在超短自组装肽基质中制备和表征来自 SW1222 细胞系的结直肠癌类器官

近年来，自组装肽 （SAP） 已成为组织工程应用中前景广阔的生物材料。SAP 具有独特的特性，包括纳米纤维的自发形成、生物相容性、生物降解性和非免疫原性，使其成为支架开发的有吸引力的候选者¹。SAP 以前曾与各种类型的细胞一起使用，值得注意的是，据报道，超短 SAP 促进了干细胞的包埋，同时在包括 30 多次传代在内的长时间内保持其多能性，并且染色体畸变的发生率最低 ^2,3,4。因此，调整 SAP 以用于类器官培养构成了合理的后续步骤。

类器官是由单个多能细胞产生的复杂三维结构。这些结构产生各种细胞类型，然后这些细胞类型自组织以复制体外胚胎和组织生长的发育过程 ⁵。这种创新框架已发展成为体外研究的强大工具，有效地保留了体内器官的遗传、表型和行为属性^{特征 6}。然而，基于类器官的结果从实验室到床边过渡的主要障碍是需要可重复性⁷。结果的这种差异主要归因于难以将人类多能干细胞完全分化为专门的细胞谱系，而缺乏真实的组织结构和类器官模型中遇到的固有复杂性则使情况变得更加复杂。鉴于基于干细胞和类器官的研究越来越受欢迎⁸，对具有动态机械性能和整合素样粘附位点的生物材料或具有可控降解性的支架的需求不断增加 ^7,9。这些属性可以通过战略性利用生物功能化 SAP 来有效调整。

SAP 是氨基酸的短序列，具有自发组织成明确结构的固有能力¹⁰。这些肽通常包含交替的疏水和亲水残基，这些残基通过非共价相互作用（包括氢键、静电相互作用和疏水效应）驱动其自组装^11,12。这些肽的自组装过程主要是由于需要最小化系统的自由能。在水性环境中，疏水残基往往会聚集在一起，以尽量减少它们与水的接触，而亲水残基则与周围的水分子相互作用。这种现象导致各种纳米结构的形成。在这种情况下，超短自组装肽形成纳米纤维，其特性取决于肽序列和环境条件 2,12,13,14,15,16。这些肽采用 β 转构象，其中单个肽链彼此平行或反平行排列，由氢键稳定（图 1）。正离子的存在加速了导致纳米纤维形成的自组装过程。

肽纳米纤维已被确定为具有捕获大量水的先天能力。这一特性促进了水凝胶的产生，水凝胶随后表现为有利于细胞增殖和生长的生物相容性和可生物降解的三维空间。这些自组装肽纳米纤维错综复杂地模拟了天然细胞外基质 （ECM） 环境固有的地形特征¹。这种相似性赋予细胞一个模仿其生理栖息地的环境，进一步促进最佳细胞活动¹⁷。此外，这些肽固有的多功能性允许相当程度的可调性⁴。这种适应性可以改变基质的特性，例如刚度、凝胶动力学和孔隙率。这些适应是通过对肽序列的修饰来实现的。因此，自组装肽 （SAP） 已成为当代生物材料科学中的关键成分，广泛用作组织再生和细胞培养的支架^13,17。

自组装肽的关键优势之一是它们能够在分子水平上轻松合成和修饰。这一优势允许将特定官能团或生物活性基序掺入肽序列中，从而能够设计出具有定制特性和功能的肽 18,19,20（图 1B）。例如，生物功能化的 SAP 可以设计为模拟 ECM 并使用 RGD 肽促进分化^19,21。据报道，由于其配体特异性基序，肽 Ben-IKVAV 还显著增加了神经元特异性标志物的表达²²。这些肽还可以经过工程改造，以显示生物活性分子，例如整合素结合肽，以提高细胞存活^{率 23}。最后，已经开发了其他生物功能化的 SAP，通过在它们的结构中包含 IKVAV 和 YIGSR 基序来促进血管生成²⁴。

