En direct l'imagerie du cerveau de poisson zèbre embryonnaires par microscopie confocale

Cette procédure commence par l’injection d’un embryon de poisson zèbre unicellulaire positionné dans un moule d’injection de sorte que la cellule soit orientée face à l’extérieur de l’appareil d’injection. Les embryons sont ensuite injectés avec du ARNm, l’aiguille traversant le jaune et pénétrant dans la cellule. Le lendemain.

Une glissière de montage en plastique est remplie d’aros. Un embryon anesthésié est ensuite placé inversé dans un trou de l’aros en imagerie par microscopie confocale. Bonjour, je suis Grabham du laboratoire du Dr Hazel Sieve à l’Institut Whitehead de recherche biomédicale et au département de biologie du MIT.

Aujourd’hui, nous allons vous présenter une procédure pour injecter des embryons de poisson-zèbre au stade unicellulaire et l’imagerie en réel du cerveau par microscopie confocale qui suit. Dans notre laboratoire, nous utilisons cette procédure pour étudier la morphogenèse du cerveau des vertébrés à résolution unicellulaire. Alors, commençons.

L’ARNm utilisé dans cette procédure est transcrit à partir d’un plasmide codant C-A-X-E-G-F-P-R-N-A-A lié à la membrane GFP : d’abord linéariser le plasmide par digestion avec un seul exemplaire, puis transcrire l’ARNm de GFP membranaire à partir du plasmide linéarisé à l’aide du message M et du kit machine après la transcription de l’ARNm, en quantifiant ainsi l’ARNm et l’eau résultants à un microgramme par microlitre, Eloqua, et conserver à moins 80 degrés Celsius jusqu’à ce que ce soit nécessaire. La veille de l’injection, installez des cages d’accouplement, séparant les mâles des femelles le jour de l’injection. Utilisez un instrument de réglage pour micropipet polaire pour tirer des aiguilles capillaires pour l’injection.

Préparez un moule d’injection de 1 % d’AGA avec des filets de la largeur des embryons au stade unicellulaire le jour de l’injection, puis décongelez une aliquote d’ARNm de GFP membranaire à une concentration d’un microgramme par microlitre sur de la glace. Diluez l’ARNm d’un à cinq dans de l’eau jusqu’à une concentration finale de 200 nanogrammes par microlitre et maintenez-le sur glace. Chargez l’aiguille capillaire d’un microlitre de membrane préparée, ARNm GFP, à 200 nanogrammes par microlitre.

Ici, nous ajoutons 0,05 % de rouge de phénol à l’ARNm pour le rendre visible lors des injections. Placez l’aiguille chargée dans un micro-manipulateur relié à un micro-injecteur à gaz. Ajustez le volume d’injection à un nanolitre.

Ensuite, retirez les séparateurs des poissons sauvages installés dans les cages de reproduction depuis la veille. Prélève les embryons dès qu’ils sont pondus. Remplissez le moule d’injection de rose AGA avec un milieu embryonnaire et orientez les embryons dans le moule avec une seule cellule sur le côté, à l’opposé du micro-manipulateur.

Injectez à travers le corion et les jaunes de sorte que l’ARNm soit déposé directement dans la cellule unique. Injectez environ 50 embryons par expérience. Cependant, si la cellule s’est divisée, il ne faut pas injecter après l’injection des embryons, les incuber à 28 degrés Celsius toute la nuit dans un milieu embryonnaire.

Après l’incubation nocturne, les embryons injectés sont prêts à être montés et à l’imagerie. Pour commencer cette procédure, retirez le corion des embryons à l’aide d’une pince sous un stéréoscope une heure avant le moment d’intérêt, préparez une lame pour monter jusqu’à quatre embryons. Ensuite, remplissez la lame avec 0,7 % d’aros juste jusqu’en haut et attendez environ 20 minutes ou jusqu’à ce que l’aros se solidifie.

Une fois l’aros solidifié, on réalise un petit trou dans les aéros à l’aide d’une pointe de pipette de 200 microlitres pour former des trous cylindriques dans lesquels monter chaque embryon. Retirez les bouchons aros avec des pinces avant de les monter. Placez les embryons sur la lame remplie d’aéros sous un microscope disséquant.

Ajoutez 50 microlitres de trica à l’anesthésie. Les embryons. Utilisez des pinces pour orienter les embryons inversés dans les trous cylindriques de l’aros, avec le cerveau ou la région d’intérêt contre le couvercle sous-jacent et le couvercle.

Les embryons de l’AGA ont monté avec une autre couvercle et les fixent avec de la graisse sous vide en silicone. Les embryons sont maintenant prêts pour l’imagerie. Imagez l’embryon à l’aide d’un microscope confocal laser à balayage fluorescent inversé comme illustré ici, ou à l’image d’un microscope confocal à disque tournant à 63 x ou plus pour collecter des images à haute résolution de cellules individuelles dans l’épithélium neuro.

Les images sont exportées sous forme de fichiers TIF depuis le logiciel LSM et analysées à l’aide de Photoshop. Voici une image confocale représentative d’un embryon de poisson-zèbre actif 24 heures, épithélium neurologique entre le mésencéphale et les ventricules du cerveau postérieur. M indique le mésencéphale, le ventricule, et H le ventricule postérieur de la cervéphale.

Chaque cellule est marquée avec du GFPE lié à une membrane. Nous venons de démontrer une technique qui permet d’analyser le cerveau en développement du poisson-zèbre comme une résolution unicellulaire. Cette technique nous a permis d’étudier un nouveau type de changement de forme cellulaire appelé constriction basale BA.

Il pourrait également être utilisé pour analyser d’autres types de phénomènes et élargir considérablement notre compréhension de l’organogenèse des vertèbres, ainsi que de sa biologie cellulaire sous-jacente. Voilà. Merci de m’avoir regardé et bonne chance pour vos expériences.