Name: 用于微生物单细胞分析的微流控 Picoliter 生物反应器：制造、系统设置和作 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-06T17:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 4 s
Description: 学习使用微流控皮升级生物反应器进行微生物单细胞分析，通过CAD设计和PDMS制造实现单细菌培养。该方法可研究Corynebacterium glutamicum等工业菌株的生长动态与细胞异质性。

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作者谨此感谢技术人员 Agnes Müller-Schröer 所做出的宝贵贡献。本工作部分在于利希研究中心有限公司的亥姆霍兹纳米电子设施（HNF）完成。作者对所提供的慷慨帮助与支持深表感谢。

1. 晶圆制备
<ol>
	<li>设计包含进口、出口、主通道和PLBRs的微流控装置图1A) 使用 CAD 软件。</li>
	<li>本方案中介绍的设计（图2包含两个接种入口、一个用于混合两种不同底物的梯度发生器、一个出口以及六组PLBR阵列。每组阵列包含5个PLBR，使得单个微流控装置内共有30个并行的PLBR。</li>
	<li>创建包含所需芯片布局的光刻掩模（图1B）。光掩模通过电子束直写技术在内部制备，分辨率可达亚微米级。所用掩模由铬层构成，基底为5英寸2&#160;玻璃板 
	注意：所有以下步骤均须在百级洁净室或更优条件下进行（流程图见图3A和图3B）。</li>
	<li>清洁一根4英寸&#160;用食人鱼溶液（浓硫酸与过氧化氢按10:1比例混合）和氢氟酸处理硅片数分钟（注意：使用危险化学品）。用去离子水冲洗约10秒。</li>
	<li>在 200 °C 下脱水 20 分钟。</li>
	<li>旋涂 1 µm 厚的 SU-8 2000.5 光刻胶至晶圆表面（1st 层）（4 ml 抗蚀剂，以 v = 500 rpm、a = 100 rpm/sec 的条件旋转 10 秒，然后以 v = 1,000 rpm、a = 300 rpm/sec 的条件旋转 30 秒）。</li>
	<li>将涂覆好的晶圆置于95 °C的加热板上，以驱除过量溶剂（65 °C下1.5分钟，95 °C下1.5分钟，再65 °C下1分钟；理想情况下使用两个加热板）。</li>
	<li>插入1st 将光刻掩模（此处为皮升级反应器的捕获区域）和晶圆放入掩模对准器中，使用350-400 nm波长光进行曝光（真空接触模式，能量密度64 mJ/cm²，时间t = 3秒，光强I = 7 mW/cm²）。</li>
	<li>在热板上进行曝光后烘烤，以启动SU-8的聚合反应（65 °C下1分钟，95 °C下1分钟，再65 °C下1分钟）。 注意：此步骤之后，可在SU-8层中观察到结构。</li>
	<li>将晶圆放入SU-8显影液中浸泡1分钟，随后转移至盛有新鲜SU-8显影液的第二容器中数秒。</li>
	<li>用异丙醇冲洗晶圆以去除SU-8显影液，并使用晶圆甩干机的氮气流吹干晶圆。</li>
	<li>将晶圆在 150 °C 下硬烘 10 分钟。</li>
	<li>旋涂9 µm厚的SU-8 2010光刻胶至晶圆上（2nd层）（分配4 ml抗蚀剂，以v = 500 rpm、a = 100 rpm/sec的参数旋转10秒，然后以v = 4,000 rpm、a = 300 rpm/sec的参数旋转30秒）。</li>
	<li>将带有SU-8的晶圆置于95 °C的热板上，以去除过量溶剂（65 °C下15分钟，95 °C下45–60分钟，再于65 °C下10分钟）。 注意：需注意褶皱和气泡。如果将晶圆过快加热至 95 °C，蒸发的溶剂可能被包裹在微小的气泡中。</li>
	<li>将带有理想图案（此处为用于营养供给的主通道）的光掩模与晶圆放入掩模对准器中，进行曝光（硬接触模式，350–400 nm，64 mJ/cm²，t = 10 s，I = 7 mW/cm²）</li>
	<li>在热板上进行曝光后烘烤，以完成SU-8的聚合（95 °C下3分30秒，65 °C下各5分钟和3分钟，程序为：65 °C 5分钟，95 °C 3分30秒，65 °C 3分钟）。 注意：此步骤之后，可在SU-8层中观察到结构。</li>
	<li>将晶圆放入SU-8显影液中显影45秒，随后转移至另一盛有新鲜SU-8显影液的容器中，继续显影60秒。</li>
	<li>用异丙醇冲洗晶圆20秒，以去除残留的SU-8显影液，然后使用加压氮气吹干晶圆。</li>
	<li>最后在 150 °C 下对晶圆进行坚膜烘烤。最终得到的晶圆（图1C）被获得，将用作PDMS成型的主模具。</li>
	<li>进行轮廓仪测量（图3C) 以验证 SU-8 结构的高度。 注意：结构高度的不准确可能导致细胞捕获效率降低，或在培养过程中出现细胞丢失。</li>
</ol>
2. 聚二甲基硅氧烷芯片制备
注意：以下所有步骤最好在层流条件下进行，以防止灰尘颗粒干扰制备过程（A&#160;流程图如图4所示。
<ol>
	<li>按10:1的比例配制聚二甲基硅氧烷（PDMS）基液与固化剂的混合物。仔细混合直至形成均匀且不透明的溶液。根据所需层高（此处为3 mm）准备适量混合物。</li>
	<li>将PDMS混合物置于轻微真空条件下脱气约30分钟，直至所有气泡完全消失。</li>
	<li>准备好带有合适SU-8晶圆的模具（或培养皿），并将PDMS混合物倒入其中（图1D）。</li>
	<li>将PDMS在80 °C烘箱中烘烤3小时&#160;。</li>
	<li>小心地从晶圆上剥离PDMS块体，并使用洁净锋利的解剖刀将其切割成单个芯片。</li>
	<li>将芯片在正戊烷浴中清洗90分钟，随后进行两次丙酮清洗（每次90分钟）。过夜干燥以去除任何残留溶剂。注意：PDMS清洗操作应在通风橱中进行。注：在正戊烷清洗过程中，固化PDMS中的单体和二聚体将被去除，芯片尺寸可能在清洗过程中暂时&#160;增大一倍。</li>
	<li>将微流控PDMS芯片存放在密闭容器中，直至最终实验使用。</li>
	<li>实验前，使用针头（或打孔器）在PDMS芯片上打出入孔和出孔，孔径应略小于用于连接管路与PDMS芯片的接头直径。</li>
	<li>用异丙醇小心清洗微流控PDMS芯片，并使用透明胶带反复粘贴以去除可能附着在PDMS结构面的灰尘颗粒。重复使用胶带多次，直至芯片表面无可见颗粒。</li>
	<li>依次用丙酮和异丙醇清洗一片厚度为170 µm的玻璃盖片，最后用去离子水清洗，并用加压氮气吹干。</li>
