Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

القياس الكمي وتقييم الجدوى واستراتيجيات التصور للأغشية الحيوية الراكدة

Published: August 4, 2023 doi: 10.3791/65517
Automatic Translation
1,2, 3
1Korea Food Research Institute, 2Department of Food Biotechnology, Korea University of Science and Technology, 3Advanced Radiation Technology Institute, Korea Atomic Energy Research Institute

Summary

يصف هذا البروتوكول تحضير اللقاح ، والقياس الكمي للغشاء الحيوي على ألواح العيار الدقيق باستخدام صبغة البنفسج البلوري ، والعدد القابل للتطبيق في الأغشية الحيوية ، وتصور الأغشية الحيوية للراكدة.

Abstract

تسبب الراكدة عدوى المستشفيات ويمكن أن يساهم تكوين الأغشية الحيوية في البقاء على الأسطح الجافة مثل بيئات المستشفيات. وبالتالي ، فإن القياس الكمي والأغشية الحيوية والتصور هما طريقتان مهمتان لتقييم إمكانات سلالات الراكدة للتسبب في عدوى المستشفيات. يمكن قياس الأغشية الحيوية المتكونة على سطح الصفيحة الدقيقة من حيث الحجم وأعداد الخلايا. يمكن قياس أحجام الأغشية الحيوية عن طريق تلطيخها باستخدام البنفسج البلوري ، والغسيل ، وإزالة البقع باستخدام الإيثانول ، ثم قياس الصبغة القابلة للذوبان باستخدام قارئ الصفائح الدقيقة. لتحديد عدد الخلايا المضمنة في الأغشية الحيوية ، يتم التخلص من الأغشية الحيوية باستخدام كاشطات الخلايا ، ويتم حصادها في المياه المالحة ، وتحريكها بقوة في وجود حبات زجاجية ، وتنتشر على أجار Acinetobacter. بعد ذلك ، يتم تحضين الألواح عند 30 درجة مئوية لمدة 24-42 ساعة. بعد الحضانة ، يتم تعداد المستعمرات الحمراء لتقدير عدد الخلايا في الأغشية الحيوية. يمكن أن تكون طريقة العد القابلة للتطبيق هذه مفيدة أيضا لحساب خلايا Acinetobacter في الأغشية الحيوية المختلطة الأنواع. يمكن تصور الأغشية الحيوية الراكدة باستخدام أصباغ الفلورسنت. يتم استخدام صفيحة مجهرية متاحة تجاريا مصممة للتحليل المجهري لتشكيل الأغشية الحيوية. بعد ذلك ، يتم تلطيخ الأغشية الحيوية المرفقة بالسطح السفلي بأصباغ SYTO9 و propidium iodide ، وغسلها ، ثم تصورها باستخدام مجهر المسح بالليزر متحد البؤر.

Introduction

من المعروف أن الراكدة تسبب عدوى المستشفيات ، ويتم الإبلاغ عن عدواها البشرية ، خاصة في مرافق الرعاية الصحية ، بشكل متزايد1. ينتشر على نطاق واسع في المستشفيات ومرافق الرعاية الصحية والبيئات المرتبطة بالغذاء2،3،4. يمكن أن يعيش لفترة طويلة في البيئات بما في ذلك أسطح المستشفيات مثل قضبان السرير وطاولات السرير وسطح أجهزة التهوية والأحواض4. قد يكون هذا الثبات على الأسطح البيئية أحد العوامل المهمة التي تساهم في عدوى المستشفيات من Acinetobacter4.

الأغشية الحيوية هي شكل من أشكال الحياة الميكروبية وهي عبارة عن مصفوفة ميكروبية تتكون من خلايا ميكروبية حية ومواد بوليمرية خارج الخلية (EPS) من الخلايا5. يتم تضمين الخلايا الميكروبية في المصفوفة وغالبا ما تكون شديدة المقاومة للضغوط البيئية مثل الحرارة والأملاح والجفاف والمضادات الحيوية والمطهرات وقوى القص 6,7.

