Name: 微流体装置与Groove的模式，为研究细胞行为 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-08-30T00:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 50 s
Description: 学习微流控装置制造方法，利用图案化微结构创建低剪切应力区域，实现细胞捕获与培养。该技术可精确操控细胞相互作用，推动细胞生物学与生物工程研究发展。

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A. 微流控装置的微加工
<ol>
<li>将4英寸硅片用反应性氧等离子体处理（30 W，5分钟，Harrick Scientific，纽约）。</li>
<li>在硅片上以900 rpm转速旋涂负性光刻胶（SU-8 2015，Microchem，马萨诸塞州），持续1分钟。</li>
<li>将硅片置于热板上于95°C预烘6分钟，并通过含有微通道的掩膜版用紫外光（200 W）曝光4分钟。</li>
<li>硅片在95°C后烘6分钟，并使用SU-8光刻胶显影液进行显影。</li>
<li>含有微通道图案的光刻胶图形化硅片被放置于培养皿中。</li>
<li>聚二甲基硅氧烷（PDMS）（Sylgard 184）模具通过混合硅弹性体与固化剂（10:1比例）制备。</li>
<li>将PDMS混合物倒入硅主模具上，并置于真空干燥器中以去除气泡。</li>
<li>PDMS在70°C下固化1~2小时。</li>
<li>随后将PDMS模具从硅主模具上剥离下来。</li>
</ol>
B. 组装装置
<ol>
<li>通过两个不同的硅质母模，分别获得40 µm厚的顶部流体通道和40 µm厚的底部微沟槽通道（宽度分别为25、50、75和100 μm）。</li>
<li>对微流控装置的流道入口和出口进行打孔处理。</li>
<li>使用反应性氧等离子体（30W，5分钟，Harrick Scientific，NY）将流体通道与微沟槽通道进行不可逆键合。</li>
<li>在培养箱（37°C）中孵育1小时，将细胞外基质（ECM）（如纤连蛋白）包被于微流控装置内部。</li>
</ol>
C. 细胞接种与实验设置
<ol>
<li>使用含10%胎牛血清（FBS）的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM），在组织培养瓶中培养NIH-3T3小鼠成纤维细胞。</li>
<li>用胰蛋白酶消化并解离细胞。</li>
<li>将解离后的细胞以3×106个细胞/ml的密度接种至微沟槽通道中（图1）。 <img src="/files/ftp_upload/old/270_2008_8_24_3/270_Figure-01.png" alt="微流控细胞培养；键合、细胞外基质包被、细胞接种步骤；组织工程示意图。" width="191" height="300" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图1">     图1 </li>
<li>使用注射泵（1 µl/min）将2 mL培养基、100 mM H2O2以及凋亡检测试剂（20 µL Annexin V和40 µL碘化丙啶，Invitrogen，CA）注入通道中。</li>
<li>使用倒置显微镜（Nikon TE 2000）对细胞进行实时监测。</li>
</ol>

<ol><li>Chung, B. G., Park, J. W., Hu, J. S., Huang, C., Monuki, E. S., Jeon, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+hybrid+microfluidic-vacuum+device+for+interfacing+with+conventional+cell+culture+platform%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A hybrid microfluidic-vacuum device for interfacing with conventional cell culture platform.</a> BMC Biotechnol. 7, (2007).</li>
<li>Khademhosseini, A., Yeh, J., Eng, G., Karp, J., Kaji, H., Borenstein, J., Farokhzad, O. C., Langer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+docking+inside+microwells+within+reversibly+sealed+microfluidic+channels+for+fabricating+multiphenotype+cell+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Cell docking inside microwells within reversibly sealed microfluidic channels for fabricating multiphenotype cell arrays.</a> Lab Chip. 5, 1380-1386 (2005).</li>
<li>Whittemore, E. R., Loo, D. T., Watt, J. A., Cotman, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+detailed+analysis+of+hydrogen+peroxide-induced+cell+death+in+primary+neuronal+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">A detailed analysis of hydrogen peroxide-induced cell death in primary neuronal culture.</a> Neuroscience. 67, 921-932 (1995).</li>
</ol>

细胞在微流控装置内的微沟槽基底中被固定并形成特定排列。通过使用Annexin V和碘化丙啶，实时观察并分析了暴露于过氧化氢的细胞的凋亡过程。因此，这种含有微沟槽通道的微流控装置可用于高通量药物筛选。