	<li>在等离子活化前，预热等离子清洗机并运行等离子约300秒。对玻璃盖片和PDMS芯片进行等离子氧化处理（功率50 W，时间25秒，氧气流速20 sccm）。</li>
	<li>在键合前对齐PDMS芯片与玻璃芯片。最后将PDMS芯片小心地贴合到玻璃盖片上（图1E）。PDMS与玻璃将在数秒内完成键合。注：键合过程中切勿用镊子按压PDMS芯片顶部，以免导致通道及微小结构发生所谓的“顶板塌陷”。</li>
	<li>为增强键合强度，将最终的PDMS-玻璃芯片在80 °C下加热10秒。</li>
</ol>
3. 细菌培养物的制备
注意：所有培养物均应使用无菌过滤的培养基制备，以防止产生不希望的颗粒物积累，这些颗粒物可能在培养过程中造成干扰。
<ol>
	<li>使用含有目标生物体的琼脂平板（此处为 C. glutamicum ATCC 13032），挑取单个菌落接种于 20 ml 新鲜的 BHI 培养基中，在 30 °C 条件下于旋转摇床（120 rpm）中过夜培养（≈ 8–14 小时）。</li>
	<li>将 10 µl 预培养物转移至目标培养基（此处为 CGXII21）中，该培养基将用于微流控培养，随后在 30 °C 条件下于旋转摇床（120 rpm）中过夜培养细胞。</li>
	<li>将适量的细胞悬液（10–500 µl，根据实验起始条件而定）转移至目标培养基（此处为 CGXII21）中，该培养基将用于微流控细胞培养。注意：最好使用处于对数生长期初期的细胞进行接种。对于 C. glutamicum&#160;培养，接种时最佳的光密度（OD600）范围为 0.5–2。</li>
	<li>将 1 ml 细菌培养物转移至无菌的 2 ml 离心管中。注意：此步骤应在微流控 PDMS 芯片组装完成后立即进行，以尽量减少从摇瓶到微流控培养之间的转移时间。通常转移时间约为 15 分钟&#160;，应尽可能缩短，以避免因氧气限制和温度变化对代谢造成影响。</li>
</ol>
4. 实验设置
注意：所有步骤均使用倒置显微镜进行。
<ol>
	<li>在实验开始前2小时启动显微镜培养箱，以预热系统。注意：显微镜应配备全尺寸培养箱，用于控制温度，如有需要还可控制气体流动。由于芯片系统持续灌注培养基，因此无需额外的湿度控制。</li>
	<li>打开培养箱系统，选择所需物镜，并在必要时向物镜上添加浸油。</li>
	<li>将芯片安装至芯片支架内。如有需要，可用胶带固定玻璃片，以避免在载物台操作过程中芯片发生移动。</li>
	<li>将样品置于显微镜中央，并聚焦于PLBR阵列上。</li>
	<li>使用适当的管路连接入口和出口（图1F）。将管路连接至废液储液罐。代表性芯片如图4D所示。</li>
	<li>将注射器插入泵中，并启动培养基流动。使用培养基、缓冲液或必要时使用包被溶液，冲洗微流控通道约1小时。注意：包被溶液用于包被通道壁，以防止细胞非特异性黏附。</li>
	<li>对于E. coli，使用0.1%的BSA溶液包被通道壁；对于C. glutamicum，则无需包被。包被完成后，在接种细胞前用培养基冲洗芯片。</li>
	<li>在细胞接种和培养前，检查是否存在泄漏，并确认温度保持恒定。</li>
</ol>
5. 将细菌细胞接种至微流控装置
<ol>
	<li>确保所需的细菌溶液已装入连接管路的适当注射器中。</li>
	<li>断开缓冲液或包被溶液，将细胞悬液连接至芯片。为尽量减少死体积、避免不必要的气泡并缩短实验时间，应更换整个针头及管路，而不仅仅是更换注射器。</li>
	<li>以200 nl/min的体积流速将细胞悬液注入通道，直至大多数PLBR中充满所需数量的细胞（图5A）。注意：最佳接种效果取决于细菌菌株、预培养物的OD600值及其培养基。需调整这些参数以提高捕获效率，并缩短在反应器结构中捕获到足够数量细胞所需的时间。对于C. glutamicum，通常使用OD600为0.5–2的细胞悬液；对于E. coli&#160;，OD600&#160;值通常在0.5–1之间。</li>
	<li>若仅有少量PLBR被填充，可将流速提高至800–1,200 nl/min。</li>
	<li>断开细胞悬液，将培养基连接至芯片（图5B）。更换培养基时务必避免引入气泡。以100 nl/min的流速用新鲜培养基进行灌注。</li>
</ol>
6. 时间序列成像
<ol>
	<li>选择特定的 PLBR 进行延时成像。通常选择在实验开始时包含单个母细胞的 PLBR。一次实验中可检测的兴趣区域数量取决于所需的帧率和显微镜设置。</li>
	<li>根据 PLBR 的数量选择合适的帧率。确保显微镜能够在延时时间间隔内处理所需数量的兴趣区域。</li>
	<li>选择合适的滤光片组（此处为 YFP）。在载物台移动期间以及每次延时成像结束后自动关闭快门，以防止荧光团漂白。</li>
	<li>设置延时显微成像序列并启动实验。</li>
	<li>当所有 PLBR 均被细胞长满后，可停止实验，丢弃微流控 PDMS 芯片，并对实验结果进行分析。</li>
</ol>
7. 分析
注意：以下步骤或操作程序可手动完成，也可通过图像分析软件（如 ImageJ、&#160;etc）完成。
<ol>
	<li>确定满足所有期望标准的培养条件下的目标PLBRs， 例如&#160;母细胞数量、母细胞位置 等等.</li>
	<li>通过在每个时间点计数单个微菌落中的细胞数量来确定其生长速率。</li>
	<li>通过绘制时间与细胞数量自然对数（ln）的关系曲线，计算最大生长速率。该曲线的斜率即为生长速率，单位为[1/小时]（参见 图6).</li>
	<li>荧光数据分析在很大程度上取决于所进行的实验。本报告中选择了一个示例，用于说明不同同基因型微菌落之间的菌落间和细胞间异质性（参见 图7).</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

我们描述了一种包含多个（PLBRs）用于细菌单细胞分析的微流控PDMS装置的制备、实验装置及相关操作流程。
采用软光刻技术进行微加工，可快速调整器件尺寸，以适应不同大小和形态的细菌。目前，我们正在优化皮升级生物反应器，以适用于不同微生物的培养以及提高培养通量。为了提高捕获效率，反应器的几何结构也正在优化中。图8展示了四种正在验证中的新型PLBR装置。所有图中，接种通道的宽度和形状均经过重新设计。实际应用中，这似乎会影响被捕获细胞的数量，但仍需进一步研究。通过增加额外的溢流通道，显著提高了捕获效率，这些通道增强了反应器内的对流流动，从而捕获更多细胞。然而，与此同时，在培养过程中也增加了细胞被冲出的风险。