يمكن أن تشكل الراكدة الأغشية الحيوية على الأسطح ، مما يشير إلى أنها قد تساهم في إطالة البقاء على الأسطح البيئية ، بما في ذلك أسطح المستشفيات ، وتعزيز المقاومة للعلاج بالمضادات الحيوية 8,9. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أن يرتبط تكوين الأغشية الحيوية للراكدة بشكل كبير بالنتائج السريرية البشرية8. لذلك ، يمكن أن تكون قابلية تكوين الأغشية الحيوية لسلالات Acinetobacter أحد المؤشرات في التنبؤ بالبقاء البيئي والعدوى البشرية 8,10.

يمكن قياس الأغشية الحيوية المتصلة بالسطح وتصورها لتقييم قابلية تكوين الأغشية الحيوية. ولتحديد كمية الأغشية الحيوية المتصلة بالسطح، عادة ما تكون الأغشية الحيوية ملطخة بأصباغ ملطخة بالأغشية الحيوية مثل البنفسج البلوري، ويتم استخلاص الأصباغ في محلول وقياسها للكثافة البصرية11. يعد تصور الأغشية الحيوية نهجا جيدا آخر لتقييم قابلية تكوين الأغشية الحيوية11. يمكن أن تكون طريقة التصور المجهري للمسح بالليزر البؤري (CLSM) التي تستخدم الخصوصية باستخدام أصباغ الفلورسنت أكثر فائدة لتوصيف مورفولوجيا الأغشية الحيوية مقارنة بالتقنيات الأخرى مثل SEM12،13.

يمكن عد الخلايا القابلة للحياة في الأغشية الحيوية لتقدير عدد الخلايا القابلة للحياة في الأغشية الحيوية11. يتم فصل الخلايا القابلة للحياة المضمنة في الأغشية الحيوية وتخفيفها ونشرها على ألواح الآجار وتحضينها وتعدادها. نظرا لأن العدد الأكبر من الخلايا من المحتمل أن يلبي الجرعة المعدية ، فإنه يمكن أن يوفر معلومات أكثر تفصيلا عن الأغشية الحيوية ، مثل إمكانات العدوى المرتبطة بعدد الخلايا13,14.

تقدم هذه المقالة بروتوكولات خطوة بخطوة من أجل (1) تحديد الأغشية الحيوية المرفقة بالسطح ، (2) حساب الخلايا القابلة للحياة في الأغشية الحيوية ، و (3) تصور الأغشية الحيوية باستخدام CLSM من Acinetobacter. تصف البروتوكولات المقدمة طرق تقييم قابلية تكوين الأغشية الحيوية لعزلات الراكدة وأغشية الراكدة وتوصيف الأغشية الحيوية الخاصة بها.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. إعداد اللقاح البكتيري

