Name: 根据流量的血小板粘附和聚集，使用微流控流细胞 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-10-27T07:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 10 s
Description: 学习使用微流控流式细胞技术进行血小板粘附和聚集实验，在生理剪切流条件下模拟体内环境。该方法结合BioFlux系统实现高通量分析，为血管生物学研究和药物筛选提供可靠的定量数据。

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第1部分：BioFlux板微流控通道的制备。
<ol>
<li>在运行流体通道实验之前，需要使用目标蛋白对微流控通道进行包被。本实验中将使用 I 型胶原蛋白。每个通道均有一个入口孔和一个出口孔。对于该微流控板，通道的左侧孔为入口孔，右侧孔为出口孔。</li>
<li>将 I 型胶原蛋白（5 mg/ml 原液）用 0.02 M 乙酸稀释至 200 μg/ml 的浓度。每条通道需使用 20 μl。使用移液器枪头轻轻吹打混匀。</li>
<li>向每条待用通道中加入 20 μl 包被液。必须使用移液器将液体加入目标微流控通道对应的出口孔内侧穿孔中。避免引入气泡，不要将移液器中的空气完全排出。另设一条不加胶原蛋白的通道作为无胶原蛋白对照（用于黏附和聚集的阴性对照）。</li>
<li>先用手拧紧接口上的 4 个螺丝，待全部初步固定后，使用扭矩扳手完全拧紧。当扭矩扳手达到最大紧固程度时会发出“咔哒”声提示。</li>
<li>在 BioFlux 软件的手动模式下，从出口孔开始以 2 dyn/cm2 的剪切力对目标通道进行灌注。此时需观察相对应的入口孔内侧穿孔是否被液体充满，此过程需数分钟。可通过显微镜低倍物镜（4X）观察入口孔，或手持微流控板从底部观察入口孔。应首先看到一滴微小液体缓慢填充内侧穿孔。一旦入口内侧穿孔被完全充满，立即在软件中点击“停止”以终止灌注。</li>
<li>将微流控板在室温下孵育 1 小时。</li>
<li>移除接口，在出口孔中加入 1 ml PBS（含 Ca2+/Mg2+）。从出口孔开始以 2 dyn/cm2 进行灌注，持续 10 分钟。停止灌注并移除接口。</li>
<li>从入口和出口孔中移除多余的 PBS——切勿移除填充在内侧穿孔中的液体。使用封闭液（含 0.5% v/v BSA 的 PBS（含 Ca2+/Mg2+））对通道进行封闭。向每个待用的出口孔中加入 1 ml 封闭液，并从出口孔以 2 dyn/cm2 进行灌注，持续 10 分钟。停止灌注并移除接口。完成上述步骤的通道可在当天内使用。</li>
<li>在加入血液前，移除通道两侧孔中的液体，但保留内侧穿孔中的液体。</li>
</ol>
 第2部分. 使用GPIIb/IIIa抑制性抗体处理血液。
<ol>
<li>在胶原蛋白于通道中孵育的同时，需准备全血。处理人血时，应遵守所在机构规定的生物安全规范。</li>
<li>应使用采集后3小时内、以柠檬酸钠抗凝剂采集的健康空腹个体新鲜人血。</li>
<li>通过加入4μM钙黄绿素AM（calcein AM）来制备血液。将钙黄绿素AM用DMSO配制成4mM的储存液，并按1/1000（v/v）的比例加入血液中，轻轻颠倒混匀。</li>
