Name: 用的表面图案化微流体系统用于在单细胞水平调查空泡（S） - 细胞的相互作用及产生的生物效应 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 14 s
Description: 了解表面图案化微流体系统用于研究空泡诱导的单细胞生物效应。该技术通过精确控制串联气泡生成和细胞位置，实现细胞膜穿孔与钙响应的可视化分析。

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我们感谢杜克大学SMIF洁净室设施的使用支持。同时感谢郝强在测量射流速度方面提供的帮助。作者感谢Hadland Imaging公司的Todd Rumbaugh提供了本研究中使用的Shimadzu HPV-X高速摄像机。本工作部分由美国国立卫生研究院（NIH）通过资助编号5R03EB017886-02和4R37DK052985-20提供资金支持。

1. 微型制造
注意：所有微加工步骤均在洁净室中进行。微加工前需设计铬掩模，见图2。
<img alt="微流控装置布局、流动方向图、流体动力学评估、微结构尺寸。" src="/files/ftp_upload/55106/55106fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 2"> 
图 2：微流控芯片中通道设计的示意图及工作单元的尺寸。a) 对准的 PDMS 微通道（绿色）与玻璃基底上图案（蓝色和红色）的掩模设计。b) 工作单元阵列代表性区域的掩模设计放大图。c) 一个工作单元的示意图，显示细胞图案（蓝色）和一对金点（红色）。所有长度标尺均显示在右下角。<a href="http://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/55106/55106fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<ol>
	<li>金点图案化 
	注意：每个金点的面积设计为 25–30 µm2，以确保其足够大，可吸收激光能量产生气泡，同时又足够小，避免单个细胞在其上黏附。金点制备的示意图见图3a。
	<ol>
		<li>玻璃载片清洗（在化学通风橱中进行）
		<ol>
			<li>用丙酮冲洗玻璃载片，接着用异丙醇（IPA）冲洗，然后用 N2 气流吹干。</li>
			<li>将载片浸入piranha溶液（H2SO4:H2O2 = 4:1）中10分钟。</li>
			<li>取出载片，用去离子水（DI水）冲洗，再用 N2 气流吹干。</li>
			<li>将玻璃载片置于加热板上，在120 °C下烘烤10分钟。</li>
			<li>在等离子体灰化仪中以100 W功率处理载片90秒。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>旋涂（在旋涂通风橱中进行）
		<ol>
			<li>打开加热板，等待温度稳定在95 °C。</li>
			<li>按照以下旋涂程序进行： 
			1,000 rpm，5秒，加速度为500 rpm/s； 
			然后3,000 rpm，30秒，加速度为1,000 rpm/s。</li>
			<li>通过施加真空将清洗后的玻璃载片固定在旋涂仪上。</li>
			<li>在载片表面覆盖P-20，并启动涂覆程序。</li>
			<li>对NFR负性光刻胶重复上述涂覆过程。</li>
			<li>在95 °C下烘烤载片60秒，待其冷却至室温。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>光刻
		<ol>
			<li>将铬掩模安装到掩模对准器上，并确保图案面朝下对准载片。</li>
			<li>将光刻程序设置为硬曝光模式，紫外光曝光9秒，并迅速将玻璃基底与掩模对准。</li>
			<li>完成紫外曝光后，在95 °C下烘烤载片1分钟，然后让其冷却至室温。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>显影
		<ol>
			<li>将载片在显影液中显影60秒。</li>
			<li>从显影液中取出载片，用去离子水冲洗，并用 N2 气流吹干。</li>
			<li>在显微镜下检查图案几何形状，测量并记录特征尺寸。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>金沉积（电子束蒸发）与剥离
		<ol>
			<li>在120 °C下烘烤载片5分钟，然后让其冷却至室温。</li>
			<li>在反应离子刻蚀（RIE）设备中使用等离子体清洗载片，条件为500 Torr、100 W，持续90秒。</li>
			<li>使用电子束蒸发仪在载片上沉积5 nm的Ti和15 nm的Au17。</li>
			<li>将载片浸泡在盛有光刻胶去除剂溶剂的玻璃烧杯中过夜，以去除位于NFR光刻胶顶部的金层。</li>
			<li>取出载片，依次用丙酮和异丙醇冲洗，并用 N2 气流吹干。</li>
			<li>在加热板上于115 °C烘干载片，然后在氧气等离子体灰化仪中以100 W功率处理90秒。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过剥离实现分子组装图案化（MAPL） 
	注意：每个纤连蛋白包被岛的面积设定为700–900 µm2，以促进HeLa细胞在方形区域内充分铺展，同时尽量减少多个细胞在岛上聚集的可能性。细胞图案化岛制备的示意图见图3b。
	<ol>
		<li>旋涂