  1. قم بإزالة قارورة مخزون الجلسرين المخزنة في -80 درجة مئوية.
  2. قم بإزالة السلالة البكتيرية (2-10 ميكرولتر) من القارورة باستخدام طرف ماصة معقم.
    ملاحظة: تستخدم سلالات الراكدة ، A. bouvetii (13-1-1) ، A. junii (13-1-2) ، A. pittii (13-2-5) ، A. baumannii (13-2-9) ، A. radioresistens (20-1) ، و A. ursingii (24-1) في هذا البروتوكول.
  3. تلقيح صفيحة أجار الدم المتاحة تجاريا (أجار الصويا التربتي المكمل ب 5٪ دم غنم ، انظر جدول المواد) بالبكتيريا.
    ملاحظة: يمكن أيضا استخدام وسائط أخرى ، مثل أجار المغذيات أو أجار MacConkey.
  4. قم بخط سطح أجار باستخدام حلقة معقمة مع اشتعال متقطع لتخفيفه.
  5. ضع صفيحة الآجار رأسا على عقب في حاضنة واحتضانها عند 30 درجة مئوية طوال الليل لمدة 20-24 ساعة.
  6. اختر مستعمرة واحدة من الثقافة البكتيرية بإبرة معقمة وقم بتلقيح مرق تسريب قلب الدماغ المعقم 5 مل (BHI ، انظر جدول المواد) مع الثقافة.
  7. احتضان المرق الملقح في حاضنة اهتزاز عند 30 درجة مئوية طوال الليل لمدة 20-24 ساعة عند حوالي 150 دورة في الدقيقة.
  8. نقل 1 مل من الثقافة الليلية إلى أنبوب طرد مركزي دقيق معقم وأجهزة طرد مركزي للثقافة الليلية عند 6000 × جم لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة (RT).
  9. إزالة طاف مع ماصة.
  10. باستخدام دوامة ، أعد تعليق الحبيبات في 1 مل من محلول ملحي معقم مخزن بالفوسفات (PBS).
  11. أجهزة الطرد المركزي في 6000 × غرام لمدة 10 دقائق في RT وإزالة طاف.
  12. أعد تعليق الحبيبات في BHI المخفف المعقم بعشرة أضعاف باستخدام دوامة إلى كثافة بصرية تبلغ حوالي 0.1 عند 600 نانومتر.
    ملاحظة: الكثافة البصرية حوالي 0.1 تعادل حوالي 107 CFU / mL.

2. قياس كمية الأغشية الحيوية باستخدام البنفسج الكريستالي

  1. أضف 200 ميكرولتر لقاح إلى كل بئر من صفيحة معقمة من البوليسترين 96 بئرا (انظر جدول المواد) وأضف 200 ميكرولتر من الماء منزوع الأيونات إلى كل بئر من الآبار الخارجية لمنع الآبار الداخلية من الجفاف15.
  2. أضف 200 ميكرولتر من BHI المخفف بعشرة أضعاف إلى كل بئر من نفس اللوحة كعنصر تحكم سلبي.
  3. احتضان اللوحة عند 25 درجة مئوية لمدة 24 ساعة.
  4. إزالة طاف مع ماصة.
    ملاحظة: غالبا ما تكون الماصة متعددة القنوات أكثر ملاءمة لعينات متعددة.
  5. أضف بعناية 300 ميكرولتر PBS إلى كل بئر وإزالة المادة الطافية باستخدام ماصة.
    ملاحظة: غالبا ما تكون الماصة متعددة القنوات أكثر ملاءمة لعينات متعددة.
  6. كرر الخطوة 2.5 مرتين أخريين.
  7. أضف 200 ميكرولتر من محلول البنفسج البلوري (1٪) (انظر جدول المواد) إلى كل بئر واحتضانها في RT لمدة 30 دقيقة.
  8. كرر الخطوات من 2.4 إلى 2.6.
  9. أضف 200 ميكرولتر من الإيثانول المطلق إلى كل بئر واحتضانها لمدة 15 دقيقة في RT. اخلطها جيدا عن طريق السحب لأعلى ولأسفل عدة مرات.
  10. انقل شطف 100 ميكرولتر من كل بئر إلى لوحة جديدة سعة 96 بئرا.
  11. قم بقياس الامتصاص عند 595 نانومتر باستخدام قارئ الصفائح الدقيقة (انظر جدول المواد).
  12. عندما يتجاوز الامتصاص 2.0 ، قم بإجراء تخفيف مناسب للعينة إلى الامتصاص أقل من 2.0 في الإيثانول المطلق وقم بقياسه كما في الخطوة 2.11. ثم احسب امتصاص العينة (القيمة النهائية) بضرب القيمة المرصودة في عامل التخفيف.
  13. احسب الامتصاص الحقيقي للعينات عن طريق طرح متوسط قيمة التحكم السلبي من قيمة كل بئر من عينات الاختبار على نفس لوحة البئر.