<li>将标记了钙黄绿素AM的血液每管1 ml分装至10个1.5 ml微量离心管中。按所需稀释比例向每管加入GPIIb/IIIa抑制性抗体（IgG的分子量约为150 kDa）。示例稀释梯度为从1200 nM至9 nM，并包括无抗体对照组和无关抗体对照组。理想的抑制阳性对照是利利亚公司（Eli Lilly）生产的ReoPro（abciximab），使用浓度为20 μg/ml。 轻轻颠倒混匀。</li>
<li>室温孵育1小时，每10分钟轻轻颠倒混匀一次。</li>
</ol>
 第3部分：在BF1000工作站上运行流体池实验。
<ol>
<li>首先，必须在 BioFlux 控制模块中设置一个自动化程序。对于 I 型胶原，应设置一个从出口孔开始施加 10dyn/cm2 剪切力并持续 10 分钟的程序。此时，还应使用 BF1000 工作站设置数据采集参数，包括通道位置、FITC 波长下的图像采集以及时间间隔信息。建议在总共 10 分钟的时间内，每 30 秒使用 10 倍物镜对每个通道的 3 个视野进行一次图像采集。</li>
<li>迅速操作，将每种条件下的 500 µL 预备血液分别加入不同的预备通道中。将未加抗体的对照血液加入一个涂有 I 型胶原的通道和一个仅封闭的通道中。</li>
<li>将接口放置在微流控板上。</li>
<li>将微流控板放置在 BF1000 工作站显微镜上，并将接口夹紧固定。</li>
<li>执行微流控板加载调整。同时，移动载物台至含有血液的某一孔位，设置 FITC 图像采集参数（如曝光时间、增益等）。</li>
<li>在 BioFlux 蒙太奇软件中启动采集，以同时开始流体剪切和图像采集。</li>
<li>从 BF1000 工作站上取下微流控板，并根据机构规定处理废弃微流控板。</li>
</ol>
第4部分：代表性结果。
本文介绍了在微流控通道中进行血小板黏附和聚集的实验方案。该方案还包括使用血小板聚集抑制剂抗GPIIb/IIIa进行处理。利用BioFlux系统中包被了胶原的微流控通道，预期在未经处理的对照血液样本中随时间推移出现明显的血栓形成，而在未包被的通道中则无血栓形成。在最近一次实验中，对照条件下血小板聚集体的平均面积为2000μm2。 图1. <img src="/files/ftp_upload/1644/1644fig1.jpg" alt="静态平衡；热成像；热量分布分析；示意图；材料研究。" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图1">
活化的GPIIb/IIIa是介导血小板-血小板相互作用及血栓稳定的关键因子1。与胶原结合可激活GPIIb/IIIa复合物，从而引发这一反应2。在施加剪切力前，预先与抗GPIIb/IIIa抗体孵育1小时，应可观察到血栓体积减小以及血栓形成频率降低。在10 dyn/cm2条件下通常可观察到剂量依赖性反应。 图2. <img src="/files/ftp_upload/1644/1644fig2.jpg" alt="剂量-反应曲线；EC50值，对数刻度，抑制百分比，科学分析图" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 2"> 该抑制剂在10 dyn/cm2条件下的IC50值为17 nM。与无抗体对照相比，该供体在10 dyn/cm2条件下的最大抑制率为11%。
尽管本实验方法采用了特定的细胞外基质蛋白和特定的血小板聚集抑制剂，但该方案可扩展应用于其他包被物质、其他细胞类型以及其他细胞黏附实验中的抑制剂。此类实验成功的关键因素包括：避免微流控通道中产生气泡，使用正确的稀释液对所有试剂进行准确稀释，以及为所有试剂提供适当的孵育条件。

