배포에는 스쿠버가 필요합니다.
  4. 검색
    1. 트랩을 회수하기 직전에 모델링 점토 또는 고무 마개 밀봉으로 두 깔때기(튜브의 양쪽 끝)의 구멍을 밀봉하여 모든 바닷물과 포함된 유기체를 내부에 유지합니다.
      알림: 유기체는 조명의 배터리가 만료되고 조명이 더 이상 켜지지 않으면 트랩에 남아 있습니다. 이렇게 하면 트랩을 회수할 때 유연성이 제공됩니다("담그는 시간"). 담그는 시간을 결정할 때 고려해야 할 요소는 다음과 같습니다(토론 참조).
  5. 수송
    1. 함정이 바닥에서 회수되면 보트로 옮기거나 해변으로 헤엄쳐 가십시오.
    2. 바다에서 제거한 후 주변 해수 온도에 가깝게 트랩을 유지하십시오.
    3. 바다에서 제거되면 가스나 물 교환이 일어나지 않으므로 가능한 한 빨리 처리를 위해 실험실로 운송하십시오.

2 실험실 처리

  1. 시료 저장 및 필터링
    1. 라이트 트랩이 바다에서 제거되어 실험실로 다시 가져온 후에는 내용물을 신선한 바닷물이 담긴 양동이에 비우십시오.
    2. 여과 할 때까지 유기체를 살아있게하기 위해 통기를 추가하십시오.
    3. 50-100μm 플랑크톤 메쉬가 늘어선 깔때기를 통해 버킷의 내용물을 걸러낸 다음 내용물을 신선한 바닷물이 담긴 100mL 용기에 비웁니다.
    4. 피펫을 사용하여 이 작은 용기에서 추출하여 현미경 검사를 위해 샘플의 분취량을 페트리 접시에 넣습니다. 전체 샘플이 처리될 때까지 반복합니다.
  2. Gnathiid isopod 식별 및 양육
    1. 라이트 트랩 샘플은 여러 종의 작은 무척추 동물을 유인하기 때문에 샘플을 주의 깊게 선별하여 그나티이드 등각류를 식별하고 제거합니다. 이 작업에는 10-20x 배율이 가장 좋습니다(그림 2).
      참고: 가족 수준에서 그나티드를 식별하는 데는 살아있는 표본이 필요하지 않습니다. 그러나 가벼운 덫에 거의 걸리지 않는 성체 그나티이드는 형태학적 종 식별 및 번식에 필요합니다(포로 상태에서 그나티드를 번식하고 사육하는 방법론은 참조 1,3,9 참조).
    2. gnathiids가 양육을 위해 살아 있어야하는 경우, 피펫으로 부드럽게 제거하고 신선한 바닷물이 담긴 작은 플라스틱 용기에 넣으십시오.

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Representative Results

필리핀 중부에서 샘플링을 위해 윤곽이 그려진 트랩 설계(그림 1)가 사용되었습니다. 하룻밤 사이에 36 개의 덫을 설치했을 때 (한 장소에서) 덫 당 1-1343 마리의 gnathiids (275 ± 54)가 수집되었습니다. 여기에는 먹이를 먹은 유년기와 먹이지 않은 유년기가 모두 포함되었습니다(그림 2; 표 1, 2). 이러한 결과는 연구 조건 하에서 gnathiid isopods를 수집하기위한 광 트랩의 효과를 보여줍니다. 그림 3 은 수중 트랩의 배치를 보여줍니다.

