用的表面图案化微流体系统用于在单细胞水平调查空泡（S） - 细胞的相互作用及产生的生物效应
January 10th, 2017
制造了微流控芯片，以产生用于串联气泡的金点对，以及用于附近单细胞图案化的纤连蛋白涂层岛。通过粒子图像测速法对所得流场进行表征，并用于研究各种生物效应，包括细胞膜穿孔、膜变形和细胞内钙反应。
该实验程序的总体目标是使用表面图案来研究微流体限制中空化诱导的生物效应，以精确控制串联气泡的产生以及单个目标细胞的位置和形状。该微流体系统能够对这种传输空化气泡和细胞进行实验，这与治疗和声音发布以及声音作相关。这种技术的主要优点是提高了表面图案化的精度。
它使我们能够研究单个细胞的生物效应，并且是可靠的气泡-气泡相互作用的高流负荷。程序的视觉演示至关重要，因为 ChIP 步骤中的表面图案和细胞制备很复杂，涉及各种技术和技巧。穿着洁净室服在洁净室中执行所有微纳加工程序。
将每个金点的面积设计在 25 到 30 平方微米以内，使其足够大以吸收激光能量以产生气泡，但又足够小以避免单个细胞粘附在其上。根据文本方案清洁化学罩中的载玻片，然后继续进行旋涂罩。对旋转编码器进行编程，使其在两秒内加速到 1000 RPM 并保持该速度 5 秒，然后让它在 3 秒内加速到 3000 RPM 并保持该速度 30 秒。
接下来，使用真空吸尘器将载玻片固定到旋转编码器上。然后，用 P20 覆盖载玻片并开始旋转循环。接下来，使用相同的循环涂抹 NFR 负片光刻胶。
现在，将玻片放在 95 摄氏度的热板上烘烤 60 秒。冷却至室温后进行光刻。将镀铬面罩安装到面罩对准器上，并确保模型面朝下朝向载玻片。
然后，将光刻配方设置为硬曝光模式，紫外线曝光 9 秒，并将玻璃基板与掩模对齐。紫外线照射后，将载玻片在 95 摄氏度下烘烤 1 分钟，然后像以前一样冷却。要在载玻片上显影图案，请将其置于显影液中 60 秒，然后用蒸馏水清洗载玻片并用氮气干燥。
通过显微镜检查确认图案后，将载玻片在 120 摄氏度下烘烤 5 分钟，然后冷却至室温。现在，在反应离子蚀刻机中用等离子体以 500 tor 和 100 W 的功率清洁载玻片 90 秒。使用电子束蒸发器，将样品粘在板架上。
对机器进行编程，以沉积 5 纳米的钛层，然后沉积 15 纳米的金层。完成该位置后，为机器通风。接下来，将载玻片浸泡在装有光刻胶去除溶剂的烧杯中过夜，以去除 NFR 光刻胶顶部的金。
第二天，用丙酮洗涤玻片，然后用 IPA 洗涤，然后用氮气干燥。用去离子水冲洗载玻片，然后再次用氮气干燥。现在，将载玻片在 115 摄氏度下加热 5 分钟。
然后，使用 100 瓦的氧气等离子体灰化器清洁金点图案载玻片 90 秒。将每个纤连蛋白编码岛的面积设置为 700 至 900 平方微米之间，以促进 hela 细胞在方形区域充分扩散，同时最大限度地减少多个细胞聚集在岛上的机会。制造很像金样。
像以前一样使用 S18 正性光刻胶对载玻片进行旋转编码，并在 115 摄氏度下烘烤编码。然后，进行光刻，将掩模上的标记与基板上的标记对齐。检查中央部分的图案以确认角度正确，并调整从金点到 H 图案的间距。
运行 UV 曝光 9 秒钟，不要进行后烘烤。下一个区别是开发步骤只需要 45 秒。对于反应离子蚀刻，将比分设置为 500 或 100 瓦和 90 秒。
然后，将一滴 PLLG 钉子钝化溶液涂在一块石蜡薄膜上，并将溶液夹在载玻片的图案侧。避免捕获气泡。45 分钟后，从胶片上取下载玻片。
用去离子水冲洗载玻片，然后用氮气干燥。接下来，将载玻片连续浸泡在光刻胶去除剂 1165 中。然后 50% 1165 在去离子水中。
然后只需去离子水。每次浸泡期间，在超声波浴中搅拌溶液 90 秒。现在，在热板上擦干载玻片，然后将其密封在干燥器中并储存在 4 摄氏度。
按照文本协议中的说明将载玻片组装到微通道芯片中。在使用反应离子蚀刻从外围区域去除 PLLG 钉之前，请特别注意用小 PDMS 板屏蔽玻璃基板的图案区域。从 RIE 机器中检索压花玻璃并移除小 PDMS 板。
用减少剂量的氧等离子体处理微通道 PDMS 后，在立体镜下将其与图案玻璃基板对齐。使微通道 PDMS 和图案化玻璃基板保持共形接触。现在，继续使用芯片。
首先，将 PBS 以每分钟 1 微升的速度沿微通道流 30 分钟，从而引发芯片。然后以相同的流速用纤连蛋白溶液注入芯片 45 分钟。等待时，以每毫升 500 万个细胞的速度制备细胞。
健康状态和高汇合度对于此手术至关重要。稍后，用 PBS 替换流经芯片的溶液，并将流速增加到每分钟 10 微升。让 PBS 流动 5 分钟。
接下来，用注射器将准备好的细胞注射到芯片中。当一滴液从管流出时，停止进样并夹紧出口。然后，将芯片放入培养箱中 30 分钟。
然后，松开出口，用细胞培养基以每分钟 10 μL 的速度冲洗芯片，持续 5 分钟。5 分钟后，将流速降至每分钟 0.75 μL，并将芯片和泵送至培养箱中 2 小时。两小时后，继续产生串联气泡，在倒置显微镜下观察芯片，两个脉冲 NDI 激光器在定时控制上对准金点图案，并使用高速相机准备捕获结果。
对于 50 微米的气泡，将两个激光器之间的延迟设置为 2.5 微秒，并将其功率设置为 10 微焦耳。然后，将高速摄像机的录制与激光器同步，并以每秒 200 万帧的速度进行录制，曝光时间为 200 纳秒。因此，记录了气泡膨胀、坍塌气泡-气泡相互作用和射流形成的动力学。