3. عدد صلاحية الأغشية الحيوية

  1. أضف 1 مل لقاح (الخطوة 1) إلى كل بئر من لوحة البوليسترين المعقمة ذات 12 بئرا15. احتضان اللوحة عند 25 درجة مئوية لمدة 24 ساعة. إزالة طاف مع ماصة.
  2. أضف بعناية 1.5 مل من برنامج تلفزيوني معقم إلى كل بئر وإزالة المادة الطافية باستخدام ماصة. أضف 1 مل من برنامج تلفزيوني معقم إلى كل بئر.
  3. اكشط الأسطح السفلية والجدارية للبئر باستخدام كاشطات الخلايا المجهزة.
  4. انقل معلق الخلية المحصودة إلى أنبوب بلاستيكي معقم (10-1) يحتوي على 9 مل من محلول ملحي (0.85٪ كلوريد الصوديوم) و 10-20 حبة زجاجية (انظر جدول المواد).
    ملاحظة: لجمع أي حطام بيوفيلم متبقي على السطح السفلي للبئر ، يمكن إعادة تعليقه ونقله بواسطة ماصة باستخدام محلول ملحي من أنبوب 10-1 .
  5. دوامة أنبوب 10-1 لمدة 60 ثانية بأقصى سرعة.
  6. قم بعمل تخفيف تسلسلي بمقدار 10 أضعاف عن طريق نقل 1 مل إلى الأنبوب المعقم التالي (10-2) الذي يحتوي على 9 مل محلول ملحي (0.85٪ كلوريد الصوديوم) حتى 10-7.
  7. انشر 100 ميكرولتر من كل تخفيف على أجار Acinetobacter (انظر جدول المواد) واحتضان ألواح الآجار عند 30 درجة مئوية لمدة 24-42 ساعة.
  8. احسب عدد المستعمرات الحمراء النموذجية على كل لوحة يدويا في النطاق بين 10 و 250.
  9. احسب عدد الخلايا القابلة للحياة في الغشاء الحيوي لكل بئر باستخدام المعادلة أدناه:
    خلايا قابلة للحياة = عدد المستعمرات × عوامل التخفيف × 10

4. تصور الأغشية الحيوية باستخدام مجهر المسح بالليزر متحد البؤر (CLSM)

  1. أضف 200 ميكرولتر لقاح إلى كل بئر من صفيحة معقمة ذات 96 بئرا مخصصة للتحليل المجهري.
  2. احتضان اللوحة عند 25 درجة مئوية لمدة 24 ساعة.
  3. إزالة طاف مع ماصة.
  4. أضف بعناية 300 ميكرولتر من الماء منزوع الأيونات بالفلتر إلى كل بئر وقم بإزالة المادة الطافية باستخدام ماصة.
  5. كرر الخطوة 4.4.
  6. تحضير خليط SYTO 9 ويوديد البروبيديوم (انظر جدول المواد) المخفف في الماء منزوع الأيونات المعقم بالفلتر إلى تركيز نهائي يبلغ 10 ميكرومتر و 60 ميكرومتر ، على التوالي.
  7. أضف الخليط إلى كل بئر عند 200 ميكرولتر واحتضن الطبق لمدة 20-30 دقيقة في RT في الظلام.
  8. كرر الخطوات 4.3-4.4
  9. تصور الأغشية الحيوية المرفقة بالسطح السفلي باستخدام CLSM بطول موجة إثارة يبلغ 488 نانومتر و 561 نانومتر ونطاق الطول الموجي للانبعاث 499-535 نانومتر و 568-712 نانومتر على التوالي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

وفقا للبروتوكول ، تم تشكيل الأغشية الحيوية لعزلات Acinetobacter ، المعزولة أصلا من أسطح المطبخ ، على صفيحة من البوليسترين 96 بئرا ، ملطخة بالبنفسج البلوري ، وتم إذابة الأصباغ في الإيثانول وقياسها لكتلة الأغشية الحيوية (الشكل 1). ويختلف عدد الأغشية الحيوية تفاوتا كبيرا تبعا للسلالات التي تتراوح بين OD 0.04 و1.69 (الشكل 1). واستنادا إلى المعايير التي وضعها ستيبانوفيتش وآخرون.16، شكلت جميع العزلات باستثناء A. bouvetii أغشية حيوية. شكلت المقاومات الإشعاعية غشاء حيويا ضعيفا. شكلت A. junii و A. baumannii أغشية حيوية معتدلة ، بينما شكلت A. pittii و A . ursingii أغشية حيوية قوية.