该装置是一种有趣的替代方案，可用于替代数十年来在单细胞水平上研究生长和生产过程的宏观培养方法。然而，该装置有一些重要要求：为了实现对多个皮升级生物反应器的并行监测，必须配备高分辨率、完全电机化且具备焦点漂移补偿功能的显微镜系统。此外，还需要一个孵育系统，以在整个测量过程中维持所需的恒定培养温度。
我们实现了95%的器件制备成功率。主要问题与PDMS-玻璃键合效率低、PDMS顶板塌陷或液体泄漏有关（常见问题的故障排除参见表1）。尽管实验操作部分在非无菌条件下进行，但由于流体系统为封闭式，实验过程中极少出现污染。PDMS微流控器件具有良好的光学透明性，因此可用于高分辨率的体内成像。尽管PDMS在应用上看似理想，但它对疏水性分子具有较强的吸附性，限制了其在全细胞生物催化过程中广泛使用的溶剂的应用。然而，已有合适的涂层技术可用于调整该方案以适应此类应用。
所提出的PLBR非常适合对各类细菌的细胞乃至亚细胞事件进行时空分析。该方法的主要优势在于能够直接定量微菌落的生长，这与传统方法形成鲜明对比。此外，PLBR可在定义明确且恒定的条件下进行培养。由于该系统便于使用少量试剂或材料，因而具有成本低、可定制以及适用于高通量分析的优点。在传统方法中，分析微生物培养时通常考虑整个群体的平均值。此外，现有方法需要人工取样，可能导致样品降解，从而引起测量误差。PLBR为生物过程开发和微生物群体异质性分析提供了新的研究视角。PLBR是一种在生物过程开发中具有广泛应用前景的工具，可应用于多个研究领域，例如&#160;细胞间异质性分析、细胞谱系中特定细胞簇的分析、微生物生产菌株的筛选以及细胞表型的实时研究。

延时显微镜是研究活体细胞的有力工具in vivo1。与此同时，市面上可获得的全自动显微镜平台通常具备热致焦漂移补偿功能，已广泛应用于生物学研究中，用于观察各种时间依赖性现象，涵盖癌症研究、神经元细胞研究、组织工程，以及单个酵母或细菌细胞的动态研究2-6。
通常使用透明的孔板、琼脂垫或简单的显微镜载玻片来为延时成像过程中的细胞培养提供环境7尽管适用于某些研究，但这些简单系统对环境条件的控制能力非常有限，无法实现更复杂的扰动或精确且快速的培养基更换。最近市场上推出了通过大规模生产制造的一次性微流控芯片装置，但这些装置大多针对较大的真核细胞类型设计。4. 尽管可以追踪生长情况，但关于生长的明确定义研究仍涉及， 例如&#160;精确的细胞捕获、菌落大小、生长方向以及细胞移除能力均受限。已开发出可在三维环境中培养细菌细胞的微流控培养系统与反应器。8-10在单细胞水平的定量研究中存在局限性。尽管可以分析整体群体的异质性，但由于细胞生长不受单层限制，许多细胞参数无法以单细胞分辨率被准确测定。
这一局限性促使了微系统的开发，使得细胞能够在定义明确的通道和环境中培养，细胞以单层形式生长，可实现单细胞分辨率，并对培养基供给和环境条件进行精确控制6,11,12.&#160;目前已报道的用于细菌细胞培养的微流控系统实例较少12-14。细菌通常生长迅速，需要尺寸在数微米及以下的微流控结构，尤其是在需要为显微观察提供单细胞层时。Keymer et al. 展示了大肠杆菌（E. coli）菌株在微加工结构中的生长与扩散行为15,16。但由于他们的研究重点是群体动力学，因此未在单细胞分辨率下进行观测。
我们开发了皮升级生物反应器（PLBR）13，目前正用于在单细胞水平上研究多种生物技术性能指标，例如生长特性17以及与荧光偶联的生产率分析18,19。该微流控装置可在约一皮升级的确定培养体积下实现环境反应器的精确控制，同时支持对单个细胞进行连续观察。与开放单层培养盒系统11,14相比（此类系统的一侧或两侧向培养基供应通道开放），PLBR能够实现对细胞的可控捕获与培养。该设计可长期培养细菌，避免多个相邻菌落融合形成一个大群体。此外，系统中的培养区域高度为1 µm（与细胞直径相当），可限制细菌生长为单细胞层。而供应通道的深度则为此高度的10倍，以尽量降低流体阻力。
与微型批量培养系统20&#160;相比，本系统由于具有连续的培养基流动，可实现环境参数恒定的培养。此外，培养基成分、温度、流速和气体交换等环境参数可在数秒内被轻松控制和调节。这使得研究人员能够针对特定环境变化（例如营养物质的可利用性或应激刺激）对细胞响应进行精确研究。该系统所需的培养基体积极小，仅需数微升，使研究人员能够开展全新的实验，例如，在延时成像过程中利用大规模实验的上清液扰动细胞，从而揭示细胞在特定环境条件下的响应机制17。皮升级生物反应器为研究人员提供了一个可严格控制生物物理条件的稳定系统，其操作依赖高精度注射泵以及自动化的明场和荧光显微镜进行延时成像。本文中，我们报道了一套完整的实验方案，包括装置设计、制备方法及典型应用示例。

<table><tbody><tr><td>硅片，直径 100 mm，P/BOR &amp;lt;100&gt;</td><td>Si-MAT, Silicon Materials, 德国</td><td></td><td></td></tr><tr><td>光刻胶 SU-8 2000.5</td><td>Micro Resist Technology GmbH, 德国</td><td></td><td></td></tr><tr><td>光刻胶 SU-8 2010</td><td>Micro Resist Technology GmbH, 德国</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SU-8 显影液 mr DEV- 600</td><td>Micro Resist Technology GmbH, 德国</td><td></td><td></td></tr><tr><td>聚二甲基硅氧烷 (PDMS) Sylgard 184 硅橡胶弹性体套件</td><td>Dow Corning; Farnell GmbH, 德国</td><td></td><td></td></tr><tr><td>点样针头 Precision Tips&amp;nbsp; 27 G；内径 = 0.2 mm，外径 = 0.42 mm</td><td>Nordson EFD Deutschland, 德国</td><td></td><td></td></tr><tr><td>玻璃板 D263 T eco，30 mm × 25 mm × 0.17 mm</td><td>Schott AG, 德国</td><td></td><td></td></tr><tr><td>打孔器 AKA 5130-B-90</td><td>Harris Uni-Core</td><td></td><td></td></tr><tr><td>管路 Tygon S-54-HL，内径 = 0.25 mm，外径 = 0.76 mm</td><td>Saint Gobain; VWR International