用于微生物单细胞分析的微流控 Picoliter 生物反应器：制造、系统设置和作

该程序的总体目标是使用微流体培养装置在恒定环境条件下以完全空间和时间分辨率分析单个细菌和进化的同基因微菌落。这是通过首先使用 CAD 软件设计微流体培养系统来实现的。接下来，用聚二甲基硅氧烷制造一次性微流体培养装置，其中包含皮升生物反应器，1 微米和高度以限制细菌单层生长。

然后将微生物培养物注入微流控装置中，以接种生物反应器内的单个母细胞。这些细胞通过系统连续输注生长培养基来扩增。结果来自自动延时显微镜，显示了工业相关的谷氨酸棒状杆菌菌株的培养、生长数据和细胞间异质性。

在传统的生物技术中，大多数分析都基于平均数据。我们的微流体设备有助于以空间和时间分辨率对单个细菌进行单细胞分析。它是近距离观察同基因微菌落的细胞间异质性的有用工具。

我们应用常见的 SU-8 光刻和聚二甲基硅氧烷芯片成型来制造具有亚微介质分辨率的一次性微流体设备。我们已经成功地用几种生物技术微生物（如大肠杆菌和谷氨酸棒状杆菌）展示了我们的技术。首先，使用 CAD 软件设计微流体设备。

该方案中提出的设计包括两个接种入口、一个用于混合两种不同底物的梯度发生器、一个出口和六个阵列，每个阵列由五个生物反应器组成。在洁净室中，准备一个 4 英寸的硅晶片，并将 1 微米的 SU-8 2000.5 光刻胶旋码到晶片上，如随附文本协议中所述。将涂层晶圆放在 95 摄氏度的热板上以去除多余的溶剂，然后将由皮升反应器的捕获区域和掩模对准器内的涂层晶圆组成的第一层光掩模插入。

然后，以每平方厘米 7 毫瓦的强度，将真空接触模式下的晶圆暴露在 350 至 400 纳米光下 3 秒钟。在 95 摄氏度的水平热板上进行曝光后烘烤，以引发 SU-8 的聚合。接下来，将晶片放入 SU-8 显影液槽中 1 分钟，然后将晶片转移到装有新鲜 SU-8 显影液的第二个容器中几秒钟。

用异丙醇冲洗晶片以去除 SU-8 显影剂，并使用氮气流或晶片旋转器干燥晶片。然后，在 150 摄氏度下将晶圆硬烤 10 分钟。接下来，按照随附的文本协议中的说明制造第二层，以完成母模。

通过将碱剂和载体剂以 10：1 的比例混合来开始 PDMS 芯片制造。在真空干燥器中对 PDMS 混合物进行脱气约 30 分钟，直到所有气泡消失。接下来，将 SU-8 晶圆放入成型装置中，并将 3 毫米厚的 PDMS 混合物倒入晶圆上。

然后，在烤箱中以 80 摄氏度烘烤 PDMS 三个小时。冷却后，小心地从晶圆上剥离 PDMS 板，并使用干净锋利的手术刀将板切割成单个芯片。在正戊烷浴中清洗薯片 90 分钟，然后用两个丙酮清洗浴，每次 90 分钟。

将木片干燥过夜以去除任何溶剂残留物。在实验之前，使用针头或打孔器将入口和出口孔打入 PDMS 芯片中，该针头或打孔器的直径略小于用于连接 PDMS 芯片的管道的连接器。接下来，用异丙醇仔细清洁微流体 PDMS 芯片，并使用透明胶带去除任何粘附的灰尘颗粒。

此外，先用丙酮清洁 170 微米薄的载玻片，然后用异丙醇清洁，然后用去离子水清洁载玻片，然后用氮气流干燥载玻片。清洁并干燥后，等离子体使用 50 瓦的功率和 20 sccm 的氧气流速将载玻片和 PDMS 芯片氧化 25 秒。然后，在将 PDMS 放到玻璃上之前，小心地对齐 PDMS 和玻璃芯片，这将使其在几秒钟内粘合。

通过在 10 摄氏度下烘烤 80 秒来固定粘合。为了准备用于 ChIP 实验的细菌，将所需细菌菌株（如 C.glutamicum）的单个菌落接种到 20 mL新鲜的 BHI 培养基中，并在 30 摄氏度下在旋转振荡器上以 120 RPM 的温度孵育培养物过夜。第二天早上，将 10 μL 发酵剂培养物转移到含有 20 mL所需培养基的第二种培养物中，让细胞在相同条件下生长过夜。

第二天，将倒置显微镜的培养箱预热至 30 摄氏度。这可能需要长达两个小时，具体取决于各个设置。当设置加热时，打开培养箱并选择所需的物镜，并使用任何所需的封固剂进行制备。

然后，将芯片安装在芯片座内并将其固定到位。将样品放在显微镜的中心，并聚焦到皮升生物反应器阵列中。聚焦芯片后，用适当的管路连接入口和出口，然后将出口管路放入废液容器中。

接下来，用新鲜介质填充注射器，将其放入注射泵中，并以每分钟 200 纳升的流速冲洗微流体通道 1 小时以灌注芯片。当细胞仍处于早期指数生长期时，将 1 毫升细菌培养物转移到无菌注射器中，并用细胞悬液和新鲜管更换含有培养基的注射器和管道。以每分钟 200 纳升的体积流速将细胞悬液注入通道中，直到大部分皮升生物反应器装满。

如果只填充少量生物反应器，则将流速增加到每分钟 800 至 1200 纳升。当接种所需量的细胞后，断开细胞悬液，将生长培养基重新连接到芯片上，并以每分钟 100 纳升的速度灌注新鲜培养基。接下来，扫描芯片并选择特定的生物反应器进行延时成像。

然后，配置延时显微镜序列，以便从头到尾对生物反应器进行成像并开始实验。一旦所有皮升生物反应器都杂草丛生，停止实验并适当丢弃芯片。要开始分析，首先，确定哪些生物反应器满足实验的所有所需标准，例如母细胞的数量和位置。

使用分析程序（如图像 J），通过计算每个时间点的细胞数来确定每个微菌落的生长速率。通过绘制时间与细胞数对数的关系来计算最大生长速率。这里介绍的系统可用于研究各种细菌种类的不同生物参数，例如生长、形态或荧光信号。

在这个例子中，C.glutamicum 在标准培养条件下培养，这里显示了来自三个同基因微菌落的结果生长曲线。皮升生物反应器也被证明可用于通过使用延时荧光显微镜进行蛋白质生产，如图所示。通过将细胞暴露于低浓度的蛋白质诱导剂 IPTG 中，可以在从单个母细胞开始的菌落内的单细胞水平上研究蛋白质的细胞间变异。

所展示的技术可用于监测和分析具有完美环境控制的单个细菌细胞。使用传统的台式培养系统几乎不可能做到这一点。观看此视频后，您应该对如何制备微流控培养芯片以进行类似的单细胞分析有很好的了解。