لحساب الخلايا القابلة للحياة في الأغشية الحيوية ، تم كشط الأغشية الحيوية باستخدام كاشطات الخلايا ، ودوامة بسرعة عالية ، وتخفيفها ، ونشرها على ألواح انتقائية من Acinetobacter . بعد الحضانة ، تم حساب عدد المستعمرات لتقدير عدد خلايا الأغشية الحيوية (الشكل 2). تحتوي جميع العزلات باستثناء A. bouvetii على خلايا تعادل 7-8 Log CFU في الأغشية الحيوية الخاصة بها. تمشيا مع خاصية الأغشية الحيوية غير المشكلة التي أظهرها مقايسة البنفسج البلوري ، كان لدى A. bouvetii مستوى أقل بكثير من رقم الخلية عند 4.4 Log CFU.

تم تصور الأغشية الحيوية المرفقة بالسطح السفلي باستخدام CLSM (الشكل 3). تم العثور على كمية كبيرة من الأغشية الحيوية في A. junii و A. baumannii و A. ursingii مع مورفولوجيا الأغشية الحيوية المتميزة. في حين أن A. pittii كان غشاء حيويا قويا سابقا في مقايسة البنفسج البلوري ، إلا أنه لم يشكل الكثير من الأغشية الحيوية على السطح السفلي.

Figure 1
الشكل 1: قياس كتلة الأغشية الحيوية لبكتيريا الراكدة المتكونة على صفيحة من البوليسترين 96 بئرا باستخدام مقايسة البنفسج البلوري. تمثل أشرطة الخطأ الانحراف المعياري عن ثلاث نسخ. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: أعداد قابلة للحياة من الأغشية الحيوية Acinetobacter المتكونة على صفيحة بوليسترين ذات 12 بئرا. تمثل أشرطة الخطأ الانحراف المعياري عن التكرار. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: الأغشية الحيوية Acinetobacter المرفقة بالسطح السفلي والتي تشكلت على صفيحة 96 بئرا تم تصورها بواسطة CLSM باستخدام أصباغ SYTO 9 و propidium iodide . قضبان المقياس: 50 ميكرومتر. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

باستخدام البروتوكول الموصوف ، تم قياس تكوين الأغشية الحيوية لعزلات Acinetobacter بدرجات متفاوتة ، وتصورها ، وتم تقدير الخلايا القابلة للحياة في الأغشية الحيوية (الشكل 1 والشكل 2 والشكل 3).

في هذا البروتوكول ، تم استخدام درجتي حرارة مختلفتين ، 30 درجة مئوية للنمو و 25 درجة مئوية لتشكيل الأغشية الحيوية للراكدة. تم استخدام 30 درجة مئوية لأن العديد من الدراسات استخدمت أكثر من 30 درجة مئوية للنمو الأمثل للراكدة ، والتي ستكون مناسبة للحصول على لقاح كاف12،13،14،17. ومع ذلك ، فإن درجة الحرارة هذه أعلى بشكل عام من درجات حرارة البيئة التي يحدث فيها تكوين الأغشية الحيوية ، مثل أسطح المستشفيات أو بيئات تجهيز الأغذية. لذلك ، تم استخدام 25 درجة مئوية لتشكيل الأغشية الحيوية ، والتي من شأنها محاكاة هذه الظروف البيئية أكثر.