GmbH, 德国</td><td></td><td></td></tr><tr><td>一次性注射器 &amp;ndash; Omnifix Spritzen BRAUN Omnifix 40 Duo, 1 ml</td><td>B. Braun Melsungen AG, 德国</td><td>552-183143</td><td></td></tr><tr><td>注射器，1 ml 无菌玻璃注射器</td><td>INNOVATIVE LABOR SYSTEME GMBH (ILS), 德国</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">化学品</td></tr><tr><td>(NH&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;SO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG, 德国</td><td></td><td></td></tr><tr><td>尿素</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG, 德国</td><td></td><td></td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG, 德国</td><td></td><td></td></tr><tr><td>K&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG, 德国</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;bull;7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG, 德国</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MOPS</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG, 德国</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FeSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;bull;7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG, 德国</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MnSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;bull;H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG, 德国</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ZnSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;bull;7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG, 德国</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CuSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG, 德国</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NiCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&amp;bull;6H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG, 德国</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG, 德国</td><td></td><td></td></tr><tr><td>生物素</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG, 德国</td><td></td><td></td></tr><tr><td>原儿茶酸</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG, 德国</td><td></td><td></td></tr><tr><td>葡萄糖一水合物</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG, 德国</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BHI</td><td>Becton, Dickinson</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">细胞</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Corynebacterium glutamicum&lt;/em&gt; ATTC 13032</td><td>DSMZ; Leibniz-Institut DSMZ - 德国微生物与细胞培养物保藏中心有限公司, 德国</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Escherichia coli&lt;/em&gt; MG 1655</td><td>DSMZ; Leibniz-Institut DSMZ - 德国微生物与细胞培养物保藏中心有限公司, 德国</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">设备</td></tr><tr><td>晶圆清洗机 SSEC 3300</td><td>Solid State Equipment LLC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>匀胶机 SPIN150 -NPP</td><td>SPS Europe B.V.