		<ol>
			<li>重复步骤1.1.2，但使用S1813正性光刻胶，并将温度设为115 °C。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>对准光刻
		<ol>
			<li>将铬掩模安装到掩模对准器上，并确保带有图案的一面朝下对准带有金点的载片。</li>
			<li>将光刻程序设置为硬曝光模式，紫外光曝光9秒。</li>
			<li>利用位于掩模边缘周围的对准标记作为空间参考，将上层掩模与下层载片对准。</li>
			<li>检查掩模中心区域，确认图案特征已正确对准。</li>
			<li>完成紫外曝光，无需后烘。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>显影
		<ol>
			<li>重复步骤1.1.3，但在加热板上干燥并保存于 N2 环境前，显影时间为45秒。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>化学处理
	<ol>
		<li>配制钝化溶液：将PLL-g-PEG溶于10 mM HEPES缓冲液中，浓度为0.5 mg/mL。</li>
		<li>从 N2 存储环境中取出载片，使用RIE处理，参数设置为：500 Torr压力、100 W功率、持续90秒。</li>
		<li>用移液器吸取一滴钝化溶液滴加到一片石蜡膜上。</li>
		<li>将溶液夹在石蜡膜与载片之间，确保带有图案的一面朝下接触石蜡膜；避免产生气泡。</li>
		<li>静置45分钟后，将载片从石蜡膜上取下。</li>
		<li>将载片依次浸入光刻胶去除剂、光刻胶去除剂与去离子水（1:1）混合液、以及去离子水中，并在超声波清洗仪中每步振荡90秒。</li>
		<li>在加热板上烘干载片以去除水分，然后将其密封于干燥器中并存放在冰箱中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>芯片组装
	<ol>
		<li>重复步骤1.1.1–1.1.4，但使用SU8-2025负性光刻胶，并参照Microchem协议18的参数设置，制备带有光掩模的硅模具。</li>
		<li>采用软光刻技术制备PDMS微通道（40 mm × 25 mm × 5 mm，长×宽×高）和一小块PDMS平板（具有800 µm宽的沟槽结构）。</li>
		<li>在微通道上打孔作为流体进出口，先用胶带清洁，再用异丙醇（IPA）清洗。</li>
		<li>用PDMS平板遮蔽玻璃基底上的图案区域，并使用RIE（100 W，500 mTorr，60秒）去除周边区域的PLL-g-PEG。</li>
		<li>对微通道进行较低剂量的RIE处理（25 W，500 mTorr，25秒），然后将其与图案化玻璃基底对准（移除小PDMS平板），在体视显微镜下使微通道与图案化玻璃基底实现共形接触。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="金沉积和分子组装示意图；光刻、PDMS 微通道、细胞黏附步骤。" src="/files/ftp_upload/55106/55106fig3.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 3"> 
图 3：微加工与芯片组装的示意图。a) 玻璃基底上金点的图案。b) 通过 MAPL 技术制备用于细胞图案化的玻璃基底。c) 利用等离子体键合组装微流控通道。缩写词的定义见材料列表。<a href="http://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/55106/55106fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<ol start="5">
	<li>细胞贴附 
	注意：HeLa 细胞常规培养于添加了 10% 胎牛血清（FBS）和 1% 抗生素/抗有丝分裂溶液的 DMEM 培养基中，并置于细胞培养箱内。芯片组装及细胞贴附的示意图见图 3c。
	<ol>
		<li>以 PBS 对芯片进行引液，流速为 1 µL/min，持续 30 分钟，随后以纤维连接蛋白溶液（50 µg/mL 溶于 PBS，流速 1 µL/min）灌注 45 分钟。</li>
		<li>等待期间，使用 0.25% 胰蛋白酶-EDTA 消化细胞培养物，用培养基洗涤，离心收集单个细胞，并将细胞重悬于预热（37 °C）的培养基中，细胞密度为 5×106 个细胞/mL。</li>
		<li>将纤维连接蛋白溶液替换为 PBS，并以 10 µL/min 的流速冲洗芯片 5 分钟。</li>
		<li>将制备好的细胞悬液注入芯片，停止流动，夹闭出口，并将芯片置于细胞培养箱中静置 30 分钟。</li>
		<li>松开出口，以细胞培养基以 10 µL/min 的流速冲洗芯片 5 分钟。随后将培养基灌注流速降低至 0.75 µL/min，并在培养箱中继续培养细胞 2 小时。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 气泡生成与流动可视化
注意：串联气泡生成及微流控通道内邻近单个细胞的流动相互作用的实验装置示意图见图4a。
<ol>
	<li>利用双激光器及时间控制生成串联气泡
	<ol>
		<li>将微流控芯片放置在倒置显微镜的载物台上，并将两个脉冲Nd:YAG激光器（λ = 532 nm，脉冲持续时间为5 ns）的焦点对准一对相距40 µm的图案化金点。</li>