<ol><li>Jackson, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+growing+complexity+of+platelet+aggregation%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">The growing complexity of platelet aggregation.</a> Blood. 109, 5087-5095 (2007).</li>
<li>Nakamura, T., Kambayashi, J., Okuma, M., Tandon, N. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+the+GP+IIb-IIIa+complex+induced+by+platelet+adhesion+to+collagen+is+mediated+by+both+alpha2beta1+integrin+and+GP%5BTitle%5D)+AND+%22VI.+J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Activation of the GP IIb-IIIa complex induced by platelet adhesion to collagen is mediated by both alpha2beta1 integrin and GP.</a> VI. J Biol Chem. 274, 11897-11903 (1999).</li>
</ol>

贡献作者为 Fluxion Biosciences 公司的员工。

尽管本实验方法使用了特定的细胞外基质蛋白和特定的血小板聚集抑制剂进行演示，但该方案可扩展应用于其他包被物质、其他细胞类型以及其他用于细胞黏附实验的抑制剂。此类实验成功的关键因素包括：避免微流控通道中产生气泡，使用正确的稀释液对所有试剂进行准确稀释，以及为所有试剂提供适当的孵育条件。

<table><tbody><tr><td>牛I型胶原蛋白</td><td>试剂</td><td>Invitrogen</td><td>A1064401</td><td>可使用其他来源的I型胶原蛋白</td></tr><tr><td>含Ca/Mg的PBS</td><td>试剂</td><td>Invitrogen</td><td>14040-117</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白（BSA）</td><td>试剂</td><td>EMD Millipore</td><td>EM-2930 Bottom of Form</td><td>可从VWR购买</td></tr><tr><td>钙黄绿素AM</td><td>试剂</td><td>Invitrogen</td><td>C1430</td><td>也可使用BD公司的钙黄绿素AM</td></tr><tr><td>BioFlux 1000系统</td><td>试剂</td><td>Fluxion Biosciences</td><td>联系公司</td><td></td></tr><tr><td>BioFlux板</td><td>试剂</td><td>Fluxion Biosciences</td><td>900013</td><td></td></tr><tr><td>抗GPIIb/IIIa抗体</td><td>试剂</td><td>Abcam</td><td>ab33407</td><td>另一个货号为ab15021</td></tr><tr><td>ReoPro</td><td>试剂</td><td>Eli Lilly</td><td></td><td>凭处方供应</td></tr></tbody></table>

基于微流控流动小室的血小板黏附与聚集流动实验

Platelet Adhesion and Aggregation Under Flow using Microfluidic Flow Cells

血小板聚集是在血管损伤后内皮下细胞外基质暴露所引发的生理反应。血小板黏附级联过程发生在剪切流存在的条件下，而传统的静态孔板检测方法无法模拟这一关键因素。本文介绍一种利用微流控孔板平台模拟生理剪切流条件的血小板聚集检测方法。通过气动泵主动灌注，将细胞外基质蛋白（如I型胶原或血管性血友病因子）沉积于微流控通道内。随后用缓冲液洗涤并封闭基质蛋白，以准备通道用于血小板相互作用。将经荧光染料标记的全血以不同流速灌注通过通道，以诱导血小板活化与聚集。在流体实验前可加入血小板聚集抑制剂，以生成IC50剂量反应数据。

关键词：血小板聚集，微流控，剪切流，I型胶原，血管性血友病因子，全血，IC50，流体实验

血小板黏附级联反应发生在剪切流存在的条件下，而传统的（静态）孔板检测方法并未考虑这一因素。本文报道了一种利用微流控孔板形式模拟生理剪切流条件的血小板聚集检测方法。