早期出版物中报道的生物功能化 SAP 表明，可以通过包含来源生物功能化 SAP 的朴素肽来进一步修饰自组装²⁵。这些 SAP 混合物还可以提供各种 SAP 配方，这些配方的生化活性和物理化学性质各不相同。例如，两亲性肽 IIFK 是一种超短 SAP，可以承受具有各种基序的生物功能化，例如掺入 IKVAV 基序（图 1B）。两种肽都可以单独和组合形成纳米纤维。每种配方都会产生具有不同物理性质的水凝胶（图 2）

然而，由于 SAP 的生物功能化获得了广泛的潜在排列和替代方案，因此需要为类器官测试提供一种快速且具有成本效益的选择。这种密集且具有成本效益的类器官评估的一个候选者是来源于人结直肠腺癌的 SW1222 细胞系^26,27。SW1222 细胞具有能够聚集成类似于类器官的 3D 结构的特性，使其成为研究组织发育和再生医学应用的理想模型。SW1222 细胞已被确定能够产生类器官，因为它们固有地过表达 LGR5 基因²⁷。以前已经令人信服地展示了从单个 LGR5 ⁺ 干细胞产生类器官，以及 SW1222 细胞实现结直肠癌类器官形态特征的倾向²⁸。

在该方法论文中，我们提出了使用 SW1222 细胞评估和表征各种生物功能肽对细胞粘附和管腔形成影响的详细方案（图 3）。通过提供分步程序和成像分析方法，我们希望为类器官的生物制造和用于类器官培养的简单 SAP 基质的评估提供有价值的见解。

1. 缓冲液和溶液的制备

注:所有所述浓度均为最终浓度。

1. 添加终浓度分别为 10% 和 1% 的胎牛血清 （FBS） 和青霉素-链霉素，以制备完整的 Iscove 改良 Dulbecco 培养基 （IMDM）。在 4 °C 下避光储存长达 1 个月。
2. 将 MgCl₂ （3 mM）、蔗糖 （300 mM） 和 Triton X-100 （0.5%） 与磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 混合以制备透化缓冲液。将此溶液在 4 °C 下储存长达 2 个月。
3. 将牛血清白蛋白 （BSA， 1%）、甘氨酸 （0.3 M） 和 Tween-20 （0.1%） 混合在 PBS 中，制备封闭缓冲液。将此溶液在 4 °C 下储存长达 2 个月。
4. 在无菌条件下用超纯水稀释 10 倍至 2 倍 PBS。将此溶液在室温下储存 6 个月以上。
5. 在紫外线下消毒 3 mg 肽粉 30 分钟。加入 500 μL 超纯水，使用涡旋混合器溶解。
   注:最终浓度必须为目标浓度的两倍，即 6 mg/mL，因为 1x 浓度为 3 mg/mL。