<table><tbody><tr><td>PDMS</td><td>试剂</td><td>K.R. Anderson Co.</td><td>2065622</td><td>聚二甲基硅氧烷，Dow Corning Sylgard 184（8.6 磅）</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>培养基</td><td>Invitrogen</td><td>11965</td><td>Dulbecco&amp;rsquo;s 修饰 Eagle&amp;rsquo;s 培养基 </td></tr><tr><td>FBS</td><td>血清</td><td>Invitrogen</td><td>10082-147</td><td>胎牛血清</td></tr><tr><td>过氧化氢</td><td>试剂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H1009</td><td></td></tr><tr><td>细胞凋亡检测试剂盒</td><td></td><td>Invitrogen</td><td>V13242</td><td>Annexin A，碘化丙啶</td></tr><tr><td>负性光刻胶</td><td></td><td>MicroChem Corp.</td><td>SU-8 2015</td><td></td></tr><tr><td>硅晶圆</td><td>工具</td><td></td><td></td><td>4 英寸硅晶圆</td></tr><tr><td>反应性氧等离子体</td><td>试剂</td><td>Harrick Scientific Products, Inc.</td><td></td><td>在 30 W 条件下处理晶圆 5 分钟</td></tr><tr><td>倒置显微镜</td><td>工具</td><td>Nikon Instruments</td><td>TE 2000</td><td></td></tr></tbody></table>

一种带沟槽图案的微流控装置用于研究细胞行为

A Microfluidic Device with Groove Patterns for Studying Cellular Behavior

我们描述了一种带有微沟槽结构的微流控装置，用于研究细胞行为。该微流控平台由上方的流体通道和下方的微沟槽基底组成。为了制备微沟槽通道，将含有微流控通道印模的上层聚二甲基硅氧烷（PDMS）模具与微沟槽基底对准并键合。利用该装置，小鼠成纤维细胞被固定并排列在不同宽度（25、50、75 和 100 μm）的微沟槽基底中。为在微流控装置中研究细胞凋亡，将含有过氧化氢、Annexin V 和碘化丙啶的培养基灌注到流体通道中，持续 2 小时。我们发现，暴露于氧化应激的细胞发生凋亡。这些凋亡细胞通过 Annexin V 得到确认，因为 Annexin V 可在凋亡过程中结合到细胞质膜外小叶的磷脂酰丝氨酸上。利用带有微沟槽结构的微流控装置，可在含孵育腔（37°C，5% CO2）的倒置显微镜下实时观察并分析细胞凋亡过程。因此，这种集成微沟槽基底的微流控装置可用于研究细胞行为以及进行高通量药物筛选。

我们描述了一种用于制备微流控装置的方案，该装置可实现细胞捕获与培养。在此方法中，通过在微流控通道内设计具有特定图案的微结构（如沟槽），以形成低剪切应力区域，从而使细胞能够在其中停靠。

我们介绍一种带有微沟槽图案的微流控装置，用于研究细胞行为。该微流控平台由顶部流体通道……

我叫Jiang，是哈佛大学和麻省理工学院健康科学与技术项目的博士后研究员。我在本实验室的专业方向是开发新型的微流控预测装置，用于研究细胞行为。我能够设计出非常新颖的梯度发生装置，同时也能够将其集成到我的微流控预测装置中。TC设备能够精确操控细胞-细胞相互作用、细胞相互作用以及细胞与生长因子的接触。因此，利用TC系统，我可以研究并理解基础细胞生物学，同时应用于发育生物学以及生物工程和干细胞生物工程领域。我叫Amir Manchi，是哈佛大学-麻省理工学院健康科学与技术部Haan实验室的本科学生。我一直在研究微流控设备，我们尝试以概念验证的方式证明微流控设备在细胞培养以及毒性研究等不同研究中具有巨大的应用潜力。此外，我们还尝试研究并优化这些设备内部的流体特性，以分析其与流速、几何结构及其他各种参数之间的关系。目前，我们正从微加工实验室开始工作，接下来要制作一些微流控设备。为了实现微流控设备的制备，我们需要一些带有特定图案的硅晶圆，以及在其表面制备的PDMS模具。这种PDMS聚合物实际上是由两种不同组分混合而成的。它由硅胶弹性体基础剂和硅胶弹性体固化剂混合而成。这两种组分的混合比例为10:1，即10份基础剂与1份固化剂。现在我需要取大约20克的基础剂。我还需要两克固化剂，而固化剂的密度要小得多，取用时会流得更快，因此我必须稍微小心一些。现在大约是22克，接下来我要将基础剂和固化剂混合在一起。因此，我将使用移液管来完成这一操作。我会尽可能充分地混合均匀。接下来，我需要将这种PDMS聚合物倒在带有微结构图案的硅片上，利用硅片上的图案来赋予PDMS模具相应的结构。实际上，您可以看到我这里有两片硅片，原因是其中一片用于我们微流控装置的顶层，另一片用于底层。微流控装置需要两层结构，因为我们要在内部构建通道，而微流控装置的核心原理是希望在这些通道内实现流体的流动。因此，我需要将这种混合物倒在两片硅片的表面，因为该混合物内部存在大量气泡。我想去除这些气泡，为此我们使用真空环境来排除这些气泡。我们现在回到主实验区域，正如我之前提到的，PDMS 混合物内部含有大量气泡，我们需要将其去除。我会将混合物放置在真空腔室内的硅晶圆表面。然后我会关闭腔室，并启动真空泵。完成抽真空后，我们会将 PDMS 模具放入烘箱中过夜，使其更加固化。好了，我们现在在实验室，准备组装这些微米级叶酸装置。首先，我们需要取出已在培养箱中放置过夜的PDMS模具，这些模具已经成型，其表面形成了与硅晶圆上相同的图案。我将使用两种不同的图案：左侧可以看到的是微通道，将作为顶层；右侧可以看到一些绿色线条图案，将作为底层。这一步将形成微装置内部的凹槽结构。我首先开始切割这些凝胶，以便获得顶层，使其能够轻松地从硅片上分离。接下来，我会将凝胶正面朝上转移到这些培养皿中，使图案面朝上。接下来，我将对沟槽部分（即绿色线条图案）进行