血小板聚集是对血管损伤的响应，此时内皮下暴露了细胞外基质。血小板黏附……

bio flux 系统是一种自动化仪器和微流控装置，可在受控的切向流条件下进行活细胞检测。该系统采用微孔板微流控技术，将微米级流体细胞装置集成到符合 SBS 标准的微孔板中。BioFlex 可用于开展高通量、低血量的血小板黏附与聚集研究。加入荧光染料标记的全血至孔中，然后流经通道。在受控的剪切流条件下，获取高分辨率显微镜数据，用于量化药物化合物及其他不同参数存在下的血小板黏附与聚集情况。大家好，我是来自Flexion Biosciences公司研发实验室的Mike Schwartz。今天我们将向您展示一种在血小板黏附实验中使用微流控流动池的方法。我们在实验室中使用该方案进行多种血管生物学实验。现在让我们开始吧。在运行流体通道实验之前，必须对BioFlux板的微流控通道进行预处理，使其包被上所需的蛋白质，本实验将使用I型胶原蛋白。BioFlux板的24个实验通道各自连接一个入口孔和一个出口孔，其中入口孔位于通道左侧，用于向通道供液，出口孔位于右侧。将I型胶原蛋白储备液稀释至浓度为200微克/毫升。在 0.02 摩尔的乙酸中，每个使用的通道需要 20 微升。由于本实验需要 11 个通道，因此配制 200 微升的胶原蛋白包被液。一个通道保持未包被状态，用微量移液器枪头轻轻吹打混匀。使用微量移液器将20微升包被液加入各自通道中，将液体注入孔的内 punch 处。如图中黄色染料所示，向目标微流控通道进样，包括一个不含胶原蛋白的通道，作为血小板黏附和聚集的阴性对照。在所有相应通道中加入胶原蛋白包被液后，将接口连接至培养板。如果使用的是 bio flux 1000 接口，可将两个锁扣固定在载物台上。如果使用的是 Bio flux 200 接口，则先用手指拧紧四个螺丝，待全部就位后，再使用扭矩扳手将其完全拧紧。当扭矩驱动器达到最大值时会发出咔嗒声。在Bio Flux软件的手动模式下，从出口处以每平方厘米2D的流速对目标通道施加灌注。我们将使用显微镜上的低倍物镜找到入口孔，并观察相对的内冲孔被液体填充的过程。几分钟后，应首先看到一滴微小的液体缓慢填充内冲头，当进样口内冲头充满时，通过软件点击“停止”来终止所有通道的灌注。将微孔板在室温下孵育一小时。在此孵育期间，可在一小时孵育结束前开始准备全血。血液制备完成后，移除界面，并向出口端加入一毫升含钙和镁离子的磷酸盐缓冲液（PBS）。从出口端开始灌注，灌注流速为每平方厘米每分钟两滴，持续灌注10分钟。10分钟后，停止灌注。移除界面后，将入口端和出口端中多余的PBS去除。切勿移除充满内冲头的液体。为阻断通道，向每个出口加入1毫升阻断溶液。从出口孔以每平方厘米2达因的流速灌注待用孔，并持续灌注10分钟。10分钟后停止灌注并移除接口。此时通道已准备就绪，可在对培养板进行胶原包被的同时于当天使用。在1小时孵育期间，应采集空腹个体的新鲜人血，用于后续成像及上板运行。血液应采集至含柠檬酸钠抗凝剂的容器中，并在采集后三小时内使用。首先，将二甲基亚砜（DMSO）中浓度为4毫摩尔的钙储备液按1:1000（体积比）加入血液中，通过轻柔颠倒混匀，得到终浓度为4微摩尔的钙溶液。接下来，将一毫升钙黄绿素标记的血液分装到十个1.5毫升的微量离心管中。按照所需稀释比例，向每根离心管中加入GP2B3A抑制剂抗体。务必设置无抗体阴性对照，并加入无关抗体作为阳性对照，通过轻柔颠倒混匀。在进行流室实验前，将试管于室温孵育一小时，每10分钟轻轻翻转混匀一次。应在Bio Flux控制模块中为Collagen.One设置一个自动化程序，建立一个从出口以10 dyn/cm²的剪切应力运行血液10分钟的实验方案。使用 BioFlex 1000 工作站时，应设置数据采集参数，包括在 fitz 波长下所需的载物台位置采集以及延时成像设置。本方案典型的图像采集计划为：每个通道使用 10 倍物镜，每 30 秒采集一个视野，持续总时长为 10 分钟。也可根据需要选择额外的视野或不同的延时成像设置。在设置好自动程序和数据采集参数后，返回 BioFlex 培养板，除去通道两侧的液体，仅保留内孔部分。注意操作需迅速，将每种条件下的血液各 500 µL 加入各通道的输出孔中。请注意，此处使用输出孔来加入血液，是因为该路径到达观察区域的距离最短，可使血液对胶原涂层产生更迅速的反应。此外，将未加抗体的对照血液分别加入涂有胶原蛋白的通道和仅进行封闭的通道中。将培养板置于 BioFlex 1000 工作站显微镜上，并固定接口。通过定位定义为原点的第一个校准点，执行载物台列表校准。然后定位并标记第二个校准点。将此校准应用于相应的载物台列表中。这可确保培养板上的所有观察位置能够被自动找到。移动载物台至含有血液的一个通道，使用 BioFlex 镶嵌软件设置图像采集参数，例如曝光时间和增益。通过点击相应按钮启动适当的流程，这将同时开始流式程序和图像采集。实验结束后，将微流控板从BIOFLU 1000工作站中取出，并根据机构规定进行处理。使用生物流控系统中经胶原蛋白包被的微流控通道时，未经处理的对照血液样本会随时间推移出现明显的血栓形成。相比之下，未包被的通道中未观察到血栓形成。在最近进行的一项实验中，对照条件下聚集体的平均面积为 2000 平方微米。GP IIb/IIIa 在血小板与血小板相互作用及聚集稳定中起关键作用，当血小板通过黏附于胶原被激活后，GP IIb/IIIa 发挥效应；如本实验所示，在剪切暴露前经抗 GP IIb/IIIa 抗体孵育一小时后，可观察到血栓体积减小，同时血栓形成频率也降低。通常在10 dyn/cm²下可观察到剂量依赖性反应，该特异性抑制剂的IC50值为17 nmol。与无抗体对照相比，该供体在10 dyn/cm²下的最大抑制率为11%。此外，还可使用48孔高剪切力板进行全血实验，最高剪切力可达200 dyn/cm²或5,000 s⁻¹。我们刚刚向您展示了如何利用微流控流动通道进行具有生理相关性的血管生物学实验。在执行本方案时，重要的是要记住使用正确的缓冲液稀释胶原蛋白。务必采用正确的移液技术，以避免引入气泡，并始终遵守您所在实验室的生物安全规定。以上就是全部内容。感谢观看，祝您的实验顺利成功。

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根据流量的血小板粘附和聚集，使用微流控流细胞

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