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方法文章

利用超短自组装肽基质从SW1222细胞系构建和表征结直肠癌类器官 关键词：类器官，结直肠癌，SW1222细胞系，自组装肽，三维细胞培养，肿瘤模型，细胞外基质，癌症研究

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DOI：

10.3791/66060

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2024年5月3日

 ,  , 
1Laboratory for Nanomedicine, Biological & Environmental Science & Engineering, King Abdullah University of Science and Technology, 2Computational Bioscience Research Center, King Abdullah University of Science and Technology, 3Red Sea Research Center, King Abdullah University of Science and Technology

本文内容

摘要

本实验方案旨在通过免疫染色评估生物功能化自组装肽在细胞黏附、类器官形态及基因表达方面的作用。我们将使用结直肠癌细胞系，以提供一种经济高效的方法来获取用于高强度检测的类器官。

摘要

超短自组装肽（SAPs）可自发形成类似于细胞外基质的纳米纤维。这些纤维能够形成具有生物相容性、可生物降解且无免疫原性的水凝胶。我们先前已证实，当SAPs被蛋白来源的基序进行生物功能化修饰后，可模拟支持结直肠类器官形成的细胞外基质特性。这些生物功能化肽水凝胶在保留原始母体肽的力学性能、可调控性和可打印性的同时，引入了促进细胞-基质相互作用的信号，从而增强细胞黏附。本文提供了利用一种可高效形成结直肠癌类器官的腺癌细胞系，评估和表征多种生物功能化肽水凝胶对细胞黏附和管腔形成影响的实验方案。这些方案将通过免疫染色和荧光图像分析，帮助评估生物功能化肽水凝胶对细胞黏附及管腔结构形成的作用。本研究中所使用的细胞系此前已被用于在动物来源基质中生成类器官。

引言

近年来，自组装肽（SAPs）已成为组织工程应用中极具前景的生物材料。SAPs具有独特的性质，包括可自发形成纳米纤维、良好的生物相容性、可生物降解性以及无免疫原性，使其成为支架开发的理想候选材料1。此前，SAPs已与多种细胞联合使用，特别是已有报道的超短自组装肽能够实现干细胞的包封，同时在超过30代的长期培养过程中维持其多能性，且染色体异常的发生率极低2,3,4。因此，将SAPs应用于类器官培养成为一项合理的后续发展方向。

类器官是由单个多能细胞发育而来的复杂三维结构。这些结构可分化为多种细胞类型，并通过自我组织模拟胚胎和组织发育过程。 体外5这一创新性框架已发展成为一种强大的工具，用于 体外 研究，高效地保存了特征性的遗传、表型和行为特征 在体 器官6然而，类器官研究从实验室向临床转化的一个主要障碍在于其可重复性的需求。7结果的差异主要归因于难以将人多能干细胞完全分化为特定的细胞谱系，加之类器官模型中缺乏真实的组织结构以及固有的复杂性。随着基于干细胞和类器官的研究日益流行8，对于具有动态力学性能和类似整合素的黏附位点的生物材料，或具有可控降解性的支架，其需求日益增加7,9这些特性可以通过战略性地利用生物功能化自组装多肽（SAPs）进行有效调控。

自组装肽（SAPs）是一类较短的氨基酸序列，具有自发组织成明确定义结构的内在能力10。这些肽通常含有交替排列的疏水性和亲水性残基，通过非共价相互作用（包括氢键、静电相互作用和疏水效应）驱动其自组装过程11,12。这些肽的自组装过程主要由系统自由能最小化的需要所驱动。在水环境中，疏水残基倾向于聚集在一起以减少与水的接触，而亲水残基则与周围的水分子相互作用。这一现象导致多种纳米结构的形成。在此情况下，超短自组装肽会形成纳米纤维，其特性取决于肽序列和环境条件2,12,13,14,15,16。这些肽采用β-转角构象，单个肽链彼此平行或反平行排列，并通过氢键稳定（图1）。阳离子的存在可加速导致纳米纤维形成的自组装过程。