그나티이드 수집을 위한 이 방법은 다양한 현장 및 과학적 질문에 효과적이고 충분히 유연합니다. 예를 들어, 참고 문헌29는 산호 덮개와 어류 바이오매스가 그나티드 풍부도에 미치는 영향을 정량화하기 위해 광 함정을 사용했으며(그림 4), 참고 문헌33은 유사한 함정을 사용하여 허리케인이 유전적 일배체형에 미치는 영향을 정량화했습니다(그림 5). 그나티드(gnathiids)32를 수집하기 위해 다른 기술들이 개발되어 사용되었지만, 이 기술은 특히 효율적이다(표 3). 플랑크톤 메쉬(32)로 만들어진 "텐트"인 출현 트랩은 운반하기 위해 큰 플랫폼이 필요하고, 배치가 어렵고, 쉽게 찢어지며, 지속적인 수리가 필요합니다. 또한, 그들은 먹이를 먹은 청소년 단계를 거의 수집하지 않습니다. 활어32로 미끼를 던진 함정(gnathiids는 죽은 물고기를 먹지 않기 때문에 필요함)은 활어를 포획하고 수용해야 합니다. 이것은 외딴 곳에서 사용하기를 더 어렵게 만듭니다. 또한, 그 효과는 물고기의 크기, 덫의 구멍 크기 및 물의 흐름에 영향을받는 후각 신호11,12에 의존합니다. 그들은 더 적은 수의 그나티드를 수집하는 경향이 있고, 가벼운 함정보다 회수하기가 더 어렵고, 먹이를 먹은 단계만 수집합니다.

Figure 1
그림 1: 라이트 트랩 PVC 튜브. 오른쪽: 평면도, 아크릴 접착제로 튜브에 접착된 반투명 깔때기가 보입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 2
그림 2: 포획 후 페트리 접시에 있는 gnathiid isopod. 물고기의 투명한 체액과 gnathiid의 내장에 있는 갈색 붉은 물고기의 피에 주목하십시오. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 3
그림 3: 조명이 아래로 향하는 수정된 라이트 트랩(전경) 이 설계는 잔잔한 바다 조건에서 트랩 아래의 기판을 보다 직접적으로 샘플링하는 데 사용할 수 있습니다. 출현 함정이 배경에 표시됩니다. 이 그림은 참고 문헌32의 허가를 받아 재인쇄되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 4
그림 4: 분포의 차이를 보여주는 상자 그림. (A) 1단계 그나티이드 풍부도, (B) 1단계 과다증식, (C) 총 풍부도, (D) 어류 바이오매스당 추출된 혈액량의 분포 차이를 보여주는 상자 그림. 각 부분군의 표본 크기는 각 부분군 평균 아래의 괄호 안에 표시됩니다. 상자에는 1사분위수 및 3사분위수 가장자리가 표시되고 수염에는 3사분위수에 사분위수 범위의 1.5배를 더한 값이 표시됩니다. (C)의 경우 힌지는 95% 신뢰 구간의 근사치입니다. (A), (B) 및 (C)에서 볼 수 있는 차이는 중요합니다. 참조 29의 부록 S1: 표S7을 참조하십시오. 이 그림은 참고 문헌29의 허가를 받아 재인쇄되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 5
그림 5: Gnathia marleyi 의 유전적 다양성과 2017년 허리케인 전후의 공간 분포를 나타내는 일배체형 네트워크. 허리케인 전후 데이터 세트는 각각 패널 I 및 II에 표시됩니다. 허리케인 전후 데이터 세트에서 발견되는 일배체형은 일배체형 번호로 표시됩니다. 하플로그룹 A, B 및 C는 점선 상자로 표시됩니다. 이 그림은 참고 문헌33의 허가를 받아 재인쇄되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그나티드 수 라이트 트랩 (n) 총 개수 의미하다 중앙값 최소(트랩당) 최대(트랩당) 표준 오차(+-)
합계 34 9336 275 191 1 1343 54
살다 34 6605 206 114 4 1226 46
죽은 34 2667 86 42 1 659 24

표 1: 2017년 7월부터 9월까지 필리핀 반타얀 산호초에서 하룻밤 동안 숨참기 다이빙을 통해 배치된 36개의 라이트 트랩에서 얻은 그나티드 수에 대한 요약 통계. Live 열의 숫자 값은 계수 당시 살아 있던 라이트 트랩의 gnathiids를 의미하고, Dead 열은 죽은 gnathiids를 의미하며, Total 열은 죽은 gnathiid와 살아있는 gnathiid 수의 합계입니다.