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>掩模对准器 MA-6</td><td>Karl Suess</td><td></td><td></td></tr><tr><td>加热板 HP30A - 2</td><td>Torrey Pines Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>实验室烘箱 Memmert UN 200</td><td>Memmert</td><td></td><td></td></tr><tr><td>等离子清洗机 FEMTO</td><td>Diener Electronics, 德国</td><td></td><td></td></tr><tr><td>neMESYS 注射泵</td><td>Cetoni GmbH, 德国</td><td></td><td></td></tr><tr><td>磁力搅拌器 CB 162</td><td>Stuart</td><td>VWR 442-0304</td><td></td></tr><tr><td>显微镜 Nikon Eclipse Ti</td><td>Nikon Microscopy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>显微镜培养箱</td><td>Pecon GmbH, 德国</td><td></td><td></td></tr><tr><td>离心机 minispin plus &amp;ldquo;黑线&amp;rdquo;</td><td>Eppendorf</td><td>9776501</td><td></td></tr><tr><td>分光光度计 BioPhotometer plus&amp;nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>6132000008</td><td></td></tr><tr><td>摇瓶摇床/培养箱 3031</td><td>GFL - 实验技术有限公司 (Gesellschaft f&amp;uuml;r Labortechnik mbH), 德国</td><td></td><td></td></tr><tr><td>轮廓仪，Dektak 150 触针式轮廓仪</td><td>Veeco</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

用于微生物单细胞分析的微流控皮升级生物反应器：制备、系统搭建与操作

Microfluidic Picoliter Bioreactor for Microbial Single-cell Analysis: Fabrication, System Setup, and Operation

本方案详细描述了 recently introduced 微流控皮升级生物反应器（PLBR）的制备、实验装置及基本操作。PLBR 可用于分析单个细菌和微菌落，以研究与生物技术和微生物学相关的问题，例如&#160;细胞生长、形态、应激反应以及代谢物或蛋白质在单细胞水平上的产生。该装置具有连续培养基流动功能，可为扰动研究提供稳定的环境条件，同时还能实现快速的培养基更换以及振荡条件，以模拟任意所需的环境状态。为制备一次性使用的装置，采用含有亚微米级 SU-8 结构的硅片作为复制模具，用于快速浇铸聚二甲基硅氧烷（polydimethylsiloxane）。芯片经切割、组装、连接后，安装于高分辨率全自动显微镜上，适用于延时成像，是进行时空细胞分析的有力工具。在此，将生物技术平台菌株 Corynebacterium glutamicum&#160;接种至 PLBR 中，连续数小时监测其细胞生长及细胞内荧光变化，揭示了在单细胞水平上随时间变化的群体异质性，这是传统分析方法（如流式细胞术）所无法实现的。除装置制备外，还演示了前培养物的准备、细菌的加载与捕获，以及单细胞和菌落的 PLBR 培养过程。这些装置将为微生物学研究增添新维度，可在严格环境控制下分析单个细菌的时间依赖性现象。由于其制备过程简单且耗时较短，该技术可轻松在任何微流控实验室中推广应用，并可根据特定需求进行灵活调整。

设备制备
微流控PLBR系统由一层聚二甲基硅氧烷（PDMS）键合到适用于高分辨率显微镜观察的薄玻璃芯片上制成。其制备过程主要包括两个步骤：首先是复制母模的制备（图1A、1B 和 1C），其次是芯片的制备（图1D、1E 和 1F）。根据本方案，采用标准的光刻微加工技术来制作母模。不具备洁净室条件的实验室可购买 commercially available 定制SU-8母模。通过重复的PDMS复制成型（图1A、1B 和 1C），可批量制备数百个一次性芯片。PDMS成型与芯片组装可在任何实验室完成，无需洁净室设施，但层流空气工作台更有利于操作。
该过程从微流控芯片系统的设计开始。通常使用计算机辅助设计（CAD）软件来设计微流控芯片（图1A）。完成CAD设计后，通过电子束写入仪生成具有亚微米分辨率的掩膜（图1B）。在本研究中，制备了一块5英寸的铬掩膜，用于SU-8晶圆光刻。最终的硅-SU-8晶圆用于PDMS复制成型（图1D）。经过烘烤步骤后，将PDMS块切割成芯片，并永久键合到玻璃载玻片上（图1E）。最后连接管路（图1F）。
图2 详细展示了微流控系统的设计。该系统包含两个接种入口、一个用于混合不同底物或培养基的浓度梯度发生器，以及一个出口。主通道的尺寸为 50 µm × 10 µm（宽 × 高）。每个装置由六个 PLBR 阵列组成，每个阵列包含 5 个 PLBR，因此在一个微流控装置内可实现 30 个并行反应器。
图3展示了复制母模的制备过程。如实验方案中详细所述，通过SU-8光刻工艺制备第一层SU-8结构（图3A）。第二层的制备采用类似步骤（图3B）。为检测通道几何形貌，我们使用轮廓仪测量了PLBRs和主通道的高度。在图3C所示示例中，测量的是第一层（即培养层）。该层厚度均一，为1,200 nm，适用于在BHI培养基中培养C. glutamicum。
图4展示了PDMS模具制作流程，起始于PDMS混合（图4A），随后进行模具成型过程（图4B），最后是键合步骤（图4C）。图4D显示了最终的微流控芯片，包含170 µm厚的玻璃片、带有进样口和出样口的PDMS芯片（高度为3 mm）以及连接到管路的钢针。实验结束后，芯片可直接丢弃，无需复杂的清洗步骤。此外，该芯片易于组装和操作，无需复杂且困难的填充程序。
设备原理
图5展示了反应器系统的工作原理。细胞被注入微流控装置后，仅通过细胞与通道壁的相互作用，单个细胞即被截留在PLBR内部。由于通道与PLBR之间存在流体动力学阻力差异，PLBR内部仅有极微弱的流动。在完成PLBR的接种（图5A）后，通过将细菌溶液更换为生长培养基，启动细胞生长与观察阶段（图5B）。当PLBR内细胞过度生长后（图5C），实验通常终止，此时可对延时成像图像进行分析。有关PLBR内的截留机制及流场分布，读者可参考Grünberger et al.13 获取更多细节。