多肽纳米纤维被证实具有天然截留大量水分的能力。这一特性有助于形成水凝胶，进而构建出一种生物相容且可生物降解的三维空间，有利于细胞的增殖与生长。这些自组装多肽纳米纤维精细地模拟了天然细胞外基质（ECM）环境固有的拓扑结构1。这种相似性为细胞提供了仿生生理环境，进一步促进细胞的最佳生理活动17。此外，这些多肽具有高度的可调变性4，通过改变多肽序列，可调节基质的硬度、凝胶动力学和孔隙率等特性。因此，自组装多肽（SAPs）已成为现代生物材料科学中的关键组分，广泛用作组织再生和细胞培养的支架材料13,17。

自组装肽的一个关键优势在于其能够在分子水平上轻松合成和修饰。这一优势使得特定的功能基团或生物活性基序能够被引入肽序列中，从而设计出具有定制特性和功能的肽18,19,20（图1B）。例如，可设计经生物功能化的SAP以模拟细胞外基质（ECM），并通过RGD肽促进细胞分化19,21。已有报道表明，肽Ben-IKVAV因其配体特异性基序可显著提高神经元特异性标志物的表达水平22。这些肽还可被改造以展示生物活性分子，如整合素结合肽，从而增强细胞存活能力23。最后，其他一些经生物功能化的SAP已被开发用于促进血管生成，其结构中包含了IKVAV和YIGSR基序24。

先前发表的研究报道了生物功能化的自组装肽（SAP），表明可通过加入衍生出该生物功能化SAP的原始肽段，进一步修饰其自组装特性25。这些SAP混合物还可提供多种SAP配方，其生化活性和理化性质各不相同。例如，两亲性肽IIFK是一种超短自组装肽，可耐受多种功能基序的生物功能化修饰，其中以引入IKVAV基序为例（图1B）。这两种肽段无论单独存在或共同存在时，均可形成纳米纤维。每种配方均能形成具有不同物理特性的水凝胶（图2）

然而，由于自组装肽（SAPs）生物功能化后可能产生大量排列组合和替代方案，因此需要提供一种快速且经济高效的类器官检测方法。SW1222细胞系是进行此类高通量、低成本类器官评估的候选之一，该细胞系来源于人结直肠腺癌26,27。SW1222细胞具有聚集形成类似类器官的三维结构的特性，使其成为研究组织发育和再生医学应用的理想模型。已发现SW1222细胞能够生成类器官，这归因于其内在高表达LGR5基因27。此前已有研究充分证实，单个LGR5+干细胞可形成类器官，同时SW1222细胞也表现出形成结直肠癌类器官形态特征的倾向28。

在本方法学论文中，我们介绍了利用SW1222细胞评估和表征多种生物功能肽对细胞黏附和管腔形成影响的详细实验方案（图3）。通过提供逐步操作流程和成像分析方法，我们希望为类器官的生物制造以及简化自组装肽基质在类器官培养中的评价提供有价值的参考。

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方案

1. 缓冲液与溶液的配制

注意：所有列出的浓度均为终浓度。

  1. 向Iscove改良Dulbecco培养基（IMDM）中加入胎牛血清（FBS）和青霉素-链霉素，使其终浓度分别为10%和1%，配制完全IMDM培养基。4 °C避光保存，可保存长达1个月。
  2. 在磷酸盐缓冲液（PBS）中混合MgCl2（3 mM）、蔗糖（300 mM）和Triton X-100（0.5%），配制透化缓冲液。4 °C保存，可保存长达2个月。
  3. 在PBS中加入牛血清白蛋白（BSA，1%）、甘氨酸（0.3 M）和Tween-20（0.1%），配制封闭缓冲液。4 °C保存，可保存长达2个月。
  4. 在无菌条件下，用超纯水将10x PBS稀释至2x PBS。室温保存，可保存6个月以上。
  5. 将3 mg肽粉在紫外线下灭菌30分钟。加入500 µL超纯水，使用涡旋振荡器溶解。
    注意：最终浓度应为目标浓度的两倍，即6 mg/mL，因为1x浓度为3 mg/mL。

