微流体装置与Groove的模式，为研究细胞行为

我叫Jiang，是哈佛大学和麻省理工学院健康科学与技术项目的博士后研究员。我在本实验室的专业领域是开发新型的微流控预测装置，用于研究细胞行为。我能够设计出非常新颖的浓度梯度装置，同时也能够将这些功能整合到我的微流控预测装置中。

TC设备能够精确操控细胞-细胞相互作用、细胞相互作用以及细胞与生长因子的接触。因此，利用TC系统，我可以研究并理解基础细胞生物学，同时应用于发育生物学以及生物工程和干细胞生物工程领域。我叫Amir Manchi，是哈佛大学-麻省理工学院健康科学与技术部Haan实验室的本科学生。

我一直在研究微流控设备，我们尝试以概念验证的方式证明微流控设备在细胞培养以及毒性研究等不同研究中具有巨大的应用潜力。此外，我们还尝试研究并优化这些设备内部的流体特性，以考察其随流速、几何结构及其他各种参数的变化情况。目前，我们正从微加工实验室开始工作，接下来要制作一些微流控设备。为了实现微流控设备的制备，我们需要一些带有图案的硅晶圆，以及在其上方制备的PDMS模具。这种PDMS聚合物实际上是由两种不同组分混合而成的。

它由硅胶弹性体基础剂和硅胶弹性体固化剂混合而成。这两种组分的混合比例为10:1，即10份基础剂与1份固化剂。现在我需要取大约20克的基础剂。

我还需要两克固化剂，而固化剂的密度要小得多，取用时会流得更快，因此我必须稍微小心一些。现在大约为22克，接下来我要将基质与固化剂混合在一起。

因此，我将使用移液管来完成此操作。我会尽可能充分地混合均匀。接下来，我想将这种PDMS聚合物倒在带有图案的硅片上，硅片可帮助PDMS模具形成相应的图案。

实际上，您可以看到我这里有两片硅片，原因是其中一片用于我们微流控装置的顶层，另一片用于底层。微流控装置需要两层结构，因为我们要在内部形成通道，而微流控装置的核心原理是让液体在这些通道内流动。因此，我需要将这种混合物倒在两片硅片的表面，因为该混合物内部存在大量气泡。

我想去除这些气泡，为此我们使用真空环境来排除这些气泡。我们现在回到主实验区域，正如我之前提到的，PDMS 混合物内部含有大量气泡，我们需要将其去除。我会将混合物放置在真空腔室内的硅晶片上方，然后关闭腔室，并启动真空泵。完成抽真空后，我们会将 PDMS 模具放入烘箱中过夜，使其更加固化。

好了，我们现在在实验室，准备组装这些微米级叶酸装置。首先，我们需要取出已在培养箱中放置过夜的PDMS模具，这些模具已经成型，并复制了硅晶圆上的图案。我将使用两种不同的图案：左侧您可以看到的是微通道，将作为顶层；右侧您看到的一些绿色线条图案，将作为底层。

这一步将形成微装置内部的凹槽结构。我首先开始切割这些凝胶，以便获得顶层，使其能够轻松地从硅片上分离。接下来，我会将凝胶正面朝上转移到这些培养皿中，使图案面朝上。

接下来，我将对沟槽部分（即绿色线条图案）进行相同的操作，这些部分将构成底层。因此，在凝胶切割完成后，我将把其转移至佩特里培养皿中，并为了防止灰尘落在图案表面，我将用胶带将其覆盖。

下一步是在通道的两端打孔，以便细胞和培养基能够流入和流出。由于此处表面较宽，我无法清晰看到微通道的图案，因此我将借助这个工具来观察通道位置，然后在两端进行打孔。我将在这一端打一个较大的孔，以便留有足够的余量；而在另一端则打一个较小的孔，以便能够连接聚乙烯导管。

我们现在位于微加工实验室，下一步是将之前制备的两种不同表面进行粘合。为此，需要使用这台名为等离子清洗机的设备，该过程称为等离子处理。在腔室内发生的情况是：将形成一个等离子体环境，在等离子体与表面相互作用的过程中，等离子体会破坏表面原有的弱结合状态，并将其替换为高反应活性的化学基团。

接下来，我将取出为防尘而放置在此处的胶带，并将这些模具放入腔室内。然后完全关闭这扇门，先开启电源，再启动泵，之后即可开始运行。我们将在5到10分钟后继续下一步。

现在我要关闭它，因此先关闭泵和电源，然后打开腔室。实际上这里存在负压，所以你可能会听到声音。这就是由于负压造成的，因此我要缓慢地将模具取出。

由于两个图案表面均朝上，我将取底部这一层，放在左手，再取顶部这一层，将其翻转后放置在沟槽上方，然后将两层相互推合。使用这种等离子体处理设备的优势在于其粘合强度高且持久。您现在看到的是，顶部这一层上可以清晰观察到通道，底部这一层上则可见沟槽图案，已为下一步操作做好准备。

然后将此培养室、此培养基带入，并打开培养皿。接着即可加入纤连蛋白，取出60 µL的纤连蛋白，加载至装置中。随后可通过轻轻抽吸出口，在装置内部产生一定流速，以诱导通道内表面形成均匀的薄层涂层。

此后，将该装置放入培养箱中，在培养箱内振动冷却一小时。一小时后，从培养箱中取出样品，使用五根锈线、三根三股锈线进行融合处理，并置于培养基中，然后使用细胞计数器进行细胞计数。

我们通常将约百万个细胞置于设备内部进行培养。因此，在消化解离后，只需用培养基清洗一到两次，然后取出细胞悬液，再将细胞悬液注入通道内部，以实现细胞在通道内的良好加载。操作时可使用移液器轻柔地抽吸推动液体流动。

总培养基和表面悬浮液通过出口细胞通常会自动接种到选择性通道和全局通道中。之后，我们只需拆卸装置并将其放入培养箱中孵育一小时，直至细胞在通道内完全铺展。随后，我们可灌注Annexin V、碘化丙啶以及过氧化氢。

然后进行时间假设检测。我们可以取样品放入组织培养皿中，然后配制含有2 mM DMM培养基、20 µL Annexin V、40 µL 碘化丙啶和100 mM 过氧化氢的溶液。接着将含有Annexin V、碘化丙啶和过氧化氢的2 mL培养基混合液吸入注射器中备用。

加入两毫升培养基和五微升碘化丙啶、过氧化氢。可将溶液直接加入顶空瓶中，然后去除气泡，再连接C瓶。此顶空瓶为密封性良好的汉密尔顿进样瓶。

这个是三号熊。这个是一次性天花板。这个是27号针头。

这根是PE 20聚乙烯管。将溶液装入注射器后，只需完全推动活塞，反复推几次，有时轻敲一下注射器尖端，以去除气泡，同时回抽溶液。再重复一次：完全推动活塞，去除气泡，然后轻轻重新装填溶液。

因此，取一份餐用溶液，然后我们可以切换阀门。推动溶液，使其通过三通阀并完全进入管路中。最终溶液将从管路末端流出，随后我们只需将管路连接至微流控装置，并以每分钟1微升的速度开始灌注。