Summary
هنا ، نصف تحسنا في طريقة شبه المختبر (SIV) لمراقبة توجيه أنبوب حبوب اللقاح واستقباله في Arabidopsis thaliana ، مما يزيد من تقبل البويضات. قد تقترن طريقة SIV مع الحاجز عالي الإنتاجية بخطوط علامات النبات المشيجي وأجهزة الاستشعار الحيوية المشفرة وراثيا لمراقبة عملية الإخصاب الديناميكية.
Abstract
في النباتات الزهرية، يعد نمو أنبوب حبوب اللقاح وتوجيهه (النبات المشيجي الذكري) داخل المدقة واستقبال أنبوب حبوب اللقاح بواسطة النبات المشيجي الأنثوي ضروريين للتخصيب المزدوج وتطور البذور لاحقا. تبلغ التفاعلات بين النباتات المشيجية الذكرية والأنثوية أثناء استقبال أنبوب حبوب اللقاح ذروتها في تمزق أنبوب حبوب اللقاح وإطلاق حيوانين منويين لإحداث الإخصاب المزدوج. نظرا لأن نمو أنبوب حبوب اللقاح والإخصاب المزدوج مخفيان بعمق داخل أنسجة الزهرة ، فمن الصعب ملاحظة هذه العملية في الجسم الحي.
تم تطوير وتنفيذ طريقة شبه مخبرية (SIV) لتصوير الخلايا الحية للتخصيب في النبات النموذجي Arabidopsis thaliana في العديد من التحقيقات. ساعدت هذه الدراسات في توضيح السمات الأساسية لكيفية حدوث عملية الإخصاب في النباتات المزهرة والتغيرات الخلوية والجزيئية التي تحدث أثناء تفاعل النباتات المشيجية الذكرية والأنثوية. ومع ذلك ، نظرا لأن تجارب تصوير الخلايا الحية هذه تتضمن استئصال البويضات الفردية ، فإنها تقتصر على عدد قليل من الملاحظات لكل جلسة تصوير ، مما يجعل هذا النهج مملا ويستغرق وقتا طويلا للغاية. من بين الصعوبات التقنية الأخرى ، غالبا ما يتم الإبلاغ عن فشل أنابيب حبوب اللقاح في تخصيب البويضات في المختبر ، مما يربك بشدة مثل هذه التحليلات.
هنا ، يتم توفير بروتوكول فيديو مفصل لتصوير استقبال أنبوب حبوب اللقاح والتخصيب بطريقة آلية وعالية الإنتاجية ، مما يسمح بما يصل إلى 40 ملاحظة لاستقبال أنبوب حبوب اللقاح وتمزيقه لكل جلسة تصوير. إلى جانب استخدام أجهزة الاستشعار الحيوية المشفرة وراثيا وخطوط العلامات ، تتيح هذه الطريقة توليد أحجام عينات كبيرة مع تقليل استثمار الوقت. يتم تفصيل الفروق الدقيقة والنقاط الحرجة للتقنية ، بما في ذلك تدريج الزهور ، وتشريح ، وإعداد المتوسط ، والتصوير ، بوضوح في شكل فيديو لتسهيل البحث المستقبلي حول ديناميكيات توجيه أنبوب حبوب اللقاح والاستقبال والإخصاب المزدوج.
Introduction
يعتمد توليد نسل فريد وراثيا في الكائنات الحية التي تتكاثر جنسيا على الاندماج الناجح للجاميتات الذكرية والأنثوية. في النباتات الزهرية، يعتمد تفاعل جاميتين ذكريتين (منوية) مع جاميتين أنثويتين (البويضة والخلية المركزية) أثناء الإخصاب المزدوج على إطلاق الحيوانات المنوية من أنبوب حبوب اللقاح (النبات المشيجي الذكري). يتم التحكم في هذه العملية ، التي تسمى استقبال أنبوب حبوب اللقاح ، إلى حد كبير بواسطة الخلايا التآزرية الموجودة داخل كيس الجنين (النبات المشيجي الأنثوي)1,2. نظرا لأن استقبال أنبوب حبوب اللقاح يحدث في عمق الزهرة ، فقد تم إنشاء طريقة تسمح بتصوير الخلايا الحية للعملية ، تسمى استقبال أنبوب حبوب اللقاح شبه المختبري (SIV)، 3. باستخدام هذه الطريقة ، يتم وضع بويضات Arabidopsis المستأصلة على وسط إنبات حبوب اللقاح شبه السائلة ويتم استهدافها بواسطة أنابيب حبوب اللقاح التي تنمو من خلال وصمة العار وأسلوب المدقة المقطوعة عند تقاطع المسالك الناقلةللنمط 3،4. منذ تطوير هذه التقنية ، أدت الملاحظات التفصيلية إلى العديد من الاكتشافات المحيطة بتوجيه أنبوب حبوب اللقاح واستقباله وإخصابه. من بين أمور أخرى ، تشمل هذه الاكتشافات اكتساب أنبوب حبوب اللقاح الذي يستهدف الكفاءة من خلال النمو من خلال وصمة العار3 ، وبداية تذبذبات الكالسيوم داخل الخلايا في التآزر عند وصول أنبوب حبوب اللقاح5،6،7،8،9 ، وديناميكيات إطلاق خلايا الحيوانات المنوية والتخصيب عند انفجار أنبوب حبوب اللقاح10 . ومع ذلك ، نظرا لأن هذه التقنية تعتمد على استئصال البويضات ، فإن ملاحظات الإخصاب محدودة العدد ، وغالبا ما يكون استقبال أنبوب اللقاح شاذا ، مما يؤدي إلى فشل تمزق أنبوب حبوب اللقاح (الفيديو 1 والملف التكميلي 1). لذلك ، هناك حاجة إلى نهج أكثر كفاءة يسمح بإجراء تحليلات عالية الإنتاجية لاستقبال أنبوب حبوب اللقاح وتخصيبها.