在肽中由SW1222制备结直肠癌类器官

  1. 在4 °C下过夜解冻一份等分试样，并在使用前保持在冰上，以制备基底膜基质对照。
  2. 在24孔板的每个孔中央加入10 µL的2倍浓度肽溶液。将培养板在室温下孵育10分钟。或者，在6孔板的每个孔中加入8-10滴。
    注意：用于共聚焦显微镜和电子显微镜的样品，若接种在无菌盖玻片上，则更便于操作。
  3. 加入10 µL的2倍浓度PBS。用移液枪头轻轻混合PBS溶液。让凝胶稳定至少20分钟，确保液滴基本保持完整。
    注意：添加PBS并轻柔混合的目的是维持液滴的完整性，避免水凝胶扩散成一层。
  4. 使用0.125%胰蛋白酶-EDTA溶液（5 mL）消化SW1222细胞。在37 °C孵育5-10分钟，直至细胞从培养瓶脱落。避免敲击培养瓶，以防细胞结团。
  5. 加入5 mL完全培养基以中和胰蛋白酶活性。使用30 µm细胞筛过滤细胞悬液。或者，使用带有25 G针头的注射器破坏细胞聚集体。
  6. 制备浓度为0.4 × 106 个细胞/mL的细胞悬液，并使用10 µL微量移液器向每个肽液滴中加入2 µL细胞悬液。
  7. 将液滴在37 °C、5% CO2条件下孵育30分钟。孵育后，向每孔加入0.5 mL补充培养基。
  8. 在等待期间，通过使用补充培养基将主储备液（8-12 mg/mL，根据批次而定）稀释至终浓度3 mg/mL，制备基底膜基质对照。向该溶液中加入细胞（每25 µL含800个细胞）。
    注意：基底膜的操作必须始终在冰上进行。移液枪头在接触水凝胶前必须用预冷的PBS冲洗，否则会在枪头内部发生聚合。
  9. 在每个孔中加入20 µL基底膜溶液液滴。在37 °C孵育20分钟，使液滴形成凝胶。材料凝胶化后，加入0.5 mL完全培养基。
  10. 每3-4天更换一次培养基。从第4天起观察细胞排列并出现腔体形成的迹象。
  11. 在第1天、第4天和第7天进行明场成像，以评估类器官的生长情况。

3. 存活率与增殖

  1. 为活力检测准备三块黑孔板，为增殖检测准备三块黑孔板。每孔加入 25 µL 的 2x 肽溶液，并用等体积的 2x PBS 进行凝胶化。按上述方法接种细胞。
  2. 为增殖检测板中每种肽水凝胶配方准备三个孔作为空白对照孔。这些孔不接种细胞。
  3. 从活力检测用孔板中移除培养基，并用 1x PBS 洗涤，每次 5 分钟，共洗 3 次。
  4. 从哺乳动物细胞活力/细胞毒性检测试剂盒（见材料表）中将 Calcein-AM 和乙碘化物同型双聚体（ethidium homodimer）稀释至 8 µM，加入同一避光锥形管中。为配制 2 mL 该溶液，在避光锥形管中加入 2 mL PBS、4 µL Calcein-AM 原液和 8 µL Ethidium homodimer-1 原液。
  5. 将步骤 3.4 中配制的 Calcein/乙碘化物同型双聚体溶液加入 96 孔板中，每孔 100 µL。避光并在室温下孵育 30 分钟。
  6. 用 1x PBS 洗涤 3 次，每次 5 分钟。使用荧光显微镜观察时，若使用 4x 物镜，则至少拍摄三个视野（中心、上、下）；若使用 10x 或 20x 物镜，则至少拍摄五个视野（中心、左上、右上、左下、右下）。
  7. 从增殖检测用孔板中移除培养基，确保最终体积为 90 µL。
  8. 加入 10 µL Alamar Blue 溶液（见材料表），使其终浓度为 10%。
  9. 避光并在 37 °C、5% CO2 条件下孵育 2–4 小时。
  10. 使用酶标仪检测荧光（激发/发射 = 530–560/590 nm/nm）或吸光度（570 nm）。对空白孔测得的数值取平均值，并从各含细胞孔的数值中扣除该平均值。
  11. 通过计算每组条件信号的平均值并减去相应空白组的平均值，得到增殖数值。通过生成相对吸光度/荧光信号随时间变化的索引箱线图来绘制图表。