2. 用肽中的 SW1222 制造结直肠癌类器官

1. 将等分试样在 4 °C 下解冻过夜，并将其保存在冰中，直到需要准备基底基质对照。
2. 在 24 孔板的每个孔的中心放置 10 μL 的 2x 肽溶液液滴。让板在室温下孵育 10 分钟。或者，在 6 孔板中每孔沉积 8-10 个液滴。
   注意:如果接种在无菌盖玻片上，则用于共聚焦和电子显微镜的样品更容易操作。
3. 加入 10 μL 的 2x PBS。使用吸头轻轻混合 PBS 溶液。让凝胶稳定至少 20 分钟，确保液滴几乎保持完整。
   注:添加 PBS 和温和混合的目的是保持液滴的完整性并避免将水凝胶扩散成一层。
4. 使用 0.125% 胰蛋白酶-EDTA 溶液 （5 mL） 分离 SW1222 细胞。将细胞与胰蛋白酶在 37 °C 下孵育 5-10 分钟，直到它们从培养瓶中分离。避免敲击培养瓶以避免细胞结块。
5. 加入 5 mL 完全培养基以灭活胰蛋白酶。使用 30 μm 细胞过滤器过滤细胞悬液。或者，使用带有 25 G 针头的注射器来破坏聚集体。
6. 制备 0.4 × 10⁶ 个细胞/mL 的细胞悬液，并使用 10 μL 微量移液器在每个肽滴中注入 2 μL 细胞悬液。
7. 将液滴在 37 °C、5% CO 2 下孵育 30 分钟_。 孵育后，向每个孔中加入 0.5 mL 补充培养基。
8. 等待期间，通过使用补充培养基将主要储备液（8-12 mg/mL，取决于批次）稀释至终浓度为 3 mg/mL 来制备基底膜基质对照。向该溶液中加入细胞（每 25 μL 800 个细胞）。
   注意:基底膜操作必须始终在冰上进行。在接触水凝胶之前，必须在冰冷的 PBS 中冲洗吸头。否则，吸头内部会发生聚合。
9. 在每个孔中接种 20 μL 基底膜溶液液滴。通过在 37 °C 下孵育 20 分钟，让液滴凝胶化。 材料凝胶化后，加入 0.5 mL 完全培养基。
10. 每 3-4 天更换一次培养基。最早在第 4 天观察细胞的组织和显示管腔形成的信号。
11. 在第 1 天、第 4 天和第 7 天对明场中的细胞进行成像，以评估类器官的生长。

3. 活力和增殖

1. 准备三个用于活力测定的黑孔板和三个用于增殖测定的黑孔板。每孔加入 25 μL 2x 肽溶液，并使用相同体积的 2x PBS 凝胶化。如上所述接种细胞。
2. 为每种肽水凝胶制剂准备三个孔，用作增殖板中的空白。不要在这些上面播种细胞。
3. 从活性孔板中取出培养基，用 1x PBS 洗涤 3 x 5 分钟。
4. 将哺乳动物细胞活力/细胞毒性试剂盒中的钙黄绿素-AM 和乙锭同源二聚体稀释至 8 μM（参见 材料表）到同一个避光锥形管中。要在避光锥形管中将 2 mL 该溶液制备到 2 mL PBS 中，请添加 4 μL 钙黄绿素-AM 储备液和 8 μL 乙锭同型二聚体-1 储备液。
5. 将步骤 3.4 中制备的钙黄绿素/乙锭同型二聚体溶液添加到 96 孔板中。每孔添加 100 μL。避光并在室温下孵育 30 分钟。
6. 用 1x PBS 洗涤 3 x 5 分钟。在荧光显微镜下使用 4 倍物镜时，至少要对三个视场（中心、上、下）进行成像，或者在荧光显微镜下使用 10 倍和 20 倍物镜时，至少对五个视场（中、左上、右上、左下、右下）进行成像。
7. 从增殖孔板中取出培养基，以确保最终体积为 90 μL。
8. 加入 10 μL Alamar Blue 溶液（参见 材料表）以达到 10% 的最终浓度。
9. 避光并在 37 °C、5% CO₂ 下孵育 2-4 小时
10. 使用孔板读数仪测量荧光 （Ex/Em = 530-560/590 nm/nm） 或吸光度 （570 nm）。平均为空白值获得的值，并从包含单元格的每个井的值中减去它们。
11. 通过对每个条件的信号求平均值并减去它们各自空白的平均值来计算增殖值。通过生成相对吸光度/荧光信号随时间的索引箱形图来创建图形。

