用于微生物单细胞分析的微流控皮升级生物反应器：制备、系统搭建与操作

本实验的总体目标是利用微流控培养装置，在环境条件恒定的情况下，对单个细菌及其演化的同基因微菌落进行具有完整空间和时间分辨率的分析。首先通过计算机辅助设计（CAD）软件设计微流控培养系统，随后采用聚二甲基硅氧烷（PDMS）制备一次性微流控培养装置，该装置包含皮升级生物反应器，其高度为一微米，以限制细菌生长为单层结构。

将微生物培养物注入微流控装置，以在生物反应器内接种单个母细胞。通过系统持续灌注培养基使细胞扩增。通过自动化的延时显微成像获得结果，展示了工业相关谷氨酸棒杆菌菌株的培养过程、生长数据以及细胞间的异质性。

在传统的生物技术中，大多数分析基于平均数据。我们的微流控设备能够以空间和时间分辨率为单个细菌进行单细胞分析。该设备是深入研究同基因型微菌落中细胞间异质性的有力工具。

我们采用常规的SU-8光刻技术和聚二甲基硅氧烷（PDMS）芯片模塑工艺，制造具有亚微米培养基分辨率的一次性微流控装置。我们已成功将该技术应用于多种生物技术微生物，如大肠杆菌（Escheria coli）和谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）。首先，使用CAD软件设计微流控装置。

本方案中描述的设计包含两个接种入口、一个用于混合两种不同底物的浓度梯度发生器、一个出口，以及由六个阵列组成的结构，每个阵列包含五个生物反应器。在洁净室中，准备一片四英寸的硅片，并按照配套文本方案中的描述，通过旋涂法在硅片上涂覆一层厚度为一微米的 SU-8 2000.5 光刻胶。将涂覆后的硅片置于 95 摄氏度的加热板上，以去除多余的溶剂，随后将包含皮升反应器捕获区域的第一层光掩模与涂覆后的硅片一同插入掩模对准仪中。

然后，将晶圆置于真空接触模式下，用波长为350至400纳米的光照射3秒，光强为7毫瓦每平方厘米。在水平的热板上进行曝光后烘烤，温度为95摄氏度，以启动SU-8的聚合反应。接着，将晶圆放入SU-8显影液中浸泡1分钟，然后将晶圆转移至另一含有新鲜SU-8显影液的容器中，继续显影数秒。

用异丙醇冲洗晶圆以去除SU-8显影液，并使用氮气流或晶圆甩干机将晶圆干燥。然后在150摄氏度下进行坚膜烘烤10分钟。接下来，按照随附的文字实验方案制备第二层，以完成模具母版的制作。

以10比1的比例混合PDMS基液与固化剂，开始PDMS芯片的制备。将混合后的PDMS溶液置于真空干燥器中脱气约30分钟，直至所有气泡完全消失。接着，将SU-8晶圆放入模具装置中，并在晶圆表面浇注一层厚度为3毫米的PDMS混合液。

然后，将PDMS置于80摄氏度的烘箱中烘烤3小时。待其冷却后，小心地将PDMS块从硅片上剥离，并使用洁净锋利的手术刀将PDMS块切割成单个芯片。将芯片在正戊烷浴中清洗90分钟，随后分别用丙酮清洗液洗涤两次，每次90分钟。

将芯片过夜干燥以去除任何溶剂残留。在实验开始前，使用针头或打孔器在PDMS芯片上打出入水口和出水口，打孔所用针头或打孔器的直径应略小于用于连接管路与PDMS芯片的接头。接着，用异丙醇小心清洗微流控PDMS芯片，并使用透明胶带去除附着的灰尘颗粒。

此外，先用丙酮、再用异丙醇、然后用去离子水依次清洗厚度为170微米的玻片，最后用氮气流吹干。待玻片清洁并干燥后，使用50瓦功率和20 sccm的氧气流速对玻片和PDMS芯片进行25秒的等离子体氧化处理。随后，在将PDMS芯片放置到玻片上之前，仔细对准两者，使其在数秒内完成键合。

在80摄氏度下烘烤装置10秒以加固键合。为准备芯片实验用的细菌，挑取一株所需菌株（如谷氨酸棒杆菌）的单菌落接种于20毫升新鲜BHI培养基中，在30摄氏度、120 RPM的摇床中过夜培养。次日早晨，取10微升预培养物转接到含20毫升相应培养基的第二轮培养中，并在相同条件下过夜培养细胞。

第二天，将倒置显微镜的培养箱预热至30摄氏度。根据具体设备的不同，此过程可能需要长达两个小时。在设备升温的同时，打开培养箱，选择所需的物镜，并使用任何必要的封片介质进行准备。

然后，将芯片安装到芯片支架内并固定。将样品置于显微镜下居中，并聚焦至皮升级生物反应器阵列。芯片聚焦后，使用合适的管路连接入口和出口，然后将出口管路放入废液储槽中。

接着，用新鲜培养基填充一个注射器，将其放入注射泵中，并以每分钟200纳升的流速冲洗微流控通道一小时，以充分润洗芯片。当细胞仍处于对数生长期初期时，将1毫升细菌培养物转移至无菌注射器中，并更换含有培养基的注射器和管路，代之以细胞悬液和新的管路。以每分钟200纳升的体积流速将细胞悬液注入通道，直至大多数皮升级生物反应器被填满。

如果仅填充少量生物反应器，则将流速提高至800至1200纳升每分钟。当接种的细胞数量达到预期后，断开细胞悬液，重新连接培养基至芯片，并以100纳升每分钟的速度灌注新鲜培养基。接下来，扫描芯片并选择特定的生物反应器进行延时成像。

然后，设置一个延时显微成像序列，以对生物反应器从实验开始至结束进行全程成像，并启动实验。当所有皮升级生物反应器中的细胞均生长过量后，停止实验并妥善丢弃芯片。开始分析前，首先确定哪些生物反应器满足实验所需的全部标准，例如母细胞的数量和位置。

使用图像分析软件（如 ImageJ），通过计数每个时间点的细胞数量来确定各个微菌落的生长速率。通过绘制时间与细胞数量对数值的关系图，计算最大生长速率。本研究所展示的系统可用于针对不同生物学参数（如生长、形态或荧光信号）分析多种细菌物种。

在此示例中，谷氨酸棒状杆菌（C. glutamicum）在标准培养条件下培养，并展示了由三个同基因型微菌落获得的生长曲线。皮升级生物反应器还被证明可用于通过时间延时荧光显微镜研究蛋白质的表达，如图所示。通过向细胞施加低浓度的蛋白质诱导剂IPTG，可从单个母细胞开始的菌落中，在单细胞水平上研究细胞间蛋白质表达的差异性。

本演示技术可用于在完全可控的环境中监测和分析单个细菌细胞，而这是传统台式培养系统难以实现的。观看本视频后，您应能够充分了解如何制备微流控培养芯片，以进行可比较的单细胞分析。