4. 细胞对基质的黏附实验

  1. 在两个独立的96孔板中分别制备100 µL肽水凝胶。
  2. 在每个孔中接种20,000个细胞，并加入100 µL培养基。将培养板在37 °C、5% CO2条件下孵育90分钟。
  3. 孵育结束后，仅取其中一个培养板，使用P200移液器轻轻重悬培养基20–30秒。注意避免移液枪头接触凝胶，以免破坏水凝胶结构。或者，如果水凝胶的机械性能允许（G' > 8,000 Pa），可通过移动涡旋振荡器轻敲培养板四周。
    注意：重悬培养基（或使用涡旋振荡器轻敲培养板）可去除未贴壁细胞以及与基质表面黏附较弱的细胞。细胞贴附通常在90分钟内发生，但贴附强度会因特定肽水凝胶及其黏附与结合特性而异。已知结直肠类器官在刚度低于2,000 Pa的基质中生长更佳。因此，由于本方案中使用的水凝胶质地较软且易碎，我们特别强调使用温和的机械应力处理。
  4. 从两个培养板中各移除100 µL培养基，并用1× PBS洗涤一次。
  5. 配制1 µg/mL的DAPI溶液。向所有孔中加入100 µL DAPI溶液，在室温下孵育5分钟。
  6. 在荧光显微镜下拍摄具有代表性的视野图像。确保所有图像均使用相同物镜获取，以保持像素/距离比例恒定。
    注意：使用10倍物镜时拍摄9个视野，使用20倍物镜时拍摄15个视野。
  7. 将荧光图像导入图像分析软件（例如ImageJ），并对所有图像进行颗粒分析。
    1. 在图像菜单中，选择类型，然后点击8位。
    2. 在图像菜单中，选择调整，然后点击亮度/对比度。点击自动按钮 | 应用。
    3. 在图像菜单中，选择调整，然后点击阈值。点击自动按钮后关闭窗口。
    4. 在分析菜单中，点击分析颗粒。勾选“汇总”选项，然后点击确定。
    5. 在汇总窗口中，将鼠标悬停于文件菜单，点击保存以保存汇总数据。
  8. 将所有图像的分析结果导出至标准统计分析软件。
  9. 计算施加应力前后细胞覆盖面积的百分比。以每种条件为分组，绘制覆盖面积百分比的索引箱线图。

5. 肽水凝胶中类器官的免疫染色

  1. 按照步骤 2.1–2.10 所述，将 800 个细胞接种于 20 µL 肽水凝胶液滴中，培养 4 天。
  2. 第 4 天，吸去培养基，用 1× PBS 洗涤每个孔 2 次。
  3. 加入 400 µL 4% 甲醛溶液，在室温下孵育 30 分钟。
  4. 用 P1000 移除甲醛溶液，并用 1× PBS 洗涤 1 次。
  5. 加入 1 mL 通透缓冲液，在室温下孵育 5 分钟。
  6. 用 P1000 移除通透缓冲液，并用 1× PBS 洗涤 1 次。
  7. 加入 0.5 mL 封闭缓冲液，在室温下孵育 30 分钟。
  8. 用 P1000 移除封闭缓冲液，并用 1× PBS 洗涤。
  9. 根据生产商说明书（见材料表），用封闭缓冲液稀释一抗，将 200 µL 稀释液加入两个孔中。
  10. 在 4 °C 下孵育过夜。
  11. 用 P200 移除染色液，并用 1× PBS 洗涤 1 次。
  12. 根据生产商说明书（见材料表），用封闭缓冲液稀释二抗；在二抗溶液中以 1:40 的比例加入鬼笔环肽偶联物。
  13. 避光，在室温下孵育不超过 3 小时；用 P200 移除染色液，并用 1× PBS 洗涤 1 次。
  14. 用封闭缓冲液配制 1 µg/mL 的 DAPI 溶液，每孔加入 300 µL。
  15. 避光，在室温下孵育 5 分钟。
  16. 用 P200 移除染色液，并用 1× PBS 洗涤 1 次。
  17. 避光，于 4 °C 下保存，最长可保存 7 天。