4. 细胞对基质的粘附性测定

1. 在两个独立的 96 孔板中制备 100 μL 肽水凝胶。
2. 在每个孔中接种 20,000 个细胞，并加入 100 μL 培养基。将板在 37 °C、5% CO₂ 下孵育 90 分钟。
3. 孵育后，仅取一个板，并使用 P200 微量移液器小心重悬培养基 20-30 秒。小心不要让尖端远离凝胶，以免破坏水凝胶。或者，如果水凝胶机械性能允许（G' > 8,000 Pa），使用移动涡旋敲击孔板的四个侧面。
   注:重悬培养基（或用涡旋敲击孔板）将去除未附着的细胞和粘附在基质表面的脆弱细胞。细胞附着将在 90 分钟内发生，尽管这种附着的强度会根据特定的肽水凝胶及其粘合和结合特性而变化。众所周知，结直肠类器官的生长在刚度值低于 2,000 Pa 的基质中受到青睐。因此，由于该协议中呈现的水凝胶柔软易碎，因此我们特别注意使用温和的机械应力。
4. 从两个孔板中取出 100 μL 培养基，并用 1x PBS 加入洗涤一次。
5. 制备 1 μg/mL DAPI 溶液。向所有孔中加入 100 μL DAPI 溶液，并在室温下孵育 5 分钟。
6. 在荧光显微镜下对具有代表性的视野数进行成像。确保使用相同的物镜获取所有图像，以保持像素/距离比恒定。
   注意:10 倍物镜的 9 个视场或 20 倍物镜的 15 个视场。
7. 将荧光图像加载到图像分析软件（例如，ImageJ）上并分析所有图像上的颗粒。
   1. 从 "图像 "菜单中，选择 "类型 "，然后单击" 8 位"。
   2. 从 图像 菜单中，选择 调整 并单击 亮度/对比度。点击 Auto 按钮 | 应用。
   3. 从 图像 菜单，选择 调整 并单击 阈值.点击 Auto 按钮并关闭窗口。
   4. 从 Analyze 菜单中，单击 Analyze Particles。勾选选项 总结 并单击 OK。
   5. 在 Summary （摘要 ） 窗口中，将鼠标悬停在 File （文件 ） 菜单上，然后单击 Save （ 保存） 以保存摘要值。
8. 将所有图像的结果导出到标准统计软件。
9. 计算应力前后细胞覆盖的面积百分比。针对每个条件的面积百分比制作一个索引箱形图。

5. 肽水凝胶中类器官的免疫染色

1. 按照步骤 2.1-2.10 所述，将 800 个细胞接种在 20 μL 肽水凝胶液滴中 4 天。
2. 第 4 天，取出培养基并使用 1x PBS 洗涤每个孔 2 次。
3. 加入 400 μL 的 4% 甲醛溶液。在室温下将孔板孵育 30 分钟。
4. 用 P1000 去除甲醛溶液，并用 1x PBS 洗涤一次。
5. 加入 1 mL 透化缓冲液，并在室温下孵育 5 分钟。
6. 用 P1000 去除透化缓冲液，并用 1x PBS 洗涤一次。
7. 加入 0.5 mL 封闭缓冲液，并在室温下孵育 30 分钟。
8. 用 P1000 去除封闭缓冲液并用 1x PBS 洗涤。
9. 根据制造商的说明，在封闭缓冲液中稀释一抗（参见 材料表）。向两个孔中加入 200 μL。
10. 在 4 °C 下孵育过夜。
11. 用 P200 去除染色溶液，并用 1x PBS 洗涤一次。
12. 根据制造商的说明，在封闭缓冲液中稀释二抗（参见 材料表）。在二抗溶液中以 1:40 的比例添加鬼笔环肽偶联物。
13. 避光并在室温下孵育不超过 3 小时。用 P200 去除染色溶液，并用 1x PBS 洗涤一次。
14. 在封闭缓冲液中制备 1 μg/mL 的 DAPI 溶液。向每个孔中加入 300 μL DAPI 溶液。
15. 避光并在室温下孵育 5 分钟。
16. 用 P200 去除染色溶液，并用 1x PBS 洗涤一次。
17. 避光并在 4 °C 下储存长达 7 天。

