根据流量的血小板粘附和聚集，使用微流控流细胞
October 27th, 2009
血小板粘附级联剪切流的存在，这个因素不占在常规（静态）以及板的检测。本文报道利用一个微井板格式，模拟生理剪切流条件的检测血小板聚集。
生物通量系统是一种自动化仪器和微流体设备，用于在受控的剪切流下运行活细胞检测。该系统使用孔板微流控技术将微米级流动池装置集成到 SBS 标准孔板中。BioFlex 可用于进行血小板粘附和聚集研究，具有高通量和减少血容量。
将用荧光染料标记的全血添加到孔中，然后流经通道。在受控的透明流下，产生高分辨率的显微镜数据，该数据量化了存在药物化合物和其他变化参数下的血小板粘附和聚集。大家好，我是来自 Flexion Biosciences 研发实验室的 Mike Schwartz。
今天，我们将向您展示在血小板粘附测定中使用微流体流动池的程序。我们在实验室中使用此方案进行各种血管生物学分析。那么让我们开始吧。
牛肉，在运行流动池实验之前，生物助焊板的微流体通道必须制备感兴趣的蛋白质涂层，本实验将使用 1 号胶原蛋白。生物通量板的 24 个实验通道中的每一个都连接到该板的入口孔和出口孔。入口井是左侧的井，进料通道，出口井在右侧，将胶原蛋白稀释至每毫升 200 微克的浓度。
在 0.02 摩尔乙酸中，使用的每个通道需要 20 微升。由于本实验需要 11 个通道，因此制作 200 微升胶原蛋白涂层。一个通道保持未涂层，通过用微量移液器吸头轻轻迭代混合。
使用微量移液器将液体分配到孔的内孔中，向每个相应的通道中加入 20 微升涂层。如此处所示，用黄色染料喂养感兴趣的微流体通道包括一个不含胶原蛋白的通道，作为血小板粘附和聚集的阴性对照。将胶原蛋白涂层添加到所有相应的通道后，将接口连接到板上。
如果您使用的是 bio flux 1000 接口，则可以将两个闩锁夹紧到载物台上。如果您使用 Bio flux 200 接口的第一根手指，请拧紧四个螺钉。然后，一旦它们全部设置好，使用扭矩驱动器完全拧紧。
扭矩起子在达到最大值时发出咔嗒声。使用 bio flux 软件中的手动模式，以距出口每平方厘米 2D 的位置对感兴趣的通道进行灌注。好吧，使用显微镜上的低倍物镜找到入口井，并观察对面的内冲头充满液体。
您应该首先看到一小块液体，几分钟后慢慢填充内冲头，当入口内冲头装满时，按下软件中的停止按钮，停止所有通道上的溢出。将板在室温下孵育 1 小时。在此孵育期间，您可以在 1 小时的孵育结束时开始制备全血。
血液准备好后，取下接口，向出口处添加 1 毫升 PBS 加钙和镁离子。从出口井开始大量涌入，每平方厘米 2 份，并继续大量涌出 10 分钟。10 分钟后，停止充血 去除界面后，从入口和出口孔中去除多余的 PBS。
切勿去除填充内冲头的液体。要堵塞通道，请向每个出口添加 1 毫升阻塞溶液。井 - 使用时，从出口井以每平方厘米 2 dine 的速度灌注，并继续灌注 10 分钟。
10 分钟后停止 profusion 并移除接口。通道现已准备就绪，可以在板涂有胶原蛋白时全天使用。在一小时的孵育过程中，应准备来自空腹个体的新鲜人血进行成像并流入板中。
应将血液抽入柠檬酸钠、抗凝剂中，并在采集后 3 小时内使用。首先，将 4 毫摩尔钙 M 的 DMSO 溶液以每体积 1 至 1000 体积的稀释度添加到血液中。为了获得四微摩尔钙，通过温和倒置混合。
接下来，将 1 毫升钙标记的血液分配到 10 个 1 点 5 毫升的微管中。将 GP two B three a 抑制剂抗体以所需稀释度添加到每个试管中。确保包括无抗体阴性对照和无关抗体阳性对照，通过温和倒置混合。
在运行流通池实验之前，将试管在室温下孵育 1 小时，每 10 分钟轻轻倒置一次。应在胶原蛋白的生物通量控制模块中设置自动化方案。一。制定一个方案，从出口以 10 厘米 9 平方厘米的速度运行血液 10 分钟。
好吧，应该使用 BioFlex 1000 工作站设置数据采集参数，其中包括在 fitz 波长和延时设置中采集所需的载物台位置。该协议的典型图像采集计划包括每个通道一个视场，使用 10 倍物镜每 30 秒捕获一次，总持续时间为 10 分钟。还可以使用其他视野和备用 TimeLapse 设置。
设置好自动方案和数据采集参数后，返回 BioFlex 板并去除通道两侧的液体，内部打孔除外。注意快速工作，将每种情况的 500 微升血液放入每个通道的输出孔中。请注意，输出孔用于输送血液，因为它是到达观察区的最短路径，并且会提供更直接的血液对胶原蛋白涂层的反应。
此外，将没有抗体的对照血液放入涂有胶原蛋白的通道和刚刚堵塞的通道中。将板放在 BioFlex 1000 工作站显微镜上并夹住接口。通过找到定义为原点的第一个校准点来执行阶段列表校准。
然后找到并标记第二个校准点。将此校准应用于相应的阶段列表。这确保了板上的所有查看位置都可以自动找到。
将载物台移动到包含血液拟合的通道之一 e 图像捕获参数，例如 BioFlex 蒙太奇软件中的曝光时间和增益。通过单击所需的按钮启动相应的工作流。这将同时启动流式协议和图像采集。
实验结束时，从 BIOFLU 1000 工作站中取出板，并根据机构指南进行处理。使用胶原蛋白涂层的生物通量系统的微流体通道。使用未经处理的对照血样，随着时间的推移观察到侵袭性血栓形成。
相比之下，未包被的通道未观察到血栓形成。在最近进行的一项实验中，在对照条件下，聚集体的平均尺寸为 2000 平方微米。GP 2 B 3 A 是血小板血小板相互作用和聚集稳定的有效介质，当通过与胶原蛋白粘附激活时，如图所示，在纯粹暴露前与抗 GB 2 B 3 A 抗体孵育 1 小时后，观察到血栓大小的减小以及血栓形成频率的降低。
通常可以在 10 9 平方厘米处观察到剂量依赖性反应，并且该特定抑制剂的 IC 50 值为 17 纳摩尔。与无抗体对照相比，该供体的最大抑制作用为 11%（10 平方分）。48 孔高剪切板也可用于运行高达 200 D/平方厘米或 5， 000 逆秒的全血实验。
我们刚刚向您展示了如何使用微流体流道进行生理相关的血管生物学实验。在执行此方案时，请务必记住在正确的缓冲液中稀释胶原蛋白。始终使用正确的移液技术以避免引入气泡，并始终遵守实验室的生物安全规定。
就是这样。感谢您的观看，祝您的实验好运。
概述
本文介绍了一种模拟生理剪切流条件的血小板聚集分析的微流控板式格式。该方法允许对血小板粘附和聚集进行高通量研究。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 血管生物学
- 微流控技术
背景
- 血小板粘附对止血和血栓形成至关重要。
- 传统测定不能复制剪切流条件。
- 微流控技术能够精确控制流动动力学。
- 高分辨率显微镜可以量化血小板相互作用。
研究目的
- 开发模拟生理条件的微流控测定。
- 评估药物化合物对血小板行为的影响。
- 提高血小板聚集研究的效率。
使用的方法
- 制备具有胶原蛋白涂层的微流控通道。
- 使用BioFlux系统进行受控剪切流实验。
- 高分辨率成像血小板粘附和聚集。
- 使用自动数据采集定量分析结果。
主要结果
- 成功模拟了血小板测定中的剪切流条件。
- 高通量能力，减少血液体积需求。
- 量化了不同参数下血小板相互作用的数据。
- 展示了测定用于药物测试的适用性。
结论
- 微流控板式格式增强了血小板聚集研究。
- 该方法提供了血小板在生理条件下行为的见解。
- 未来应用可能包括药物开发和血管研究。
常见问题
Executive Industry Relevance