استخدم هذا البروتوكول BHI المخفف 10 أضعاف بدلا من BHI الأصلي لتشكيل الأغشية الحيوية (الخطوة 1.12). من المحتمل أن تكون العديد من الأسطح ، مثل أسطح المستشفيات أو بيئات تجهيز الأغذية ، منخفضة المغذيات18,19. بالإضافة إلى ذلك ، تبقى الكائنات الحية الدقيقة على الأسطح الملوثة على الأسطح بعد التنظيف وتستمر في ظروف المغذياتالمنخفضة 20. لذلك ، فإن الظروف منخفضة المغذيات مثل BHI المخفف 10 أضعاف مرغوبة أكثر من الظروف عالية المغذيات مثل BHI الأصلي.

مقايسة الكريستال البنفسجي هي طريقة مقبولة عموما وراسخة لقياس كتلة الأغشية الحيوية ، وأظهرت هذه الدراسة أن قابلية تكوين الأغشية الحيوية للراكدة يمكن تمييزها بمستويات متفاوتة باستخدام هذه الطريقة.

يعد العد القابل للحياة في الأغشية الحيوية مهما أيضا لأن الخلايا القابلة للحياة في الأغشية الحيوية مسؤولة عن العدوى البشرية التي من المرجح أن تحدث بواسطة عدد أكبر من الخلايا21. وبالإضافة إلى ذلك، قد يكون العد القابل للتطبيق أداة جيدة للتمييز بين منتجي الأغشية الحيوية الفقراء، كما هو موضح في A. bouvetii و A. radioresistens (الشكل 1 والشكل 2). كان العدد القابل للحياة من A. radioresistens أعلى بكثير من A. bouvetii ، في حين تم العثور على اختلاف بسيط في كتلة الأغشية الحيوية ، مما يشير إلى احتمال أعلى للإصابة ب A. radioresistens (الشكل 1 والشكل 2). أيضا ، يمكن استخدام هذه الطريقة لتقدير نسبة Acinetobacter في الأغشية الحيوية متعددة الأنواع ، وهو أكثر شيوعا في البيئة.

تشكل الراكدة غشاء حيويا ليس فقط على السطح السفلي ولكن أيضا على الجدار الجانبي ، خاصة عند واجهة الهواء والسائل في الأنابيب17,22. يقتصر تحليل CLSM باستخدام صفيحة المعايرة الدقيقة على الأغشية الحيوية المرفقة بالسطح السفلي ، مما يجعل من الصعب أحيانا مقارنتها بالنتائج بواسطة مقايسة البنفسج البلوري ، والتي تقيس جميع الأسطح المغمورة ، بما في ذلك أسطح الجدران. كما تم العثور على كمية كبيرة من الأغشية الحيوية في السطح البيني بين الهواء والسائل في هذه العزلات ، وخاصة منتج الأغشية الحيوية القوي ، A. pittii. لقد شكل غشاء حيوي ضعيفا نسبيا على السطح السفلي مقارنة بالعزلات الأخرى (الشكل 3). لذلك ، يجب تطوير تقنية التحليل المجهري لتصور الأغشية الحيوية المتكونة في الجدار الجانبي.