6. 基质中类器官的成像和图像分析

1. 使用 10 倍落射荧光显微镜对染色样品进行成像。仅使用鬼笔环肽和 DAPI 通道。
2. 打开 Cellopose 软件并按 ctrl + L 加载图像。由于软件可以访问所选图像位置中的所有文件，因此请确保将所有荧光图像保存在确切位置，而没有任何子文件夹。
3. 在 Segmentation （分割） 面板中键入菌落的平均直径，然后单击 ENTER。
4. 为结肠类器官选择自定义模型，然后单击 Run Model 按钮。
   注意:在这里，我们建议在 Cellpose2.0^29,30 中使用两个从头开始的模型
5. 按 ctrl + s 将蒙版另存为 .npy 文件。
6. 使用键盘箭头在文件夹的图像之间移动，并在文件夹中的所有图像上运行冒号类器官模型。
7. 复制文件夹并使用结肠类器官腔的模型重复步骤 6.2-6.6。
8. 打开 ImageJ 并单击 插件 |宏 |跑。。。 运行 Cellpose Github 站点提供的 imagej_roi_converter.py 文件并等待窗口出现。
9. 从冒号类器官文件夹中选择 第一个文件 ，然后单击 Open（ 打开）。
10. 选择与第一个文件对应的 seg.npy 文件，然后单击 Open。
    注意:ImageJ 会将掩码转换为感兴趣的区域，并将它们与相应的荧光图像重叠。
11. 单击 ROI Manager 窗口中的 Select All，然后单击 Measure。
12. 单击 File （文件） |另存为... 并保存结果。
    注意:这将生成一个 .csv 文件，其中包含字段中每个菌落的所有形状属性。
13. 对结肠类器官腔文件夹中的相同图像重复步骤 6.8-6.12。
14. 加载 OriginPro 并按 ctrl + 3 打开 导入向导。单击三个 点按钮 ，然后选择与同一图像的类器官和管腔形状属性对应的.csv文件。
15. 将管腔形状属性的结果复制并粘贴到菌落结果旁边的一列中，以确保每个管腔测量值都与其各自的菌落配对。
16. 在新列中，划分管腔和菌落的区域，以得出其包含菌落的相对管腔面积。
17. 选择与每个菌落的圆度和管腔面积相对应的列。点击 Plot |基本 2D |分散。
18. 右键单击绘图窗口，然后选择 Plot details。单击 Centroid（PRO） 选项卡 并勾选显示 子集的质心点、连接到数据点和 显示椭圆的选项。

首先，我们使用明场成像评估了在 24 孔板中生长 7 天的细胞。我们确定了在一周内组装成类器官的小细胞簇，如图 4 所示。受控扫描方法可以跟踪细胞和类器官在不同日期之间的活动。一般来说，我们观察了整周细胞形态的演变。SW1222 衍生的类器官应具有圆形形态和浅色外观。较暗的外观表明不希望的细胞密度较高，如在 Peptide P 中培养的一些菌落第 7 天所见（图 4）。

图 5 显示了细胞活力（图 5A）和增殖测定（图 5B）的结果，它们分别指向死细胞和活细胞的数量以及代谢活性。在这里，我们使用了基于钙黄绿素和乙锭同型二聚体的活力测定，并注意到这些细胞在 Matrigel 中培养时，到第 7 天时显示出少量死细胞群。这种现象也存在于所有基于肽的水凝胶中，但不存在于 2D 培养物中。增殖结果显示第 1 天和第 7 天之间代谢活动总增加。此外，我们发现在第 4 天和第 7 天之间，几种情况的活性略有下降。这一观察结果与活力测定中观察到的死细胞群的增加相关 （图 5A）。

为了初步评估细胞之间的相互作用和肽水凝胶的生物功能化，我们进行了基于机械应力的粘附测定以诱导细胞分离。如图 6 所示，使用不同浓度的生物功能肽 P2 显着影响了分离过程前后保留的细胞数量。在这里，我们使用了一种仅包含肽 P2 生物功能基序的肽作为阳性对照。我们还使用非生物功能肽 P 作为阴性对照。从图中可以看出，接种在肽 P 中的细胞具有相对较低的初始粘附和较低的保留值。此外，生物功能肽 P2 比率的变化与应激后保留的细胞量相关。因此，使用该测定法，我们可以得出结论，P2 肽影响细胞粘附，该粘附可能由也可能不由生物功能基序驱动，但与混合物中存在的生物功能肽的量相关。