Microfluidic flow cell assays for platelet adhesion and aggregation provide physiologically relevant, quantitative data critical for early-stage vascular biology and thrombosis research. By replicating shear flow conditions, these assays enable predictive evaluation of antiplatelet compounds and mechanistic de-risking at the target validation stage. This approach supports portfolio decisions by delivering high-throughput, reproducible insights into platelet function under near-physiological conditions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of platelet activation pathways under controlled shear flow.
- Supports functional validation of antiplatelet targets using quantitative aggregation metrics.
- Facilitates mechanistic de-risking by distinguishing compound effects on adhesion versus aggregation.
- Provides predictive confidence for advancing vascular biology programs.
Screening & Assay Development
- Delivers standardized, high-throughput assay formats compatible with SBS well-plate workflows.
- Generates reproducible, quantitative outputs for compound screening and IC50 determination.
- Prepares validated biological systems for downstream pharmacological evaluation.
- Enables reliable comparison of inhibitor efficacy across multiple conditions.
Translational & Preclinical Research
- Aligns in vitro platelet function assays with physiological shear conditions relevant to human disease.
- Supports translational biomarker development by quantifying aggregation endpoints under flow.
- Provides continuity from early discovery through preclinical validation of antithrombotic agents.
- Reduces biological risk by modeling disease-relevant vascular responses.
Pipeline & Workflow Integration
This microfluidic assay bridges early discovery, lead identification, and preclinical evaluation for antiplatelet and vascular biology programs.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification for platelet activation and aggregation.
- Screening: Offers assay readiness and reproducibility for quantitative inhibitor profiling.
- Analytics: Provides high-resolution imaging and quantitative aggregation measurements for robust data analysis.
- Translational Research: Connects in vitro findings to disease-relevant vascular models and biomarker strategies.
- Enterprise Reuse: Establishes a scalable, reusable platform for vascular biology and drug screening pipelines.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in platelet-targeted programs.
- Operational Value: Standardizes assay conditions and enables high-throughput, reproducible workflows.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by providing robust early-stage data.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of vascular and antithrombotic assets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microfluidics, vascular biology, and quantitative imaging analysis.
- Needs access to automated microfluidic platforms and high-resolution microscopy infrastructure.
- Demands cross-team standardization of assay setup, data acquisition, and analysis protocols.
- May require adaptation for different matrix proteins or flow conditions depending on disease context.
- Limited by blood sample stability and donor variability, necessitating careful experimental planning.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:00
Title
0:57
Introduction
1:16
Preparation of the Microfluidic Channels of a BioFlux Plate
4:34
Preparing the Blood with GPIIb/IIIa Inhibitory Antibody
5:41
Running the Flow Cell Experiment on the BF1000 Workstation
8:19
Platelet Adhesion and Aggregation Results
8:58
Conclusion