عند تطوير هذا البروتوكول ، تم اختبار العديد من الأساليب الجديدة لتحليل استقبال أنبوب حبوب اللقاح ، والتي تمتد من أكثر الطرق "في المختبر" إلى أكثر الطرق "في الجسم الحي" ، وتم الاستقرار على تقنية فعالة تعتمد على استئصال الحاجز بأكمله ، مما يسمح بما يصل إلى 40 ملاحظة للتخصيب يوميا. هنا ، يتم تحديد الفروق الدقيقة والنقاط الحرجة لهذه التقنية ، بما في ذلك مراحل الزهور ، والتشريح ، والتحضير المتوسط ، وإعدادات التصوير. باتباع هذا البروتوكول ، يجب تسهيل الأبحاث التي تركز على توجيه أنبوب حبوب اللقاح واستقبال أنبوب حبوب اللقاح والإخصاب المزدوج. من المتوقع أن تعزز أحجام العينات الأعلى التي تسمح بها الطريقة السلامة العلمية للاستنتاجات المستخلصة من تجارب التصوير الحي. تشمل التطبيقات المحتملة لهذه التقنية ، على سبيل المثال لا الحصر ، إجراء ملاحظات للتغيرات الجزيئية والفسيولوجية في تركيزات الكالسيوم الخلوية ([Ca2+]cyt) ، أو درجة الحموضة ، أو H 2 O2أثناء تفاعلات المشيجات من خلال استخدام أجهزة الاستشعار الحيوية المشفرة وراثيا. علاوة على ذلك ، يمكن ملاحظة التغيرات الخلوية ، مثل تنكس التآزر المستقبلي ، أو هجرة خلايا الحيوانات المنوية ، أو الزواج النووي ، بسهولة أكبر باستخدام هذه الطريقة المحسنة. أخيرا ، يمكن مراقبة توقيت المراحل المختلفة للإخصاب تحت المجهر واسع المجال ، ومن ثم يمكن إجراء تحليلات أكثر تفصيلا باستخدام مجهر المسح بالليزر متحد البؤر (CLSM) أو مجهر الإثارة ثنائي الفوتون (2PEM) للحصول على دقة أعلى وإعادة بناء ثلاثية الأبعاد.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ملاحظة: انظر جدول المواد للحصول على قائمة بالمواد والمعدات المستخدمة في هذا البروتوكول.
1. اعتبارات لتصميم تجربة التصوير
- حدد مسبقا مدة التصوير وتردد أخذ العينات المطلوب لالتقاط الظاهرة المطلوبة المراد ملاحظتها. على سبيل المثال ، باتباع نظرية أخذ العينات ل Nyquist ، يجب أن يكون تردد أخذ العينات أكبر من ضعف أعلى تردد لعينة الإدخال. لذلك ، لالتقاط تذبذبات الخلايا التآزرية [Ca2+] بدقة ، قم بإجراء التصوير كل 10 ثوان تقريبا ، ولكن لقياس سرعة خلايا الحيوانات المنوية عند تفريغ أنبوب حبوب اللقاح ، تأكد من دقة زمنية أقل من 1 ثانية10.
- حدد علامات الفلورسنت للخلايا ذات الأهمية التي تكون ساطعة بدرجة كافية خارج التألق الذاتي في الخلفية. لاستخدام أجهزة الاستشعار الحيوية ، حدد الخطوط الأكثر سطوعا التي لا تزعج وظيفة الخلية ، لأنها أكثر حساسية بشكل عام وتتطلب وقت تعرض أقل.
- ضع في اعتبارك أي نوع من الفحص المجهري الفلوري والتكبير هو الأنسب لالتقاط الظاهرة المطلوبة. استخدم المجهر واسع المجال وأهداف التكبير المنخفض لالتقاط الضوء من عمق مجال أكبر ، والحفاظ على التركيز بمرور الوقت ، أو تصوير كائنات أكبر مثل البويضات الكاملة ، أو استخدام مستشعرات القياس النسبي الحساسة لعناصر التحول اللوني. استخدم CLSM أو 2PEM مع أهداف تكبير عالية للحصول على دقة أفضل للكائنات الخلوية ودون الخلوية ، ولكن لاحظ صعوبة الحفاظ على التركيز بمرور الوقت.
- تقدير عدد العينات المراد تصويرها لكل تجربة. على سبيل المثال ، استخدم هدف 10x مع حد أدنى لوقت أخذ العينات يبلغ ~ 30 ثانية لتصوير ثلاثة حواجز وتصوير ما يصل إلى 40 حدث إخصاب لكل تجربة بسبب الوقت اللازم لوظائف التركيز البؤري التلقائي والاستحواذ متعدد المراحل.
2. إعداد حبوب اللقاح إنبات المتوسطة
- تحضير وسط إنبات حبوب اللقاح السائلة (5mM CaCl2 ، 1mM MgSO4 ، 5mM KCl ، 0.01٪ [w / v] H 3 BO3، و 10٪ [w / v] السكروز) باستخدام مخزون 1 M من كل مغذيات دقيقة ، والتي يتم تخزينها عند -20 درجة مئوية. اضبط الرقم الهيدروجيني على 7.5 مع 0.1 M KOH. يخزن الوسط في درجة حرارة 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 2 أسابيع.
ملاحظة: قد ينخفض الرقم الهيدروجيني بمرور الوقت. - أضف 2.5 مل من الوسط السائل إلى دورق 10 مل ، وأضف ببطء 32 مجم من أغاروز نقطة الانصهار المنخفضة للغاية (~ 1.3٪) بقضيب تحريك سريع الدوران لتجنب التكتل.
- تذوب الأغاروز على لوح تسخين عند 65 درجة مئوية ، وتدحرج الدورق لتجميع أي تكاثف من الجوانب.
- ماصة 130 ميكرولتر من الوسط في بئر 14 مم من طبق سفلي زجاجي 35 مم ، وقم بتدوير الطبق حتى يغطي الوسط البئر.
- نضح ما مجموعه 40 ميكرولتر مع ماصة من وسط الطبق ، تاركا وراءه حجما إجماليا قدره 90 ميكرولتر.
ملاحظة: يمكن استنشاق المزيد من الوسائط من البئر لتحقيق حجم إجمالي أقل ؛ قد يكون هذا ضروريا لأهداف التكبير العالية مع مسافات عمل منخفضة. ومع ذلك ، كلما كانت وسادة أجار أرق ، زادت سرعة جفافها. - قم بتبريد الطبق على كتلة من الألومنيوم في غرفة الرطوبة لضمان التبريد المتساوي. قم بتخزين الأطباق على حرارة 4 درجات مئوية طوال الليل لاستخدامها في صباح اليوم التالي.
3. التدريج الزهري للمتبرعين بالحاجز ، والمتبرعين بالوصم ، والمتبرعين بحبوب اللقاح
الشكل 1: التدريج الزهري للمتبرعين بالحاجز ، والمتبرعين بالوصمة ، والمتبرعين بحبوب اللقاح. (أ) مراحل أزهار أرابيدوبسيس (Ler-0) داخل الإزهار. يجب إضعاف البراعم في المرحلة 12B ، التي تحتوي على بتلات على وشك الفتح وأنثرات صفراء غير مهذبة ، عن طريق إزالة جميع الكؤوس والبتلات والأسدية. يمكن بعد ذلك استخدام المدقات (التي تؤوي صانعة المشيجات الأنثوية) كمتبرعين بالحاجز بعد 24 ساعة. (ب) مراحل أزهار أرابيدوبسيس (Col-0) داخل الإزهار. يجب إضعاف البراعم في المرحلة 12B ، والتي تحتوي على أنثرات صفراء غير متجانسة ووصمات بالكاد تخرج من البتلات ، عن طريق إزالة جميع الكؤوس والبتلات والأسدية. يمكن بعد ذلك استخدام المدقات كمتبرعين بالوصمة بعد 24 ساعة ، عندما يجب تلقيحها بالزهور (التي تؤوي علامة النبات المشيجي الذكري) المفتوحة وتساقط حبوب اللقاح. يجب تشريح الوصمات الملقحة في غضون 1 ساعة من التلقيح. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
- في صباح اليوم السابق للتصوير ، اختر نباتات Arabidopsis لاستخدامها كمتبرعين بالحاجز ومتبرعين بالوصمة ؛ تأكد من أنها صحية وبدأت مؤخرا في إنتاج السيليك.
ملاحظة: Landsberg erecta (Ler-0) هو انضمام جيد للاستخدام كمتبرع للحاجز ، نظرا لأن حاجزه قوي ، وهناك أجزاء داخلية صغيرة بين البويضات. كولومبيا (Col-0) هي انضمام جيد لاستخدامها كمتبرع بوصمة العار لأنها تبدو مواتية لنمو أنبوب حبوب اللقاح. - قم بعزل ما لا يقل عن ثلاث أزهار مانحة للحاجز الأنفي من المرحلة 12B و 12 من المرحلة 12B من الزهور المانحة للوصمة عن طريق إزالة الأسدية والكؤوس والبتلات (الشكل 1 أ ، ب). قم أيضا بإزالة الزهور القديمة على نفس الإزهار ، والتي يمكن أن تلقيح الزهرة المخصبة.
- في الصباح ، بعد 24 ساعة ، قم بتلقيح المتبرعين بالوصمة بأزهار المتبرعين بحبوب اللقاح (على سبيل المثال ، إيواء أنبوب حبوب اللقاح أو علامات خلايا الحيوانات المنوية) التي تتساقط حبوب اللقاح بسهولة. يكتمل التلقيح عندما تكون الوصمات مغطاة بالكامل تقريبا بحبوب اللقاح (الشكل 1 ب).
4. تشريح الحاجز
الشكل 2: دليل سريع لتشريح الحاجز ووصمة العار. أ: خطوات تشريح الحاجز. ثبت المدقة على شريط على الوجهين بإبرة حقنة الأنسولين ، وقم بعمل جروح عند تقاطع المبيض الأنيق وتقاطع المبيض وعنيق ، متبوعا بقطع ضحل على طول حاجز أي من الكربل (الخطوة 1). قشر جدران الكاربل مرة أخرى على الشريط (الخطوة 2). قطع البرقوق تحت الحاجز العلوي (الخطوة 3). قطع الحاجز في النمط ، وإزالة باستخدام ملقط في pedicel (الخطوة 4). ضع الحاجز الأنفي على وسائط أجار ، وقم بتضمينه برفق بالملقط. (ب) خطوات تشريح وصمة العار. ثبت المدقة (الملقحة <1 ساعة من قبل) على شريط على الوجهين ، واقطعها عند تقاطع المبيض الأنيق بشفرة حلاقة (الخطوة 6). ضع وصمة العار على وسط أجار بإبرة أنسولين بجوار الحاجز ، واضبط المسافة إلى حوالي 250 ميكرومتر (الخطوات 7-8). تأكد من أن تجمع شبه سائل يتشكل حول الميكروبايل وقاعدة الأنماط (الخطوة 9). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
- بعد ثلاثين دقيقة من التلقيح ، اجمع مدقات مانحة للحاجز الصحي والناضج عند عنيق ، وضعها على شريط لاصق جديد على الوجهين مثبت على شريحة زجاجية ، مع لصق وصمة العار من حافة الشريط.
ملاحظة: حدد وقت التشريح الذي توجد فيه المدقات على الشريط اللاصق للتأكد من أنها قصيرة قدر الإمكان. يجب إجراء التشريح في رطوبة عالية ، والتي يمكن تحقيقها عن طريق وضع مرطب بجوار الشريحة. - ثبت المدقة بإحكام على الشريط عن طريق الضغط برفق على عنيق وعلى طول المبيض باستخدام الجانب الخلفي من إبرة حقنة الأنسولين الجديدة قبل إزالة حطام الكؤوس والبتلة والسداة المتبقية من الإخصاء.
- تحت المجسمة ، استخدم إبرة حقنة الأنسولين لعمل قطعتين لكل كربل عند تقاطع نمط المبيض وتقاطع المبيض وعنيق ، متبوعا بجروح ضحلة على طول حاجز كل كربل (الشكل 2 ، الخطوة 1).
ملاحظة: سيؤدي القطع بعمق شديد على طول الحاجز إلى قطع البويضات عند القطار الجبلي المائل. - قشري جدران المبيض بعناية على الشريط (الشكل 2 ، الخطوة 2) ، وحركي الإبرة برفق بين الحاجزين لقطع البرقوق بطول المدقة بالكامل دون إزعاج البويضات (الشكل 2 ، الخطوة 3).
ملاحظة: قطع replum في الاتجاه من النمط إلى عنيق لضمان أن البويضات على الحاجز العلوي يتم إزعاجها بأقل قدر ممكن. - قطع الحاجز العلوي برفق عند كل من التقاطع مع النمط ومع عنيق ، وإزالة الحاجز مع ملقط من جانب عنيق (الشكل 2 ، الخطوة 4).
ملاحظة: حافظ على هذا القطع مستقيما ولطيفا حتى يظل الحاجز مسطحا ولا ينحني. - ضع الحاجز بشكل مسطح قدر الإمكان على الوسط بحيث تكون ميكروبيلات البويضات متجهة لأعلى وفي نفس المستوى البؤري. اضغطي على الحاجز برفق في الوسط حتى تندمج البويضات قليلا في الوسط (الشكل 2 ، الخطوة 5).
ملاحظة: من الأهمية بمكان وضع الحاجز بحيث تكون ميكروبيلات البويضات في متناول أنابيب حبوب اللقاح (يمكن إعادة ترتيب أي بويضات يتعذر الوصول إليها برفق بإبرة). يجب أن تتشكل بركة صغيرة من السائل حول الحاجز بعد التضمين. - كرر الخطوات 4.1-4.6 لما يصل إلى مدقات أخرى ، مع وضع الحاجز من طرف إلى طرف.
5. تشريح وصمة العار
- ضع المدقات المانحة للوصمة الملقحة على شريط لاصق جديد على الوجهين مثبت على شريحة زجاجية ، بحيث يكون التقاطع على شكل المبيض بعيدا عن حافة الشريط (الشكل 2 ، الخطوة 6).
- استخدم شفرة حلاقة جديدة لقص النمط بشكل مستقيم ورفعه بعيدا للحفاظ على وصمة العار المرتبطة بالشفرة (الشكل 2 ، الخطوة 6).
ملاحظة: قص على حافة الشريط للحصول على أنظف قطع. - أزيلي وصمة العار من الشفرة بإبرة حقنة الأنسولين ، وضعيها بشكل مسطح حوالي 250-300 ميكرومتر من البويضات (الشكل 2 ، الخطوات 7-8).
ملاحظة: يجب توجيه النمط أفقيا على جانبه ؛ خلاف ذلك ، فإن معظم أنابيب حبوب اللقاح سوف تنمو أسفل الحاجز. يجب أن تظهر بركة صغيرة من السائل عند دخول النمط بعد أن تكون ملقاة على الوسط لمدة 1 دقيقة ؛ هذه علامة جيدة ، حيث سيكون لأنابيب حبوب اللقاح خروج سلس من النمط. - كرر الخطوات 5.1-5.3 لما يصل إلى 12 وصمة، وضع اثنتين على جانبي كل حاجز. ابحث عن مجموعة صغيرة من السوائل تتشكل حول ميكروبايل البويضات. يساعد هذا في إمكانية الوصول إلى أنابيب حبوب اللقاح واستهدافها إلى أكياس الجنين (الشكل 2 ، الخطوة 9).
ملاحظة: حدد مقدار الوقت الذي يكون فيه الطبق مفتوحا لمنع جفاف الوسط والبويضات.
6. التصوير
الشكل 3: مخطط تصوير الحاجز مع SIV. (أ) الإعداد الكامل ل SIV مع الحاجز مع 12 وصمة ملقحة و 3 حواجز ، كما يظهر من خلال مجسم. (ب) صور مدمجة لإعداد SIV مع الحاجز الكامل الذي شوهد في A 5 h بعد الحضانة باستخدام هدف 10x ، مع وضع علامة على مناطق النظرة العامة الخمسة (~ 1 مم لكل منها) للاكتساب متعدد المراحل. تظهر المربعات الخضراء البويضات التي تلقت أنابيب حبوب اللقاح وهي تخضع لانفجار متفجر في التآزر. (ج) عرض أقرب لمنطقة النظرة العامة 2 في نقاط زمنية مختلفة. بعد حوالي 3 ساعات من الحضانة في غرفة الرطوبة على المجهر ، يجب أن تصل أنابيب حبوب اللقاح بالقرب من الميكروبات ، وبحلول 6 ساعات من التصوير ، يجب أن تكون معظم البويضات قد تلقت أنابيب حبوب اللقاح بشكل صحيح (المربعات الخضراء) ؛ ثم تخضع هذه البويضات لانفجار أنبوب حبوب اللقاح المتفجر (علامة النجمة). قضبان المقياس = (A) 5 مم ، (B ، C) 500 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
- بمجرد الانتهاء من التشريح ويصبح الطبق جاهزا للتصوير ، اتركه يحتضن في غرفة رطوبة على المجهر يتم الحفاظ عليه عند رطوبة نسبية 92٪ و 21 درجة مئوية.
ملاحظة: في حالة عدم توفر حجرة رطوبة للمجهر ، فإن تبطين الحواف الخارجية للغطاء والطبق بكمية صغيرة من الماء سيساعد في الحفاظ على مستوى عال من الرطوبة في الطبق. - ضع العينات في التركيز تحت برايت فيلد بكثافة إضاءة منخفضة ، ثم قم بالتبديل إلى ضوء الفلورسنت ، مع تحديد مناطق العينة في نظرة عامة على المرحلة المراد تصويرها.
ملاحظة: عند التكبير 10x ، يمكن تمييز حوالي خمس مناطق لما مجموعه ثلاثة حواجز (الشكل 3). الحد من مقدار الوقت المستخدم لوضع علامات على مناطق النظرة العامة لتقليل السمية الضوئية أو ارتفاع درجة حرارة العينة بواسطة ضوء الفلورسنت. - ابدأ التصوير باستخدام مخطط اكتساب متعدد المراحل مع وظيفة التركيز البؤري التلقائي في بداية كل منطقة نظرة عامة. نظرا لأن أنابيب حبوب اللقاح ستخرج من النمط ~ 1 h بعد احتضان العينة ، قم بتأخير الاكتساب بمقدار 2 ساعة أو حتى تصل أنابيب حبوب اللقاح إلى micropyle. تأكد من ضبط التركيز البؤري التلقائي بنطاق 100 ميكرومتر (خطوات كبيرة 7 ميكرومتر وخطوات دقيقة 1 ميكرومتر) للحفاظ على تركيز البويضات حيث يتحرك الحاجز قليلا ويغرق بمرور الوقت.
- أوقف التقاط الصورة ~ 9 ساعات بعد بدء حضانة العينة ، لأنه بحلول هذا الوقت ، يجب أن تكون معظم البويضات قد جذبت وتلقت أنبوب حبوب اللقاح.
ملاحظة: إذا كان عدد قليل من البويضات يجذب أنابيب حبوب اللقاح ، فإن الملاحظة الدقيقة للطبق تحت مجسمة مفيدة لتحديد كيفية تحسين اتجاه البويضة أو النمط في المرة القادمة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
لتقييم توقيت التنكس النووي في التآزر المستقبلي فيما يتعلق بتمزق أنبوب حبوب اللقاح في أرابيدوبسيس ، وكذلك لمراقبة ما إذا كان التآزر الأيسر أو الأيمن مقدرا مسبقا أن يصبح التآزر المستقبلي ، تم استخدام طريقة SIV cum septum الموصوفة هنا باستخدام علامة نووية أنثوية مشيجية مكدسة بعلامة خلوية تآزرية (pFG: roGFP2-ORP1-NLS ، pMYB98: roGFP2-ORP1) كمتبرع بالحاجز وعلامة المشيمة الذكرية (pLAT52: R-GECO) كمتبرع بحبوب اللقاح. تم تشريح الحاجز والوصمات الملقحة بعد 24 ساعة من الإخصاء ، وفقا للأقسام 4-5 من البروتوكول ، ووضعها على أطباق زجاجية القاع مع وسيط تم إعداده في اليوم السابق. تم وضع كل طبق في غرفة الرطوبة على المجهر ، وتم إجراء تجربة متعددة المراحل باستخدام عدسة موضوعية 10x (الفتحة العددية: 0.4) مع خمس مناطق نظرة عامة (الشكل 3). تم التقاط صور لكل منطقة كل 60 ثانية لمدة 9 ساعات بأربع قنوات فلورية: القناة (1) 560/640 ل R-GECO (25 مللي ثانية) ، القناة (2) 488/520 ل roGFP2-ORP1 (60 مللي ثانية) ، القناة (3) 387/520 ل roGFP2-ORP1 (60 مللي ثانية) ، والقناة (4) 387/640 لطرح الخلفية (60 مللي ثانية) (الجدول 1). تم استخدام وظيفة التركيز البؤري التلقائي باستخدام نطاق 100 ميكرومتر مع خطوة خشنة 7 ميكرومتر وخطوة دقيقة 1 ميكرومتر لكل دقيقة قبل التقاط الصورة. تم فتح ملفات الصور الخمسة في فيجي ، وتم فصل القنوات ، ثم تم تجانب الصور يدويا معا (الفيديو 2 والملف التكميلي 1).
في الفيديو 2 (انظر أيضا الملف التكميلي 1) ، يمكن رؤية 41 مثالا على تمزق أنبوب حبوب اللقاح المتفجرة في التآزر داخل البويضات ، مع مربعات خضراء تحدد مناطق الاهتمام. باستخدام خط الاستشعار الحيوي للكالسيوم pLAT52: RGECO كمتبرع لحبوب اللقاح ، شوهدت حالات تمزق أنبوب حبوب اللقاح المتفجرة عند أطراف أنابيب حبوب اللقاح حيث تتحلل. والجدير بالذكر أن هناك زيادة سريعة في سطوع المستشعر الحيوي نتيجة تعرضه المفاجئ لمستويات عالية من الكالسيوم. يمكن أيضا تحليل تمزق أنبوب حبوب اللقاح المتفجرة باستخدام خلايا الحيوانات المنوية القائمة على GFP أو RFP أو علامات الخلايا الخلوية ، والتي تظهر أيضا إطلاقا سريعا للحيوانات المنوية أو محتوى السيتوبلازم. عند تمزق أنبوب حبوب اللقاح ، لوحظ أن نواة التآزر المستقبلي تتحلل في وقت واحد (خلال دقة زمنية مدتها دقيقة واحدة في التجربة) ، كما شوهدت هجرة نواة خلية البويضة نحو الميكروبايل عند تمزق أنبوب حبوب اللقاح نتيجة لزواج النواة (الفيديو 3 والملف التكميلي 1). كان كل من التآزر الأيسر والأيمن قادرا على العمل كتآزر استقبالي ، ولوحظت حالات انفجارين لأنبوب حبوب اللقاح ، أولا في التآزر المستقبلي وثانيا في التآزر المستمر. يعرض الفيديو 2 (انظر أيضا الملف التكميلي 1) 10 أمثلة على استقبال أنبوب حبوب اللقاح المعيب ، والذي يمكن رؤيته في البويضات ، مع تمييز المناطق ذات الأهمية بمربعات حمراء. وبالتالي ، كانت الكفاءة الكلية لاستقبال أنبوب حبوب اللقاح ~ 80٪ فيما يتعلق بالبويضات التي جذبت أنابيب حبوب اللقاح. في هذه الحالات غير الناجحة ، إما أن توقف أنابيب حبوب اللقاح نموها في الميكروبايل ، أو توقف نموها بعد النمو السريع في التآزر ، أو تفشل في إيقاف نموها وتستمر في النمو والالتفاف داخل كيس الجنين. فشلت البويضات التي لا تحتوي على أي مناطق اهتمام محددة في جذب أنابيب حبوب اللقاح أو لم تكن في اتجاه يمكن الوصول إليه. يمكن رؤية أمثلة مكبرة للنتائج السلبية والإيجابية في الفيديو 3 (انظر أيضا الملف التكميلي 1) ، الذي يظهر حالتين من استقبال أنبوب حبوب اللقاح المعيب (الفيديو 3A و C والملف التكميلي 1) ، وحالتين من استقبال أنبوب اللقاح الناجح (الفيديو 3B و D والملف التكميلي 1).
الشكل 4: مقارنة كفاءات طريقة SIV. أظهرت ثماني نسخ تقنية مكررة لطريقة البويضات المستأصلة SIV (إجمالي 71 بويضة) فقط ~ 28٪ بويضات مع رشقات نارية متفجرة لأنبوب حبوب اللقاح ، مما أدى إلى كفاءة تتراوح من ~ 10٪ -50٪. أظهرت خمس نسخ مكررة تقنية لطريقة SIV cum septum (8 حواجز و 102 بويضة) ~ 79٪ بويضات مع انفجار أنبوب حبوب اللقاح المتفجر ، مما أدى إلى كفاءة تتراوح من ~ 70٪ -100٪. تم حساب البويضات التي جذبت أنابيب حبوب اللقاح إلى الميكروبايل والبويضات التي لديها وقت مسجل كاف لتلقي أنبوب حبوب اللقاح المنجذب. يشير الحرف "X" إلى المتوسط وخط الوسط القيمة المتوسطة (50في المائة) ، على التوالي. تظهر الخطوط خارج الربعين العلوي والسفلي النسب المئوية الدنيا والقصوى لاستقبال أنبوب حبوب اللقاح الناجح. كانت النسبة المئوية للبويضات مع انفجار أنبوب حبوب اللقاح مختلفة بشكل كبير (p < 0.001) بين الطريقتين بناء على اختبار t غير المزاوج. اختصار: SIV = شبه في المختبر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| المعدات / الإعداد | الفيديو التكميلي 2 و 3 |
| مجهر | أوليمبوس IX-81F-ZDC2 المجهر المقلوب |
| التحكم في درجة الحرارة | لايف لخدمات التصوير GmbH مكعب وصندوق (22C) |
| التحكم في الرطوبة | Life Imaging Services GmbH Brick (92٪ رطوبة نسبية) |
| برمجيات | أوليمبوس سيلسينس البعد 2.3 |
| تحكم في الوقت الحقيقي | أوليمبوس يو آر تي سي |
| ليزر | MT20- 150 واط زينون قوس الموقد |
| عدسة موضوعية | 10x الغمر في الهواء U خطة SApo عدسة موضوعية (0.4 NA) ، مسافة العمل 3.1 مم |
| مرآة مكعب | GFP / RFP |
| عجلة التصفية | أوليمبوس U-FFWO |
| القناة 1 (25 مللي ثانية): تنعكس (560/25) الملاحظة (624/40) | |
| القناة 2 (60 مللي ثانية): تنعكس (485/20) الملاحظة (525/30) | |
| القناة 3 (60 مللي ثانية): تنعكس (387/11) الملاحظة (525/30) | |
| القناة 4 (60 مللي ثانية): تنعكس (387/11) الملاحظة (624/30) | |
| كاشف | كاميرا هاماماتسو أوركا فيوجن الرقمية CMOS |
| ضبط تلقائي للصورة | نطاق 100 ميكرومتر ، خطوة خشنة 7 ميكرومتر ، خطوة دقيقة 1 ميكرومتر |
| الفاصل الزمني | 1 دقيقة |
الجدول 1: أنظمة وإعدادات المجهر المستخدمة في هذه المخطوطة.