生长速率分析
该系统可用于研究多种细菌物种在不同生物学参数下的表现，例如生长、形态或荧光信号。在第一个示例中，C. glutamicum（一种具有工业应用价值的生产菌）在标准培养条件下（T=30 °C，CGXII 培养基21）进行培养。图6A展示了来自三个同基因型微菌落的生长曲线。指数生长持续至微流控培养室（PLBRs）被完全填满，表明未发生营养限制。图6B展示了生长中的C. glutamicum菌落的四幅微分干涉差（DIC）延时显微图像。
荧光分析
在单细胞荧光显微镜研究中，研究人员通常使用特定的荧光蛋白（例如GFP或其衍生物），将感兴趣的特定表型与可测量的输出信号（即荧光信号）相偶联。为了验证PBLR在基于荧光的时间序列研究中的适用性，我们检测了一株C. glutamicum菌株的荧光发射情况，该菌株在Ptac启动子控制下表达质粒编码的YFP-TetR融合蛋白（pEKEx2-yfp-tetR）18,22。已知在低浓度诱导剂（IPTG）存在时，Ptac启动子的表达会导致同基因型细菌群体中出现显著的细胞间差异。我们从一个前培养物开始，对多个同基因型微菌落的生长及单细胞荧光进行了追踪。如图7所示，我们观察到不同微菌落之间的表型异质性，以及由同一个母细胞起源的菌落内部的单细胞水平异质性。其中一个菌落（图7B，PBLR 1）几乎未检测到荧光发射，而PBLR 2中的细胞由于Ptac启动子驱动的yfp-tetR基础表达，表现出较低的荧光信号。相比之下，PBLR 3的荧光发射强度明显更强，且群体分布范围更广。此实例表明PBLR适用于时间序列荧光显微成像研究。与仅能在单一时间点测定单个细胞荧光的流式细胞术相比，本系统可实现对细胞的长期追踪，并能够实时研究多代过程中单细胞的荧光动态变化。
<img alt="包含设计、掩模、晶圆、成型、键合和组装阶段的微芯片生产流程图。" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50560/50560fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50560/50560fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 1"> 
图 1. PLBR芯片生产流程概述。母模制备：从（A）设计、（B）光刻掩模制备，到（C）晶圆制备。PDMS-玻璃芯片制备：从（D）PDMS成型，到（E）玻璃与PDMS键合，再到（F）芯片最终组装。
<img alt="用于细胞分离与分析研究的微流控芯片示意图，标注了流道。" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50560/50560fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50560/50560fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 2"> 
图 2. PLBR 芯片的设计。（A）整个微流控芯片的 CAD 图；（B）选定布局位置的放大图：该布局包含两个培养基入口（a1）、一个带有混合通道的梯度发生器（a2）以及 6 个并行的 PLBR 阵列（b1）。b2 展示了一个 PLBR，其嵌入宽度为 100 µm 的流体通道中。PLBR 的内径为 40 µm，营养通道宽度为 2 µm。接种入口的长度为 40 µm。粉色表示第一层（捕获与培养区域），蓝色表示第二层（流体传输）。
<img alt="SU-8 光刻工艺步骤及高度测量结果的微加工工艺示意图。" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50560/50560fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50560/50560fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 3"> 
图 3. 双层晶圆 fabrication 工艺示意图。 （A）包含捕获结构的第一层的制备；（B）包含流体通道、入口和出口的第二层的制备；（C）第一层的典型表面轮廓。本例中，第一层的高度为 1,200 nm，用于在复杂培养基中培养 C. glutamicum。
<img alt="PDMS 模塑过程示意图；包含 SU8、PDMS、玻璃层的微流控芯片结构；入口/出口。" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50560/50560fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50560/50560fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 4"> 
图 4. 器件制备及代表性芯片。PDMS 模塑过程示意图：(A) PDMS 混合与脱气；(B) PDMS 模塑；(C) 脱模、切割与芯片键合。最终芯片（经英国皇家化学学会许可转载13）：(D) 具有两个入口和一个出口的 PDMS 芯片照片；(E) 包含六个平行阵列、每个阵列含 5 个 PLBR 的 CAD 图像；(F) 一个 PLBR 的扫描电镜（SEM）图像。
<img alt="Bacterial growth in microfluidic device; laminar flow channels; PDMS setup; overflow and feed channels." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50560/50560fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50560/50560fig5.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 5"> 
图5. PLBR系统的工作原理。 (A) 接种阶段；(B）细菌微菌落的生长阶段；（C溢流阶段。经英国皇家化学学会许可转载。 <a href="http://dx.doi.org/10.1039/C2LC40156H">http://dx.doi.org/10.1039/C2LC40156H</a>.