6. 类器官在基质中的成像与图像分析

  1. 使用10倍物镜在落射荧光显微镜下对染色样本进行成像。仅使用鬼笔环肽（phalloidin）和DAPI通道。
  2. 打开Cellopose软件，按ctrl + L加载图像。由于软件将访问所选图像所在位置的所有文件，请确保将所有荧光图像保存在相同目录下，且不包含任何子文件夹。
  3. 在分割面板中输入类器官菌落的平均直径，然后按ENTER键。
  4. 选择适用于结肠类器官的自定义模型，然后点击运行模型按钮。
    注意：此处建议在Cellpose2.0中使用两个从头训练的模型29,30
  5. 按ctrl + s将分割掩膜保存为.npy文件。
  6. 使用键盘方向键浏览文件夹中的图像，并对文件夹内所有图像运行结肠类器官模型。
  7. 复制该文件夹，并使用针对结肠类器官腔的模型重复步骤6.2–6.6。
  8. 打开ImageJ，点击插件 | 宏 | 运行…，运行来自Cellpose GitHub网站的imagej_roi_converter.py文件，并等待窗口出现。
  9. 从结肠类器官文件夹中选择第一个文件，然后点击打开。
  10. 选择与第一个文件对应的seg.npy文件，然后点击打开。
    注意：ImageJ会将掩膜转换为感兴趣区域（ROI），并将其与相应的荧光图像叠加。
  11. 在ROI管理器窗口中点击全选，然后点击测量。
  12. 在结果窗口中点击文件 | 另存为…，保存测量结果。
    注意：这将生成一个.csv文件，其中包含视野中每个菌落的所有形态学参数。
  13. 对结肠类器官腔文件夹中的同一图像重复步骤6.8–6.12。
  14. 加载OriginPro软件，按ctrl + 3打开导入向导。点击三个点按钮，选择与同一图像对应的类器官和腔形态参数的两个.csv文件。
  15. 将腔形态参数的结果复制并粘贴到菌落结果相邻的一列中，确保每个腔的测量值与其对应的菌落配对。
  16. 在新列中，将腔的面积除以菌落的面积，得到腔相对于其所在菌落的相对面积。
  17. 选择对应于每个菌落圆形度和腔面积的列，点击绘图 | 基本2D | 散点图。
  18. 在图表窗口中右键单击，选择图表详情。点击质心(PRO)选项卡，勾选显示子集质心点、连接至数据点和显示椭圆选项。

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结果

首先，我们通过明场成像评估了在24孔板中培养7天的细胞。在培养的一周内，我们观察到细胞逐渐聚集成类器官的小细胞簇，如图4所示。采用受控扫描方法可追踪不同天数之间细胞和类器官的移动情况。总体而言，我们观察了整个一周内细胞形态的演变过程。SW1222来源的类器官应呈现圆形形态和较明亮的外观。较暗的外观则提示细胞密度过高，属于不理想状态，如使用多肽P培养的部分克隆在第7天所见（图4）。

图5展示了细胞活力（图5A）和增殖实验（图5B）的结果，分别反映了死细胞与活细胞的数量以及代谢活性。本研究采用基于钙黄绿素和碘化乙啶同源二聚体的细胞活力检测方法，发现在Matrigel中培养至第7天时，这些细胞中仅有少量死细胞。这一现象在所有基于多肽的水凝胶中也均存在，但在2D培养中未观察到。增殖实验结果显示，...