使用所描述的技术在单细胞水平上研究了气泡-气泡相互作用和各种空化诱导的生物效应，例如串联气泡与射流形成的瞬态相互作用、合成流场的可视化和射流速度的计算。串联气泡周围的定向喷射流约为每秒 10 米，宽约 10 微米，因此能够在附近的目标细胞上产生脉冲和局部的纯粹应力和应力梯度。还研究了串联气泡诱导的细胞膜变形。
附着在细胞膜前缘的功能化珠子的位移突出了膜的变形和恢复。根据相邻珠子的三元组的坐标，计算出局部区域应变。此示意图显示了单元表面不同位置的最大面积变化。
前缘主要被拉伸，而泡胞的后缘或侧边被压缩，表明串联气泡诱导喷射流产生的异质性和泡胞变形。单元前缘区域应变的时间变化包括一些快速振荡，然后是大约 100 微秒的大而持续的拉伸，然后是在几毫秒的时间尺度上逐渐恢复。看完这个视频后，你应该对如何进行可控的气泡-气泡相互作用有一个很好的了解，以研究从表面图案化中具有受控形状和位置的单个细胞的生物效应。
在此程序之后，可以进一步执行其他措施，如细胞骨架变薄和共轭成像，以研究串联气泡处理的细胞细胞骨架重排。开发后，该技术将为亚pretic超声领域的研究人员在单细胞水平上探索捕获诱导的生物效应铺平道路。在尝试此过程时，重要的是要记住保持良好的细胞汇合度和条件，以便在细胞模式化过程中取得成功。
不要忘记，使用洁净室化学品和激光可能非常危险，因此在执行此程序时应始终采取预防措施，例如佩戴手套和激光护目镜。
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概述
本研究调查了微流控限制下空化引起的生物效应，利用表面图案化实现对气泡生成和细胞放置的精确控制。微流控芯片能够检查生物效应，如细胞膜穿孔和细胞内钙响应。
关键研究组成部分
科学领域
- 微流控
- 细胞生物学
- 空化的生物效应
背景
- 微流控系统允许对气泡和细胞进行受控实验。
- 表面图案化提高了细胞放置和气泡生成的精确度。
- 理解生物效应对治疗应用至关重要。
- 视觉演示有助于理解复杂的程序。
研究目的
- 探索空化气泡对单个细胞的生物效应。
- 利用表面图案化在实验中实现精确控制。
- 评估气泡相互作用对细胞行为的影响。
使用的方法
- 制造用于气泡生成的微流控芯片。
- 使用粒子图像测速法对流场进行表征。
- 研究细胞膜穿孔和变形。
- 测量细胞内钙响应。
主要结果
- 成功生成串联气泡和图案化细胞岛。
- 流场表征为气泡动力学提供了见解。
- 观察到的生物效应包括膜穿孔和钙响应。
- 表面图案化显著提高了实验精确度。
结论
- 微流控系统有效用于研究空化生物效应。
- 表面图案化是控制细胞相互作用的有价值技术。
- 研究结果有助于理解空化的治疗应用。
常见问题
Executive Industry Relevance
Precise microfluidic systems with surface patterning enable controlled investigation of cavitation-induced bioeffects at the single-cell level, supporting mechanistic de-risking in early discovery. This platform allows for reproducible interrogation of cell membrane responses and intracellular signaling under defined shear stress conditions. Such capabilities enhance predictive confidence for therapeutic hypothesis testing and portfolio triage in biopharma R&D.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables mechanistic interrogation of cell membrane poration and deformation under controlled jetting flow.
- Supports functional target validation by quantifying localized bioeffects at single-cell resolution.
- Facilitates predictive confidence in pathway modulation by measuring intracellular calcium responses.
- Provides a platform for biological de-risking through precise manipulation of cell-bubble interactions.
Screening & Assay Development
- Prepares validated microfluidic systems for downstream single-cell analysis workflows.
- Standardizes assay conditions by controlling cell placement and bubble generation via surface patterning.