<img alt="Cell growth chart with microbial microscopy images; equations for growth rate analysis and results." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50560/50560fig6highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50560/50560fig6.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 6"> 
图6. 生长速率测定 C. glutamicum 野生型微菌落. (A三种PLBR培养物的生长曲线及拟合所得的指数生长曲线（部分内容经英国皇家化学学会许可复制）13。 <a href="http://dx.doi.org/10.1039/C2LC40156H">http://dx.doi.org/10.1039/C2LC40156H</a>. (B延时拍摄的生长过程图像 C. glutamicum 菌落
<img alt="显示荧光数据的微生物培养过程示意图；实验展示细胞生长与分析。" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50560/50560fig7highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50560/50560fig7.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 7"> 
图 7. 基于 PBLR 的群体异质性分析。 图示为在无诱导剂 IPTG 的条件下，C. glutamicum 在 Ptac 启动子控制下表达 yfp-tetR 融合蛋白（pEKEx2-yfp-tetR）。(A) 实验流程；(B) 三个同基因型微菌落，显示菌落间异质性及细胞间异质性；(C) 各微菌落内单细胞荧光强度的分布情况。
<img alt="用于材料分析的具有不同接种入口的微结构的显微镜图像。" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50560/50560fig8highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50560/50560fig8.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图8"> 
图8. 不同PLBR的扫描电子显微图像。 SEM图像显示了用于优化捕获效率的接种入口。（A）较大的接种入口（B）较小的接种入口（C）更大的“开放”接种入口（D）两个接种入口。
<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1276">
	<colgroup>
		<col span="4">
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td>步骤</td>
			<td>问题</td>
			<td>可能原因</td>
			<td>解决方案</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">晶圆制备</td>
			<td>SU-8 软烘过程中出现气泡滞留</td>
			<td>升温过快</td>
			<td>在 95 °C 和 65 °C 下多次烘烤</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">晶圆制备</td>
			<td>SU-8 结构消失或断裂</td>
			<td>制备工艺不理想；SU-8 结构中存在机械应力</td>
			<td>优化参数，如烘烤时间、曝光时间</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">晶圆制备</td>
			<td>SU-8 层过薄、过厚或厚度不均</td>
			<td>旋涂过程中出现问题</td>
			<td>检查旋涂仪参数和晶圆卡盘</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">芯片键合与组装</td>
			<td>PLBRs 塌陷</td>
			<td>PDMS 键合参数不理想</td>
			<td>调整功率、等离子体处理时间以及键合后的烘烤时间</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">芯片键合与组装</td>
			<td>PLBRs 内结构污染或存在颗粒</td>
			<td>芯片未彻底清洁</td>
			<td>使用透明胶带进行表面清洁</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">芯片键合与组装</td>
			<td>PDMS-玻璃键合不充分</td>
			<td>键合参数不理想或清洁不充分</td>
			<td>检查氧气等离子体设置</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">微流控实验</td>
			<td>液体泄漏</td>
			<td>进样/出样孔未正确打孔</td>
			<td>优化打孔工艺</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">微流控实验</td>
			<td>填充过程中产生大量微小 PDMS 颗粒</td>
			<td>打孔不正确</td>
			<td>优化打孔工艺</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">微流控实验，生物学方面</td>
			<td>无细胞生长</td>
			<td>清洗过程残留溶剂</td>
			<td>在接种细胞前更充分地冲洗芯片，或在键合前让溶剂充分挥发</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">微流控实验，生物学方面</td>
			<td>生长速率变化</td>
			<td>多种原因</td>
			<td>检查前培养条件和温度</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">微流控实验，生物学方面</td>
			<td>培养过程中细胞形态改变</td>
			<td>营养限制或温度变化</td>
			<td>检查培养箱和流体流动</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">微流控实验，技术方面</td>
			<td>延时显微成像过程中位置漂移</td>
			<td>温度波动</td>