然后，我们研究了基质在制造的类器官中的影响。我们通过对培养 4 天的细胞骨架染色样品进行形状分析，评估了菌落的圆度和管腔相对于菌落大小的相对大小。数据点沿 x 轴和 y 轴具有特定的分布，并且每个条件都有一个质心，该质心具有圆度和相对管腔面积的特定值。 图 7 显示，在 2D 中培养的细胞在集落圆度方面具有非常大的变化。相比之下，在 Matrigel 中培养的细胞在管腔的相对大小方面具有更广泛的分布。

有趣的是，所有含肽的水凝胶的质心值都具有非常相似的位置。然而，数据点之间的距离显示出不同的分布曲线。例如，P3 肽在三种肽水凝胶中的分布较小，而来自非生物功能肽 P 的数据点似乎分布较大。这些数据表明，具有 P1 和 P3 的水凝胶都有可能针对类器官培养进行优化。

最后，我们使用免疫细胞化学对根尖标志物 ZO-1 和 ezrin 染色的样品评估了特异性标志物的表达。这些标记物允许评估每个类器官内细胞的极化。我们还评估了泛钙粘蛋白标志物以可视化细胞间连接和细胞骨架特异性标志物 （鬼笔环肽） 以可视化管腔。 图 8A 显示了第 4 天和第 7 天在非生物功能肽 P、生物功能化肽 P1 和 Matrigel 中发现的类器官。ZO-1 和 ezrin 标志物应位于类器官的顶端和基底外侧膜内;适当的细胞极化将使我们能够在第 4 天观察到两种分子在管腔区域附近的表达，否则是不可见的。事实上，如图 8 所示，ZO-1 和 ezrin 标志物位于在 Matrigel 中培养的类器官的顶膜中。有趣的是，ezrin 标志物在非生物功能肽 P 中几乎不可见。由此，我们推断细胞的低效极化导致这些分子在肽 P 中的低表达。

此外，细胞核在肽水凝胶中的分散往往是不规则的，而嵌入 Matrigel 中的类器官形成一个单一的、不对称的细胞核层。此描述与结直肠类器官的理想形态相匹配;然而，尽管肽水凝胶中细胞核的方向并非完全不对称，但主要在非生物功能肽 P 中发现了具有多层细胞核的致密菌落。相比之下，细胞间连接必须垂直于顶端和基底外侧膜定位（图 8B）。该标记使我们能够观察位于集落内的所有细胞的边缘。当在 Matrigel 中生长时，细胞到第 7 天具有几乎完美的泛钙粘蛋白（细胞间连接）径向分布。相比之下，非极化菌落，例如肽 P 中的菌落，表现出细胞的无序排列，以及基底膜和顶膜附近细胞间连接的表达。

图 1:形成纳米纤维的超短自组装肽。（A） 脂肪族超短肽的自组装过程的描述。（B） 用 IKVAV 配体生物功能化的超短 SAP IIFK 的化学结构。该图是从 Loo 等人 4 修改而来的。请单击此处查看此图的较大版本。

图 2:肽的结构和性质。 （A） 说明了母肽 IIFK 和生物功能肽 P2 的化学结构。（B） 倒置样品瓶测试结果揭示了临界凝胶浓度和凝胶时间差异。P2 形成半透明凝胶，其 CGC 高于母肽 IIFK。值得注意的是，与单独的任一肽相比，IIFK:P2 （1:1） 混合物表现出更高的 CGC 和更长的凝胶化时间。（C） 扫描电子显微照片提供了对 IIFK、P2 和 IIFK:P2 （1:1） 混合物结构特征的直观了解。（D） 原子力显微镜高度形貌图像描绘了浓度为 8 mM 的凝胶化肽，提供了其表面特征的详细视图。（E） 圆二色谱光谱揭示了不同浓度下 IIFK:P2 混合物的构象变化，揭示了它们的二级结构变化。（F） 流变学分析测量不同浓度下凝胶化肽的刚度，为了解其机械性能提供有价值的见解。该图转载自 Perez-Pedroza 等人25。比例尺 = 1 μm （C），200 nm （D）。缩写:CGC = 临界凝胶浓度。 请单击此处查看此图的较大版本。