- Enables reproducible quantitative outputs such as membrane strain and macromolecule uptake.
- Supports reliable evaluation of compound or intervention effects on cell bioresponses.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant mechanistic studies by modeling localized shear stress and cellular response.
- Provides continuity from discovery to preclinical validation through quantitative single-cell bioeffect measurement.
- Enables risk-adjusted advancement decisions by clarifying cellular response heterogeneity.
- Supports predictive de-risking for translational biomarker development when relevant.
Pipeline & Workflow Integration
This microfluidic system integrates into the discovery continuum from early mechanistic studies to preclinical model validation, supporting both hypothesis testing and quantitative analytics.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis testing of cavitation-induced effects and pathway clarification at the single-cell level.
- Screening: Provides assay readiness and reproducibility through standardized patterning and bubble generation.
- Analytics: Delivers quantitative measurements of membrane deformation, macromolecule uptake, and calcium signaling.
- Translational Research: Bridges discovery and preclinical research by modeling localized cellular bioeffects relevant to therapeutic interventions.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable microfluidic platform adaptable to various cell types and mechanistic studies.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Enhances standardization, reproducibility, and scalability of single-cell bioeffect assays.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by clarifying cellular response thresholds.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of discovery-stage assets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microfabrication, surface patterning, and high-speed imaging.
- Needs access to clean room facilities, pulsed lasers, and advanced microscopy infrastructure.
- Demands rigorous cross-team standardization for reproducible cell patterning and bubble generation.
- Adaptable to different cell types and experimental conditions with protocol optimization.
- Practical limitations include the complexity of fabrication and the need for precise alignment and timing control.