في هذه الدراسة ، تم استخدام ثلاثة مقايسات مختلفة ، البنفسجي البلوري ، العد القابل للحياة ، و CLSM ، لتوصيف الأغشية الحيوية للراكدة. مقايسة البنفسج البلوري هي الطريقة الراسخة لتحديد كمية الأغشية الحيوية ، وتوجد معايير لتحديد قابلية تشكيل الأغشية الحيوية16. ومع ذلك ، فإنه لا يقيس الخلايا الحية و EPS فحسب ، بل يقيس أيضا الخلايا الميتة ، والتي تكون أقل أهمية من حيث العدوى البشرية والفوعة. يمكن قياس الخلايا الحية في الأغشية الحيوية بطريقة العد القابلة للتطبيق. ومع ذلك، لا يمكن تحديد قابلية تكوين الأغشية الحيوية من خلال طريقة العد القابلة للتطبيق لأن هذه الطريقة لا تقيس البولستيرين المتسلسل (EPS)، وهو مكون حاسم في بنية الأغشية الحيوية. لذلك ، لا تحتوي هذه الطريقة على المعايير أو القيمة الفاصلة لتحديد قابلية تشكيل الأغشية الحيوية. بالإضافة إلى ذلك ، فإن طريقة العد القابلة للحياة تقيس فقط قابلية زراعة الخلايا ولا تقيس الخلايا تحت "حالة قابلة للحياة ولكن غير قابلة للزراعة"11. يمكن تأكيد وجود الأغشية الحيوية من خلال طريقة CLSM ، التي تصور الأغشية الحيوية بشكل فعال. ومع ذلك ، فإنه يقيس فقط الأغشية الحيوية المرتبطة بالسطح السفلي ، على الرغم من أن الأغشية الحيوية غالبا ما تتشكل على الجدران الجانبية أيضا. لذلك ، يوصى باستخدام مقايسة الكريستال البنفسجي لتحديد قابلية تشكيل الأغشية الحيوية. بعد ذلك ، يمكن قياس الخلايا الحية والقابلة للزراعة في الأغشية الحيوية بطريقة العد القابلة للتطبيق ، ويمكن تأكيد الأغشية الحيوية المتصلة بالسطح السفلي أو تمييزها بطريقة CLSM.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

Acknowledgments

تم دعم هذا البحث من قبل برنامج البحث الرئيسي (E0210702-03) التابع للمعهد الكوري لبحوث الأغذية (KFRI) ، بتمويل من وزارة العلوم وتكنولوجيا المعلومات والاتصالات.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
96-well cell culture plate SPL 30096 Polystyrene 96-well plate
BHI (Brain Heart Infusion) broth Merck KGaA 1.10493.0500
Blood Agar Base Plate KisanBio MB-B1005-P50 Growth media for Acinetobacter
CHROMagar Acinetobacter CHROMagar AC092 Selective plate for Acinetobacter
Crystal violet solution Sigma-Aldrich V5265
Filmtracer LIVE/DEAD biofilm viability kit Invitrogen L10316 SYTO9 and propidium iodide
Microplate reader Tecan Infinite M200 PRO NanoQuant Biofilm measurement
RBC Glass Plating Beads RBC RG001 Glass beads
μ-Plate 96 Well Black ibidi 89621 Microplate intended for CLSM