فيديو 1: اللقطات الزمنية لطريقة البويضات المستأصلة SIV. تم دمج الفاصل الزمني من ثمانية نسخ تقنية مكررة من SIV باستخدام البويضات المستأصلة التي تظهر نمو أنابيب حبوب اللقاح (إيواء pLAT52: R-GECO) واستقبال أنبوب حبوب اللقاح داخل البويضات. تظهر الصناديق الخضراء العشرون حالات انفجار أنبوب حبوب اللقاح المتفجرة في التآزر ، وتظهر الصناديق الحمراء ال 51 حالات انفجار أنبوب حبوب اللقاح الفاشل والنمو الزائد. تتراوح الفترات الزمنية بين 260 دقيقة و 400 دقيقة ، وشريط المقياس 100 ميكرومتر. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الفيديو.
فيديو 2: SIV نائب الرئيس الفاصل الزمني . (أ) دمج الفاصل الزمني من جميع مجالات النظرة العامة الخمسة (انظر الشكل 3) لنمو أنبوب حبوب اللقاح واستقباله داخل البويضات مع قناة RFP فقط (القناة 1). حبوب اللقاح تؤوي pLAT52: R-GECO والبويضات pFG: roGFP2-ORP1-NLS. pMYB98: roGFP2-ORP1. تظهر الصناديق الخضراء ال 41 حالات انفجار أنبوب حبوب اللقاح المتفجرة ، وتظهر الصناديق الحمراء ال 10 حالات انفجار أنبوب حبوب اللقاح الفاشل وفرط نمو أنبوب حبوب اللقاح. (ب) نفس الفاصل الزمني مع كل من قناتي RFP و GFP (القناة 1 والقناة 2) ، والتي توضح الديناميكيات النووية في الأمشاج والخلايا التآزرية أثناء استقبال أنبوب حبوب اللقاح. تشير الأرقام الموجودة أعلى اليمين إلى الوقت (h: min). شريط المقياس = 500 ميكرومتر. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الفيديو.
فيديو 3: أمثلة على النتائج الإيجابية والسلبية من SIV cum septum. (أ، ج) مثال على البويضات مأخوذة من الفيديو 2 توضح حالتين من الإخصاب الفاشل. في A ، تفشل أنابيب حبوب اللقاح في إيقاف النمو وتستمر في الالتفاف في كيس الجنين. في C ، تظهر فئة ثانية من فرط نمو أنبوب حبوب اللقاح ، حيث يخضع أنبوب حبوب اللقاح الأول للنمو السريع أثناء نموه إلى التآزر ولكنه يوقف النمو دون تمزق. (ب، د) مثال على البويضات المأخوذة من الفيديو 2 يظهر حالتين من استقبال أنبوب اللقاح الناجح. يظهر انفجار أنبوب حبوب اللقاح الشبيه بالنوع البري التمزق المتفجر لأنبوب حبوب اللقاح في التآزر ، وتشير هجرة نواة خلية البويضة نحو الميكروبايل إلى زواج النواة. تشير الأرقام الموجودة أعلى اليمين إلى الوقت (h: min). تشير رؤوس الأسهم إلى نوى التآزر المستقبلة (rSN) ، وتشير الأسهم إلى هجرة نواة خلية البويضة (EN) بعد انفجار أنبوب حبوب اللقاح (التحلل). شريط المقياس = 30 ميكرومتر. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الفيديو.
الملف التكميلي 1: صور ثابتة للفيديو 1 والفيديو 2 والفيديو 3. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
تقدم هذه المخطوطة بروتوكولا فعالا لتصوير استقبال أنبوب حبوب اللقاح والإخصاب المزدوج في أرابيدوبسيس. الطريقة المحسنة ، SIV cum septum ، تزيد بشكل كبير من النسبة المئوية والعدد الإجمالي لأحداث استقبال أنبوب اللقاح الناجحة التي يمكن ملاحظتها لكل جلسة تصوير. تظهر النتائج التمثيلية الموضحة هنا جلسة تصوير مع 41 حدثا ناجحا لاستقبال أنبوب حبوب اللقاح و 10 بويضات تظهر عيوب الاستقبال (~ 80٪ كفاءة). هذا هو أكثر من ضعف عدد أحداث استقبال أنبوب اللقاح الناجحة التي تم التقاطها في ما مجموعه ثماني جلسات تصوير باستخدام طريقة البويضات المستأصلة SIV الأصلية (الفيديو 1). باستخدام طريقة SIV cum septum في خمس مكررات تقنية لما مجموعه ثمانية حواجز ، حققنا متوسط كفاءة استقبال أنبوب حبوب اللقاح بنسبة 79٪ مقارنة بمتوسط 28٪ باستخدام طريقة SIV المستأصلة مع ثمانية مكررات تقنية (الشكل 4).