图 3:描绘了用于类器官制造的肽制备和细胞接种的图表，并通过肽水凝胶中的活力、粘附、类器官形成能力和免疫染色进行表征。请单击此处查看此图的较大版本。

图 4:与基质胶对照相比，从标记为 P 和 P1 的肽水凝胶中培养的 SW1222 细胞捕获的明场显微镜图像。 有趣的是，在肽水凝胶中培养的类器官在第 7 天表现出主要的球形形态。相比之下，与 SAP 中类器官培养物的深色体（黑色箭头）相比，位于基质胶中的细胞似乎表现出较低的细胞密度，这可以从它们明亮的身体中看出。然而，它们在相邻菌落之间表现出明显的聚集。此外，很明显，Matrigel 环境中细胞的迁移能力相对降低。比例尺 = 650 μm。 请点击此处查看此图的较大版本。

图 5:不同浓度的生物功能化 SAP 中 SW1222 细胞的活力和增殖测定。 （A） 与基质胶和 2D 相比，在生物功能肽 P1 和 P2 中培养的细胞的活力评估。（B） 与基质胶和 2D 对照相比，非生物功能肽 P1 和生物功能肽 P2 中细胞培养物的增殖评估。在这里，我们看到类似于在 Matrigel 中生长的细胞在活/死测定中的行为。在几种情况下发现死细胞（黄色箭头）略有增加，主要是 Matrigel。对于增殖，趋势因肽的类型和浓度而异，但通常呈积极趋势。比例尺 = 250 μm。该图改编自 Perez-Pedroza 等人25。 请单击此处查看此图的较大版本。

图 6:肽对分离细胞数量的影响。 （A） 机械应力前后用 DAPI 染色的细胞的荧光图像。在这里，我们使用肽 P、修饰的肽 P2 和 IKVAV 基序。（B） 通过在 ImageJ 中测量覆盖面积来确定细胞粘附的变化。比较分析显示，与非生物功能肽 P 相比，生物功能化肽 P2 具有更高的保留容量。比例尺 = 100 μm。该图改编自 Perez-Pedroxa 等人25。 请单击此处查看此图的较大版本。

图 7:通过质心计算管腔相对面积与圆度来评估类器官形成能力。 数据的质心和离散度因处理而异。正如预期的那样，表现最差的条件是 2D 测量的情况，它在圆度值的广泛范围内扩展，并且具有最低的管腔相对面积。Matrigel 不仅具有最高的圆度，而且具有最大的管腔。肽条件在两个值中略有不同，但 P3 条件的数据变化可以忽略不计。 请单击此处查看此图的较大版本。

图 8:第 4 天和第 7 天各种标志物的类器官的共聚焦显微镜图像。 （A） ZO-1（绿色）、ezrin（红色）和 DAPI（蓝色）标志物用于查找类器官内细胞的顶端分布。如 Matrigel 对照所示，这些分子通常位于顶端和基底外侧膜中。非生物功能肽 P 仅在第 7 天显示这些分子的表达。（B） 用泛钙粘蛋白（绿色）抗体染色的细胞间连接标志物应垂直于类器官的基底外侧和顶端膜。细胞核（蓝色）和细胞骨架（红色）用作复染。非生物功能肽 P 诱导基底外侧膜中的细胞间连接表达，与其他两种处理 （P3 和 Matrigel） 相反。比例尺 = 100 μm。 请点击此处查看此图的较大版本。

作者没有需要声明的利益冲突。