그나티드 수 N 총 개수 의미하다
합계 10 434 43

표 2: 2022년 7월부터 8월까지 필리핀 네그로스 오리엔탈 주 반타얀 산호초에 3시간 동안 배치된 라이트 트랩의 그나티이드 수에 대한 요약 통계.

트랩 유형 중앙값 95% CI
아래
미끼 없는 출현 0.31 0.04 0.81
물고기 미끼 출현 0.42 0.19 0.69
물고기 미끼 삼각대 0.92 0.46 1.46
오픈 메쉬 물고기 미끼 1.5 0.35 3.54
조명이 켜진 플랑크톤 트랩 5.69 2.69 9.58

표 3: 카리브해에서 라이트 트랩을 포함한 다양한 트랩 설계의 성능을 비교했습니다. 샘플당 중앙값 수와 각 트랩 설계에 대한 95% 신뢰 구간의 추정치가 다중 트랩 비교에서 평가되었습니다. 추정치는 10,000번의 부트스트래핑 반복에서 도출되었으며 각 트랩 유형에 대한 26개의 샘플 수에서 대체되었습니다. 이 표는 참고 문헌32의 허가를 받아 수정되었습니다.

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Discussion

애벌레 물고기를 수집하는 데 사용되는 것과 같은 전통적인 라이트 트랩은 크기가 커서 물기둥34에 매달려 있습니다. 대조적으로, 여기에 설명 된 라이트 트랩은 작고 해저에 배치됩니다. 이 트랩은 쉽게 운반하고 신속하게 배치 할 수 있습니다. 그들은 얕은 장소(이 연구에서와 같이)에서 숨을 참는 (자유) 다이빙이나 더 깊은 곳에서 스쿠버에 배치할 수 있으며, 먹이를 먹거나 먹이지 않은 사람을 모두 끌어들일 수 있습니다
청소년 단계.

그나티이드를 연구하기 위해 여기에 설명된 저서 광 트랩의 변형은 우리 팀과 공동 작업자에 의해 다양한 목적으로 사용되어 왔으며 특정 목적에 따라 설계 또는 프로토콜을 수정할 수 있습니다(그림 3). 이러한 내용은 아래에 설명되어 있습니다.

일부 연구에는 살아있는 gnathiids가 필요합니다. 여기에는 혈액 식사35,36의 출처 (물고기 종)를 확인하는 연구 또는 양육이 필요한 연구가 포함됩니다. 이 연구의 라이트 트랩은 길이 30cm, 직경 10.16cm이므로 부피는 ~1.3L입니다. 유기체로 지나치게 붐비면 튜브 내부의 산소 요구량이 포트를 통한 산소 전달을 초과하여 유기체가 죽고 문제를 악화시킬 수 있습니다. 이를 방지하기 위해 트랩을 더 짧은 기간 동안 배치하거나 부피 (더 큰 직경의 PVC)를 늘리거나 플랑크톤 메쉬 9,29,32로 덮인 추가 구멍을 추가하여 수정할 수 있습니다. 더 큰 직경의 PVC를 사용하여 부피를 늘릴 수 있지만 이는 휴대성이 낮아 현장 현장으로 더 적은 수의 트랩을 운반하는 결과를 초래합니다. 이는 운송이 확장된 표면 수영 및/또는 제한된 저장 공간을 가진 소형 보트의 사용을 포함할 때 특히 중요합니다.

대안적으로, 또는 추가적으로, 트랩은 더 짧은 기간 동안 배치될 수 있다. 이 디자인의 가장 큰 장점은 덫이 야간에만 유기체를 수집하지만 (빛이 효과적 일 때) 언제든지 설정하고 언제든지 회수 할 수 있다는 것입니다. 가능한 한 많은 그나티드를 모으기 위해 우리는 해가 지기 전에 덫을 설치하고 다음 날 해가 뜬 직후에 회수했습니다. 그러나 살아있는 gnathiids의 수를 최대화하기 위해 배치를 3-4 시간의 어둠으로 제한합니다. 짧은 설정 시간은 또한 gnathiids를 추출하기 위해 분류해야 하는 "bycatch"의 양을 줄입니다.