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讨论

通过生物功能化，自组装肽（SAPs）在生物医学研究中的巨大潜力得以凸显，其可塑性和适应性为研究提供了广阔空间。面对如此众多的可能组合，如何高效地测试并确定特定应用（尤其是在类器官研究中）最具前景的构型，成为一项挑战，亟需一种快速且经济高效的解决方案。源自人结直肠腺癌的SW1222细胞系，成为此类高强度评估的关键候选模型。本文介绍了一种用于评估和表征在基于肽的基质中生长的类器官的方法。该方案提出了一种整合性强且成本效益高的策略，聚焦于通过细胞活力与增殖评估、黏附实验、形态学分析以及免疫细胞化学等手段对类器官进行监测与分析。在细胞培养实验中选择不同浓度的肽，其背后有严谨的科学依据，旨在契合特定的实验目标，并显著推动我们对肽基质环境下类器官培养机制的理解。我们的研究历程随时间不断演进，因而需要采用多样化的策略来探索不同的配方。首先，我们采用了1.5 mg/mL至4.5 mg/mL范围内的多种肽浓度，目的在于系统性地探究潜在结果的谱系。通过使用较低浓度，我们旨在评估支持类器官生长和发育所需的最低肽浓度，这一信息对于理解低成本、低资源消耗应用的可行性至关重要。相反，选择较高浓度则是为了探究肽浓度的上限及其对类器官行为的潜在影响，从而回答有关饱和效...

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

本工作由沙特阿拉伯阿卜杜拉国王科技大学提供资金支持。作者感谢由阿卜杜拉国王科技大学创新与经济发展部门授予的KAUST种子基金资助和KAUST创新基金资助。作者谨此感谢阿卜杜拉国王科技大学生物科学与成像核心实验室在生物学表征和显微镜分析方面提供的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1x PBSGibco14190144
6孔板，经组织培养处理Corning07-200-83
10x PBS，无钙，无镁Gibco70011044
16% 甲醛（w/v），无甲醇Thermo Scientific28906
24孔板，经组织培养处理Corning09-761-146
96孔黑色板，经组织培养处理Corning07-200-565
alamarBlue 细胞活力检测试剂InvitrogenDAL1025
抗Ezrin抗体，兔单克隆Abcamab40839二抗使用：抗兔DyLight 633
抗pan-Cadherin抗体，兔多克隆Abcamab16505二抗使用：抗兔Alexa 488
抗ZO1紧密连接抗体，山羊多克隆Abcamab190085二抗使用：抗山羊Alexa 488
BSASigma-AldrichA9418
Cellpose 2.0NANA从 https://github.com/MouseLand/cellpose 获取
配备Airyscan的共聚焦激光扫描显微镜ZEISSLSM 880
DAPIInvitrogenD1306
驴抗山羊IgG（H+L）二抗，Alexa Fluor 488标记InvitrogenA-11055
甘氨酸CytivaGE17-1323-01
山羊抗兔IgG（H+L）二抗，Alexa Fluor 488标记InvitrogenA-11008
山羊抗兔IgG（H+L）二抗，DyLight 633标记Invitrogen35562
热灭活胎牛血清（HI FBS）Gibco16140071
ImageJ 1.54fNIHNA
IMDMGibco12440079
LIVE/DEAD 细胞活力/细胞毒性检测试剂盒（适用于哺乳动物细胞）InvitrogenL3224
氯化镁六水合物（MgCl2 6 H2O）Sigma-AldrichM2393
类器官培养用Matrigel，无酚红Corning356255文中简称为Matrigel或基底膜基质。
明场显微镜
EVOS显微镜Thermo ScientificEVOS M7000
OriginPro 2023 (64位) 10.0.0.154OriginLab CorpNA
青霉素-链霉素（10,000 U/mL）Gibco15140122
肽P（Ac, Ile, Ile, Phe, Lys, NH2）实验室自制NA可由Bachem等多肽制造商定制合成。
肽P1（Ac, Ile, Ile, Phe, Lys, Gly, Gly, Gly, Arg, Gly, Asp, Ser, NH2）实验室自制NA可由Bachem等多肽制造商定制合成。
肽P2（Ac, Ile, Ile, Phe, Lys, Gly, Gly, Gly, Ile, Lys, Val, Ala, Val, NH2）实验室自制NA可由Bachem等多肽制造商定制合成。
罗丹明鬼笔环肽InvitrogenR415
圆形盖玻片，直径10 mmVWR631-0170
扫描电子显微镜Thermo Fisher - FEITENEO VS
无菌30 μm滤网Sysmex04-004-2326
蔗糖Sigma-AldrichS1888
SW1222细胞系ECACC12022910
吐温-100Thermo Scientific85111
0.25% 胰蛋白酶-EDTAGibco25200056
吐温20Sigma-AldrichP1379
UltraPure水Invitrogen10977015

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