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科研

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生物学

微流体装置与Groove的模式，为研究细胞行为

我们描述了一种用于微加工梯度生成微流控装置的方案，该装置可在定义明确的微环境中产生成分的空间和时间梯度。通过该方法，梯度生成微流控装置可用于研究细胞定向迁移、胚胎发育、伤口愈合以及癌症转移。...

一种用于细胞生物学的梯度生成微流控装置

微流控装置可用于实时观察复杂自然过程，并在适当的物理尺度上进行可视化。我们开发了一种简单的微流控装置，可模拟天然多孔介质的关键特征，用于研究地下环境中细菌的生长与迁移。...

微观世界的窗口：用于研究多孔介质中微生物迁移的简单微流控系统

我们介绍一种简单的方法，用于制备微流控装置，可在无需洁净室或软光刻技术的情况下，对多种不同菌株施加类似的动态条件。...

一种用于研究多种不同菌株的微流控装置

来源： Cabeen, M. T., 等单细胞微流控分析 芽孢杆菌属 subtilis. J. Vis. Exp.

在微流控系统中以单细胞分辨率追踪细菌生长

来源：Scheidweiler, D., et al. 结合微流控装置与显微镜和流式细胞术研究多孔介质中跨空间尺度的微生物迁移。 J. Vis. Exp.

利用微流控装置评估细菌运动性

我们展示了一种基于微流控的检测方法，用于测量细胞通过一系列微米级狭窄通道的通过时间尺度。...

一种用于探测细胞变形能力的微流控技术

集成流体组件的微加工器件为 体外 模拟细胞研究的平台 体内...

设计用于研究细胞在单一或共存化学/电/剪切应力刺激下响应的微流控装置

制备了一种微流控芯片，用于生成成对的金点以实现串联气泡产生，并在附近形成纤维连接蛋白包被的岛状结构用于单细胞图案化。通过粒子图像测速技术对所产生的流场进行了表征，并用于研究多种生物效应，包括细胞膜穿孔、膜形变以及细胞内钙离子响应。...

一种带有表面图案化的微流控系统，用于在单细胞水平上研究空化气泡与细胞的相互作用及其产生的生物效应

本方案详细介绍了一种可定制的方法，用于测量细胞在趋化因子作用下的迁移行为，该方法也可用于测定药物从聚合物基质中扩散的速率。...

一种可定制的细胞迁移测量装置

化学梯度和氧气梯度的控制对于细胞培养至关重要。本文报道了一种聚二甲基硅氧烷-聚碳酸酯（PDMS-PC）微流控装置，能够稳定地生成用于细胞迁移研究的化学梯度与氧气梯度组合，且可在无需复杂仪器的生物实验室中实际应用。...

用于在垂直化学和氧气梯度下研究细胞迁移的聚二甲基硅氧烷-聚碳酸酯微流控装置

我们介绍一种利用微流控平台中毛细作用力辅助组装的技术，可将悬浮在液体中的微米级物体（如细菌和胶体）在聚二甲基硅氧烷基底上排列成预设的阵列。...

通过连续毛细辅助组装实现微生物与微粒的图案化

学习微流控装置制造方法，利用图案化微结构创建低剪切应力区域，实现细胞捕获与培养。该技术可精确操控细胞相互作用，推动细胞生物学与生物工程研究发展。

一种带沟槽图案的微流控装置用于研究细胞行为

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