여기에 설명된 트랩은 수평으로 놓여 있으며 광선은 한 방향을 향하고 있습니다. 따라서 자극 신호는 빛이 비추는 한 멀리 확장되어 일반적으로 여러 기판 유형을 가로지르며 일부 빛은 후면 깔때기에서도 방출됩니다. 트랩에서 가까운 거리에 있는 특정 기판에 샘플링의 초점을 맞추기 위해 트랩은 빛이 아래쪽을 향하도록 수직으로 놓이도록 수정할 수 있습니다(그림 3). 이것은 삼각대(29,32)를 형성하기 위해 "다리"를 추가함으로써 달성된다. 그러나 이러한 유형의 라이트 트랩은 저전류 상황에서만 유용합니다.

우리가 사용한 토치(재료 표 참조)에는 AAA 배터리 4개가 필요합니다. 우리는 비용과 낭비를 줄이기 위해 충전식 배터리를 사용합니다. 이 조명의 연소 시간은 약 12시간으로 밤새 작동할 수 있습니다. 그러나 적절한 대체품은 "야광봉"입니다. 이들은 mesophotic 암초와 같은 더 깊은 물에 설정할 때 특히 유용합니다.

여기에 설명된 라이트 트랩은 다양한 범위의 작고 움직이는 무척추 동물을 끌어들이지만, 이 바이캐치의 구성은 매우 다양합니다. 그러나 잔해와 물고기가 포함된 서식지에 놓이면 그나티이드가 지속적으로 잡힙니다. 이 시범 연구는 필리핀의 현장에 초점을 맞추었지만 유사한 디자인의 함정이 카리브해 지역과 그레이트 배리어 리프 (Great Barrier Reef)의 현장에서의 연구에도 성공적으로 사용되었습니다.

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Disclosures

저자는 공개할 내용을 선언하지 않습니다.

Acknowledgments

자금은 미국 국립 과학 재단 (NSF OCE 2023420 및 DEB 2231250, P. Sikkel PI)에 의해 제공되었습니다. 이 연구를 수행할 수 있도록 허락해 주신 필리핀 네그로스 오리엔탈의 두마게티 시 시정촌에 감사드립니다. 또한 현장 지원을 해주신 많은 자원 봉사자들과 지원을 해주신 Silliman University Institute for Environmental and Marine Sciences의 직원 및 동료들에게도 감사드립니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Buckets, small sample containers hardware store
Funnels Supplier No. 2209-03 Funnels: AMERICAN SCIENTIFIC LLC SE - 75 mm (3”)  https://us.vwr.com/store/product/8884369/plastic-funnels
Main body of light traps (made from commercially available PVC sanitarty pipes) (SKU 145640)  Alasco Sanitary uPVC Pipes Series 1000 107mm/4'  https://alascopvcpipes.com/product/alasco-standard-sanitary-upvc-pipe-series-1000/.  This brand can be found in the Philippines. Other simular brands can also be used
Modeling clay  Can be found in art suppliy and childreans toy stores To seal the funnel after retreival
Plankton mesh (50-100 µm) any reputable brand and source https://www.adkinstruments.in/products/plankton-nets-in-various-mesh-size-1633936883
Screw on lids for the light trap Alasco  Sanitary  Clean-Out  4" https://alascopvcpipes.com/product/alasco-standard-sanitary-upvc-clean-out/. This brand can be found in the Philippines. Other simular brands can also be used
Scuba/snorkel equipment any reputable brand and source
Stereo-microscopes Scientific suppliers
Underwater touches Princeton Tec Ecoflare or Fantasea Nanospotter 6023

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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이번 달 JoVE 199호
가벼운 함정으로 Marine Gnathiid Isopod 물고기 기생충 수집
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Shodipo, M. O., Lauguico, R. Y.,More

Shodipo, M. O., Lauguico, R. Y., Stiefel, K. M., Sikkel, P. C. Collecting Marine Gnathiid Isopod Fish Parasites with Light Traps. J. Vis. Exp. (199), e65059, doi:10.3791/65059 (2023).

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