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wong, D., et al. Clinical and pathophysiological overview of Acinetobacter infections: a century of challenges. Clinical Microbiology Reviews. 30 (1), 409-447 (2017).
  2. Carvalheira, A., Silva, J., Teixeira, P. Acinetobacter spp. in food and drinking water - A review. Food Microbiology. 95, 103675 (2021).
  3. Towner, K. J. Acinetobacter: an old friend, but a new enemy. Journal of Hospital Infection. 73 (4), 355-363 (2009).
  4. Weber, D. J., Rutala, W. A., Miller, M. B., Huslage, K., Sickbert-Bennett, E. Role of hospital surfaces in the transmission of emerging health care-associated pathogens: Norovirus, Clostridium difficile, and Acinetobacter species. American Journal of Infection Control. 38 (5), S25-S33 (2010).
  5. Flemming, H. C., et al. The biofilm matrix: multitasking in a shared space. Nature Reviews Microbiology. 21 (2), 70-86 (2023).
  6. Flemming, H. C., et al. Biofilms: an emergent form of bacterial life. Nature Reviews Microbiology. 14 (9), 563-575 (2016).
  7. Yin, W., Wang, Y., Liu, L., He, J. Biofilms: the microbial "protective clothing" in extreme environments. International Journal of Molecular Sciences. 20 (14), 3423 (2019).
  8. Gedefie, A., et al. Acinetobacter baumannii biofilm formation and its role in disease pathogenesis: a review. Infection and drug resistance. 14, 3711-3719 (2021).
  9. Whiteway, C., Breine, A., Philippe, C., Van der Henst, C. Acinetobacter baumannii. Trends in Microbiology. 30 (2), 199-200 (2022).
  10. Longo, F., Vuotto, C., Donelli, G. Biofilm formation in Acinetobacter baumannii. New Microbiologica. 37 (2), 119-127 (2014).
  11. Azeredo, J., et al. Critical review on biofilm methods. Critical Reviews in Microbiology. 43 (3), 313-351 (2017).
  12. Jia, J., Xue, X., Guan, Y., Fan, X., Wang, Z. Biofilm characteristics and transcriptomic profiling of Acinetobacter johnsonii defines signatures for planktonic and biofilm cells. Environmental Research. 213, 113714 (2022).
  13. Yang, C., Su, P., Moi, S., Chuang, L. Biofilm formation in Acinetobacter baumannii: genotype-phenotype correlation. Molecules. 24 (10), 1849 (2019).
  14. Alamri, A. M., Alsultan, A. A., Ansari, M. A., Alnimr, A. M. Biofilm-formation in clonally unrelated multidrug-resistant Acinetobacter baumannii isolates. Pathogens. 9 (8), 630 (2020).
  15. Lim, E. S., Nam, S. J., Koo, O. K., Kim, J. S. Protective role of Acinetobacter and Bacillus for Escherichia coli O157:H7 in biofilms against sodium hypochlorite and extracellular matrix-degrading enzymes. Food Microbiology. 109, 104125 (2023).
  16. Stepanović, S., Ćirković, I., Ranin, L., Svabić-Vlahović, M. Biofilm formation by Salmonella spp. and Listeria monocytogenes on plastic surface. Letters in Applied Microbiology. 38 (5), 428-432 (2004).
  17. Boone, R. L., et al. Analysis of virulence phenotypes and antibiotic resistance in clinical strains of Acinetobacter baumannii isolated in Nashville, Tennessee. BMC Microbiology. 21 (1), 21 (2021).
  18. Otter, J. A., et al. Surface-attached cells, biofilms and biocide susceptibility: implications for hospital cleaning and disinfection. Journal of Hospital Infection. 89 (1), 16-27 (2015).
  19. Ravishankar, S., Juneja, V. K. Adaptation or resistance responses of microorganisms to stresses in the food processing environment. Microbial Stress Adaptation and Food Safety. Yousef, A. E., Juneja, V. K. , (2003).
  20. Dewanti, R., Wong, A. C. L. Influence of culture conditions on biofilm formation by Escherichia coli O157:H7. International Journal of Food Microbiology. 26 (2), 147-164 (1995).
  21. McConnell, M. J., Actis, L., Pachón, J. Acinetobacter baumannii: human infections, factors contributing to pathogenesis and animal models. FEMS Microbiology Reviews. 37 (2), 130-155 (2013).
  22. McQueary, C. N., Actis, L. A. Acinetobacter baumannii biofilms: variations among strains and correlations with other cell properties. The Journal of Microbiology. 49 (2), 243-250 (2011).

Tags

القياس الكمي ، تقييم الجدوى ، التصور ، الأغشية الحيوية الراكدة ، عدوى المستشفيات ، الأسطح الجافة ، بيئات المستشفيات ، تكوين الأغشية الحيوية ، التلوين ، البنفسج البلوري ، قارئ الصفائح الدقيقة ، أرقام الخلايا ، كاشطات الخلايا ، المالحة ، الخرز الزجاجي ، أجار الراكدة ، طريقة العد القابلة للحياة ، المستعمرات الحمراء ، الأغشية الحيوية المختلطة الأنواع ، أصباغ الفلورسنت ، التحليل المجهري ، صبغة SYTO9 ، صبغة يوديد البروبيديوم ، مجهر المسح الضوئي بالليزر متحد البؤر
القياس الكمي وتقييم الجدوى واستراتيجيات التصور للأغشية الحيوية <em>الراكدة</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kim, J. S., Lim, J. Quantification,… More

Kim, J. S., Lim, J. Quantification, Viability Assessment, and Visualization Strategies for Acinetobacter Biofilms. J. Vis. Exp. (198), e65517, doi:10.3791/65517 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter