结合微流控装置与显微镜及流式细胞术研究跨空间尺度多孔介质中的微生物迁移

研究细菌在多孔系统中的迁移对于污染控制、疾病传播以及生物修复具有重要意义。开展这些实验需要在单细胞、种群以及微生物群落水平上运行的数学模型。本文介绍了利用微流控装置结合显微镜，以及结合流式细胞术的较大型装置来研究细菌迁移的技术工具。

将微流控装置与显微镜和流式细胞术相结合，为在不同空间尺度上研究细菌运输现象提供了多种可能性。为了充分实施本方案，建议操作者事先具备显微镜使用、基础图像处理、微流控装置设计以及流式细胞术操作方面的经验。本视频介绍了两种在不同空间尺度上研究细菌运输的方法。

第一种方法基于微流控装置，依靠显微镜对单个细胞进行计数。该系统可用于研究从孔隙尺度到整个多孔系统尺度的多个空间尺度上的细菌迁移过程。第二种方法采用较大的流控装置，结合自动分配器和流式细胞术，可用于在完整多孔系统尺度上研究细菌迁移现象。

此类方法也可应用于实验室规模的柱状研究以及小范围野外调查。首先，设计由圆形阵列组成的所需多孔几何结构。根据选定的几何形状，采用标准 SU-8 光刻技术制备模具。

在洁净的一次性容器中，按重量将90%的弹性体与10%的固化剂混合，配制50克PDMS，并使用洁净工具将两种试剂充分混合。施加100毫巴的真空压力持续30分钟，以去除溶解的空气和气泡。将模具放入培养皿中，并将PDMS浇注到模具上，厚度控制在2至5毫米之间的所需高度。

将培养皿盖上盖子，并在 60 摄氏度下放置至少四小时。之后，让微流控装置冷却至室温。待其冷却后，用手术刀小心地切下所需部分的 PDMS。

用胶带暂时封闭PDMS通道的底部。使用直径为0.5毫米的打孔器穿刺通道，以形成入口和出口。移除PDMS通道上的胶带，并将通道放置于多孔面朝上的位置。

将玻片和PDMS表面在室温下分别进行约45秒的等离子处理。将预处理过的PDMS通道置于预处理过的玻片上，于加热板上100摄氏度加热30分钟，随后将微流控装置从加热板上取下并冷却至室温。抽真空30分钟以去除PDMS中的空气。

为制备含有孔腔室的基底，采用高精度微铣削技术从基底PMMA层去除0.5毫米材料，并铣出一个尺寸为1.1毫米×1.1毫米的凹槽用于安装橡胶O型圈。在流体装置的顶部钻两个带螺纹的孔作为进液口和出液口，另钻12个用于固定螺丝的孔。此部分作为流体装置的盖板。

清洗微流控装置后，使用12个螺纹孔将底座和盖子拧紧。将微流控装置从真空环境中取出，放置在显微镜载物台上。使用注射泵用运动缓冲液将其充分饱和。

使用明场显微镜或相差显微镜，调节放大倍数以观察单个细菌细胞，并聚焦于观察通道的中心。切换光路设置至荧光显微镜模式。通过调整焦距偏移和相机曝光时间，使单个细菌细胞清晰可见。