في حين أن كفاءة استقبال أنبوب حبوب اللقاح أكبر بكثير بالنسبة لطريقة SIV cum septum ، إلا أن حالات فرط نمو أنبوب حبوب اللقاح لا تزال تحدث بمعدلات متفاوتة ، اعتمادا على عدة عوامل. الأهم من ذلك ، يجب أن تبقى الخلايا التآزرية حية ومتقبلة لعدة ساعات يتم تصويرها خلالها. إن الحفاظ على بيئة رطبة أثناء التشريح والتصوير ، واستخدام وسط حديث الصنع ، وتضمين البويضات والحاجز في الأجار شبه السائل ، وتجنب الحرارة الناتجة عن التعرض المفرط للضوء أثناء التقاط الصور ، كلها عوامل حاسمة لضمان استقبال أنبوب حبوب اللقاح بنجاح. تعد إمكانية الوصول إلى أنابيب حبوب اللقاح وجذبها إلى ميكروبيلات البويضات من العوامل الرئيسية التي تحد من عدد أحداث استقبال أنبوب اللقاح الناجحة. إن تقليل اضطراب البويضات على الحاجز أثناء التشريح ، وتوجيه الحاجز بحيث تكون الميكروبات متجهة لأعلى ، وتشكيل تجمع شبه سائل بين البويضات وفتح النمط هي مفتاح جذب أنبوب حبوب اللقاح. يمكن أن يختلف تكوين هذا التجمع بين العلامات التجارية للأجار منخفض نقطة الانصهار ، وبالتالي يوصى ببدء التجارب بنسب متفاوتة من أجار من 1٪ إلى 1.5٪. أخيرا ، تعني صعوبة التشريح أنها تتطلب بعض الممارسة ، ويوصى بالتحلي بالصبر وممارسة الاسترخاء والتنفس العميق قبل التشريح ، والأهم من ذلك ، ملاحظة التقنيات التي تعمل على تحسين الاستقرار والاتساق (على سبيل المثال ، وضع اليد ، اتجاه الشريحة).
يجب أن يحسن هذا البروتوكول التفصيلي لطريقة SIV cum septum بشكل كبير من الكفاءة وعدد العينات للتجارب التي تهدف إلى التصوير المباشر لاستقبال أنبوب حبوب اللقاح والإخصاب المزدوج. تشمل التطبيقات استخدام أجهزة الاستشعار الحيوية المشفرة وراثيا ، وتحليل الطفرات ، والملاحظات الوصفية للأحداث الخلوية قبل الإخصاب المزدوج وأثناءه وبعده مباشرة. نأمل أن يتم توسيع هذه الطريقة وتوسيع نطاقها لتشمل أنواع النباتات المزهرة الأخرى حيث يمكن أن يكون الحفاظ على البويضات على مشيمة المبيض مفيدا.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
لم يبلغ المؤلفون عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
نشكر سارة سيمونيني وستيفانو بينسيفينجا على التبرع ببناء pFG: roGFP2-ORP1-NLS وكريستوف إيشينبيرجر ويوهان ألميندينجر وفنسنت سوتر وسيليا بارو على نصائحهم بشأن الفحص المجهري. نرجو أن نعترف بنصيحة رافي بالانيفيلو وفيليب دينينجر وشارون كيسلر ومارك جونسون وتوموكازو كاواشيما وكل شخص آخر في المؤتمر الدولي للتكاثر الجنسي للنباتات 2022 الذين أبدوا اهتماما ببروتوكول بشأن SIV مع الحاجز. تم دعم هذا العمل من قبل جامعة زيورخ ومنح من مؤسسة العلوم الوطنية السويسرية إلى U.G.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mm glass slide | Epredia | 16211551 | |
| 35 mm glass bottom dish (14 mm well) | Mattek | P35G-1.5-14-C | |
| Calcium Chloride | Roth | CN93.1 | |
| Columbia (Col-0) | Nottingham Arabidopsis Stock Centre (NASC) | stigma donor | |
| Dissecting Scope | Olympus | SZX2-ILLT | |
| Insulin needle (0.3 G) | BD | 304000 | |
| Landsberg erecta (Ler-0) | Nottingham Arabidopsis Stock Centre (NASC) | septum donor | |
| Magnesium Sulfate | Merck | 5886 | |
| Potassium Chloride | Roth | 6781.1 | |
| Razor blade | Beldura | 7026797 | |
| Scotch double sided tape | Scotch | 768720 | Less thick and good for stigma dissection |
| Sodium Chloride | Roth | 3957.1 | |
| Sucrose | ITW reagents | A2211,1000 | |
| Tesa double sided tape | Tesa | 05681-00018 | Very sticky and good for septum dissection |
| Ultra low gelling temperature agarose | FMC SeaPrep | 50302 |
References
- Huck, N., Moore, J. M., Federer, M., Grossniklaus, U. The Arabidopsis mutant feronia disrupts the female gametophytic control of pollen tube reception. Development. 130 (10), 2149-2159 (2003).
- Rotman, N., et al. Female control of male gamete delivery during fertilization in Arabidopsis thaliana. Current Biology. 13 (5), 432-436 (2003).
- Palanivelu, R., Preuss, D. Distinct short-range ovule signals attract or repel Arabidopsis thaliana pollen tubes in vitro. BMC Plant Biology. 6, 7 (2006).
- Susaki, D., Maruyama, D., Yelagandula, R., Berger, F., Kawashima, T. Live-cell imaging of F-actin dynamics during fertilization in Arabidopsis thaliana. Methods in Molecular Biology. 1669, 47-54 (2017).
- Iwano, M., et al. Cytoplasmic Ca2+ changes dynamically during the interaction of the pollen tube with synergid cells. Development. 139 (22), 4202-4209 (2012).
- Ngo, Q., Vogler, H., Lituiev, D., Nestorova, A., Grossniklaus, U. A calcium dialog mediated by the FERONIA signal transduction pathway controls plant sperm delivery. Developmental Cell. 29 (4), 491-500 (2014).
- Denninger, P., et al. Male-female communication triggers calcium signatures during fertilization in Arabidopsis. Nature Communications. 5, 4645 (2014).
- Hamamura, Y., et al. Live imaging of calcium spikes during double fertilization in Arabidopsis. Nature Communications. 5, 4722 (2014).
- Ponvert, N., Johnson, M. Synergid calcium ion oscillations define a new feature of pollen tube reception critical for blocking interspecific hybridization. bioRxiv. , (2020).
- Hamamura, Y., et al. Live-cell imaging reveals the dynamics of two sperm cells during double fertilization in Arabidopsis thaliana. Current Biology. 21 (6), 497-502 (2011).