			<td>实验前检查温度曲线，直至无振荡</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">微流控实验，技术方面</td>
			<td>培养过程中细胞丢失</td>
			<td>反应器高度略高</td>
			<td>优化反应器高度</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">微流控实验，技术方面</td>
			<td>无捕获现象</td>
			<td>反应器高度过低</td>
			<td>优化反应器高度</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1. 故障排除。 本表总结了实验过程中需要注意的关键要点、常见错误及可能的解决方案。

本方案介绍了用于原核微生物单细胞分析的微流控皮升级生物反应器（PLBR）的制备、装置搭建及基本操作。作为原理验证，对具有工业相关性的微生物进行了分析，从而获得了在特定时间段内的生长速率、形态特征及表型异质性等方面的深入信息，而这些信息采用传统方法极难实现。

在本方案中，介绍了新近推出的皮升级微流控生物反应器（PLBR）的制备、实验装置及基本操作……

本实验的总体目标是利用微流控培养装置，在环境条件恒定的情况下，对单个细菌及其演化的同基因微菌落进行具有完整空间和时间分辨率的分析。首先通过计算机辅助设计（CAD）软件设计微流控培养系统，随后采用聚二甲基硅氧烷（PDMS）制备一次性微流控培养装置，该装置包含皮升级生物反应器，其高度为一微米，以限制细菌生长为单层结构。将微生物培养物注入微流控装置，以在生物反应器内接种单个母细胞。通过系统持续灌注培养基使细胞扩增。通过自动化的延时显微成像获得结果，展示了工业相关谷氨酸棒杆菌菌株的培养过程、生长数据以及细胞间的异质性。在传统的生物技术中，大多数分析基于平均数据。我们的微流控设备能够以空间和时间分辨率为单个细菌进行单细胞分析。该设备是深入研究同基因型微菌落中细胞间异质性的有力工具。我们采用常规的SU-8光刻技术和聚二甲基硅氧烷（PDMS）芯片模塑工艺，制造具有亚微米培养基分辨率的一次性微流控装置。我们已成功将该技术应用于多种生物技术微生物，如大肠杆菌（Escheria coli）和谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）。首先，使用CAD软件设计微流控装置。本方案中描述的设计包含两个接种入口、一个用于混合两种不同底物的浓度梯度发生器、一个出口，以及由六个阵列组成的结构，每个阵列包含五个生物反应器。在洁净室中，准备一片四英寸的硅片，并按照配套文本方案中的描述，通过旋涂法在硅片上涂覆一层厚度为一微米的 SU-8 2000.5 光刻胶。将涂覆后的硅片置于 95 摄氏度的加热板上，以去除多余的溶剂，随后将包含皮升反应器捕获区域的第一层光掩模与涂覆后的硅片一同插入掩模对准仪中。然后，将晶圆置于真空接触模式下，用波长为350至400纳米的光照射3秒，光强为7毫瓦每平方厘米。在水平的热板上进行曝光后烘烤，温度为95摄氏度，以启动SU-8的聚合反应。接着，将晶圆放入SU-8显影液中浸泡1分钟，然后将晶圆转移至另一含有新鲜SU-8显影液的容器中，继续显影数秒。用异丙醇冲洗晶圆以去除SU-8显影液，并使用氮气流或晶圆甩干机将晶圆干燥。然后在150摄氏度下进行坚膜烘烤10分钟。接下来，按照随附的文字实验方案制备第二层，以完成模具母版的制作。以10比1的比例混合PDMS基液与固化剂，开始PDMS芯片的制备。将混合后的PDMS溶液置于真空干燥器中脱气约30分钟，直至所有气泡完全消失。接着，将SU-8晶圆放入模具装置中，并在晶圆表面浇注一层厚度为3毫米的PDMS混合液。然后，将PDMS置于80摄氏度的烘箱中烘烤3小时。待其冷却后，小心地将PDMS块从硅片上剥离，并使用洁净锋利的手术刀将PDMS块切割成单个芯片。将芯片在正戊烷浴中清洗90分钟，随后分别用丙酮清洗液洗涤两次，每次90分钟。将芯片过夜干燥以去除任何溶剂残留。在实验开始前，使用针头或打孔器在PDMS芯片上打出入水口和出水口，打孔所用针头或打孔器的直径应略小于用于连接管路与PDMS芯片的接头。接着，用异丙醇小心清洗微流控PDMS芯片，并使用透明胶带去除附着的灰尘颗粒。此外，先用丙酮、再用异丙醇、然后用去离子水依次清洗厚度为170微米的玻片，最后用氮气流吹干。待玻片清洁并干燥后，使用50瓦功率和20 sccm的氧气流速对玻片和PDMS芯片进行25秒的等离子体氧化处理。随后，在将PDMS芯片放置到玻片上之前，仔细对准两者，使其在数秒内完成键合。在80摄氏度下烘烤装置10秒以加固键合。为准备芯片实验用的细菌，挑取一株所需菌株（如谷氨酸棒杆菌）的单菌落接种于20毫升新鲜BHI培养基中，在30摄氏度、120 RPM的摇床中过夜培养。次日早晨，取10微升预培养物转接到含20毫升相应培养基的第二轮培养中，并在相同条件下过夜培养细胞。第二天，将倒置显微镜的培养箱预热至30摄氏度。根据具体设备的不同，此过程可能需要长达两个小时。在设备升温的同时，打开培养箱，选择所需的物镜，并使用任何必要的封片介质进行准备。然后，将芯片安装到芯片支架内并固定。将样品置于显微镜下居中，并聚焦至皮升级生物反应器阵列。芯片聚焦后，使用合适的管路连接入口和出口，然后将出口管路放入废液储槽中。接着，用新鲜培养基填充一个注射器，将其放入注射泵中，并以每分钟200纳升的流速冲洗微流控通道一小时，以充分润洗芯片。当细胞仍处于对数生长期初期时，将1毫升细菌培养物转移至无菌注射器中，并更换含有培养基的注射器和管路，代之以细胞悬液和新的管路。以每分钟200纳升的体积流速将细胞悬液注入通道，直至大多数皮升级生物反应器被填满。如果仅填充少量生物反应器，则将流速提高至800至1200纳升每分钟。当接种的细胞数量达到预期后，断开细胞悬液，重新连接培养基至芯片，并以100纳升每分钟的速度灌注新鲜培养基。接下来，扫描芯片并选择特定的生物反应器进行延时成像。然后，设置一个延时显微成像序列，以对生物反应器从实验开始至结束进行全程成像，并启动实验。当所有皮升级生物反应器中的细胞均生长过量后，停止实验并妥善丢弃芯片。开始分析前，首先确定哪些生物反应器满足实验所需的全部标准，例如母细胞的数量和位置。使用图像分析软件（如 ImageJ），通过计数每个时间点的细胞数量来确定各个微菌落的生长速率。通过绘制时间与细胞数量对数值的关系图，计算最大生长速率。本研究所展示的系统可用于针对不同生物学参数（如生长、形态或荧光信号）分析多种细菌物种。在此示例中，谷氨酸棒状杆菌（C. glutamicum）在标准培养条件下培养，并展示了由三个同基因型微菌落获得的生长曲线。皮升级生物反应器还被证明可用于通过时间延时荧光显微镜研究蛋白质的表达，如图所示。通过向细胞施加低浓度的蛋白质诱导剂IPTG，可从单个母细胞开始的菌落中，在单细胞水平上研究细胞间蛋白质表达的差异性。本演示技术可用于在完全可控的环境中监测和分析单个细菌细胞，而这是传统台式培养系统难以实现的。观看本视频后，您应能够充分了解如何制备微流控培养芯片，以进行可比较的单细胞分析。

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