在此情况下，为100毫秒。接下来，将进样管插入含有细菌悬液的2毫升离心管中。反转泵的运行方向，并以每分钟1微升的流速开始抽吸悬液。

扫描整个观测通道的横截面，每隔一分钟记录一幅图像。将图像导入所需的软件平台。在尚未记录到颗粒时，以前几张图像的平均值作为背景。

从每幅图像中减去背景，以去除相机噪声和光学像差。将图像裁剪至感兴趣区域。确定一个等于细胞荧光像素强度的阈值，使得大于该阈值的像素值包含细菌细胞。

使用图像处理技术从每张图片中减去阈值。将得到的图像进行二值化处理，使细菌细胞的像素值为1，背景的像素值为0。去除面积小于最小细菌细胞像素大小的像素簇。

对二值化图像进行求和，以获得剩余簇的总像素数。将像素数除以单个细菌细胞的平均像素大小，从而估算出细胞数量。将计数值转换为每毫升颗粒数的浓度。

为了确定注入的细菌悬液浓度，使用注射器将细菌悬液注入洁净的微流控装置的观察通道中。记录图像，并按照先前所示方法计算进水细菌浓度。通过将出水细菌浓度 C 与进水细菌浓度 C0 进行归一化处理，并绘制 C 与 C0 的比值随时间的变化曲线，以可视化穿透曲线。

为了分析细菌在多孔介质中迁移的局部速度和轨迹，将显微镜载物台移动至目标区域，并调节焦距至微流控装置的中心位置。将光学配置设为相差显微镜或荧光显微镜模式。采集时间序列图像，并设置足够短的曝光时间以捕捉细菌的位移。

在此情况下为 50 毫秒。记录足够长时间内的图像，例如三分钟。为去除每幅图像中的噪声，需减去背景，即所有记录图像总和的平均值。

确定数值梯度的模，并将其除以最大值进行归一化。查找并记录细菌的坐标以及图像采集时间，存入一个三列文件中。进行颗粒追踪分析以处理记录的数据，并计算轨迹。

为了获得沉积分布图，需在通过微流控装置注入细菌悬浮液之前，记录整个多孔通道的复合图像（即背景图像），以及注入后的复合图像。从注入细菌后记录的图像中去除背景。通过计算沿多孔通道横截面长度 x 方向的细菌荧光信号总和，得到沉积分布图 D。

通过局部荧光信号与多孔通道长度的关系，可视化沉积轮廓。为设置自动分配器，将机器人分配器放置在微流控装置附近。将机器人分配器连接至运行 BCNC 的计算机，并识别正确的串行端口。

在 BCNC 中，单击主页按钮，使机器人分配器返回初始位置。使用长度为 50 厘米、内径为 1 毫米的管路将蠕动泵的入口连接，使用相同规格的管路连接出口与自动分配器。通过流体装置泵入培养基。

观察培养基到达固定在机器人分配器上的出口管路时，放置一个96孔板以收集流出液。同时启动机器人分配器，以每分钟0.2毫升的流速将细菌悬液注入PMMA微流控装置中。注入相当于数个孔隙体积的细菌悬液。

例如，使用流体装置体积30倍的溶液。注射后，更换为无菌培养基，并持续维持至实验结束。待96孔板操作完成后，盖上板盖，于4摄氏度保存，直至进行流式细胞术分析。

使用流式细胞术分析样品，并通过将出流细菌浓度 C 除以进流细菌浓度 C0 进行归一化，绘制 C/C0 随时间变化的穿透曲线。本研究中，利用运动型和非运动型的 Pseudomonas putida KT2440，在具有随机柱阵列的 PDMS 微流控装置中进行了连续实验。此处展示了归一化至注入细胞浓度的穿透曲线，以及孔隙尺度下的细菌运动轨迹。

还进行了使用从PMMA材料上铣削出的大规模流体装置的实验。将运动型和非运动型的恶臭假单胞菌KT2440注入规则排列的多孔介质基质中。引人注目的是，在无生物膜存在的多孔环境中，运动型与非运动型恶臭假单胞菌KT2440根据穿透曲线显示出显著不同的迁移行为。

在由复杂的溪流生物膜群落定植48小时的多孔基质中，运动型与非运动型恶臭假单胞菌KT2440之间在穿透曲线上的差异消失。我们利用该系统研究细菌在溪流中的迁移，但这些工具也可轻松调整用于研究其他工程和环境系统中的细菌迁移现象。细菌在水合多孔介质中的迁移涵盖了多个空间尺度上的过程。

本文所介绍的方法能够将孔隙尺度下细菌的局部位移与整个多孔介质中的微观传质过程关联起来。