		<li>使用数字延迟发生器以约2.5 µs的时间延迟触发两个激光器，从而在金点处产生两个起始气泡。</li>
		<li>调节激光输出能量（约10 µJ），使气泡最大直径控制在50 ± 2 µm范围内。</li>
		<li>将高速相机（200 ns曝光时间，每秒200万帧（fps））与激光器同步，记录气泡膨胀、坍塌、气泡间相互作用及射流形成的动态过程。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>射流速度的量化
	<ol>
		<li>从第二个气泡（B2）生成开始，至第一个气泡（B1）近端的射流尖端（J1）触碰到B1远端为止，记录射流尖端（J1）在B1近端和远端的位置变化；参见图5a中的示意图。</li>
		<li>对近端（射流尖端）和远端位置随时间的变化进行线性拟合。通过计算近端尖端位置-时间曲线的斜率确定射流速度。两条直线的交点对应射流触底时间。更多细节见参考文献19。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>串联气泡诱导流场的可视化
	<ol>
		<li>在去离子水中制备1 µm聚苯乙烯（PS）微球悬浮液（2.6% w/v），并将微球注入微流控芯片中。</li>
		<li>按照步骤2.1.1–2.1.3所述方法生成串联气泡。</li>
		<li>使用高速摄像机以5 M fps的帧率和100 ns的曝光时间记录串联气泡的动态过程。</li>
		<li>将获取的图像序列上传至商用PIV软件中。</li>
		<li>将每幅图像划分为16 × 16像素（px）的较小 interrogation window，重叠率为75%。</li>
		<li>应用多遍迭代和区域滤波器以减少速度场计算中的误差，并输出速度矢量图结果。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="激光、DM 和相机组成的显微镜装置；细胞-激光相互作用示意图，细胞形变研究。" src="/files/ftp_upload/55106/55106fig4.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 4"> 
图 4：实验装置与图像记录示意图。a) 串联气泡生成的实验装置。b) 不同成像方式所采用的时间序列。FL：荧光显微镜，BF：明场，IFT：帧间时间。<a href="http://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/55106/55106fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
3. 单细胞分析与生物效应
注意：在靶细胞附近产生串联气泡，并以与 standoff 距离相关的方式研究其产生的生物效应。不同类型图像采集的时间序列如图4b所示。
<ol>
	<li>膜穿孔与大分子摄取 
	注意：靶细胞对外源性大分子的摄取表现为膜非渗透性碘化丙啶（PI）通过细胞膜上的穿孔位点逐渐扩散进入细胞。
	<ol>
		<li>在步骤1.5之后，更换常规培养基（即， DMEM）与PI溶液100 µg/mL 在DMEM中，以灌注流速运行 0.5 µL/min 在整个实验过程中。</li>
		<li>将显微镜控制软件设置为自动选择转轮上的PI荧光滤块，并同步CCD相机与PI荧光激发的时间，以200 ms的曝光时间采集荧光图像。</li>
		<li>在将两个激光焦点对准靶细胞旁的一对金点后，记录串联气泡处理前的明场（BF）和荧光（FL）图像。</li>
		<li>使用显微镜控制软件，在步骤2.1完成后立即开始对目标细胞进行延时荧光图像记录，以捕获PI摄取的动态过程。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>膜变形
	<ol>
		<li>制备 1-µm 珠粒（1% w/v，用水溶性碳二亚胺活化）并与Peptide-2000功能化结合100 µg/mL 在 PBS 中。</li>
		<li>在完成步骤1.5后，将贴壁细胞与功能化微珠在密度为1×10⁶个细胞/mL的条件下孵育9 beads/mL 在 37 °C 30 分钟。</li>
		<li>重复步骤2.1，在目标细胞附近产生串联气泡，并使用帧速率为500万fps的超高速相机记录细胞形变。</li>
		<li>确定在实验过程中始终位于成像平面上的三个微珠组成的三联体，并将其位置记录为 (x1，y1) (x2，y2），以及（x3，y3在实验坐标系中。</li>
		<li>使用以下公式计算串联气泡处理前后三联体的面积： 
		<img alt="海伦公式用于三角形面积计算；数学方程；教学概念。" src="/files/ftp_upload/55106/55106eq1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="公式 1"></li>
		<li>将面积应变计算为： 
		<img alt="静力平衡方程示意图；ε_A=(A/A₀-1)，用于研究施加力时的ε₁+ε₂+ε₁ε₂。" src="/files/ftp_upload/55106/55106eq2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="公式 2"></li>
		<li>根据串联气泡处理前后三个顶点的坐标，按照既定方案计算局部主应变和面积应变20,21.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>存活率与凋亡 
	注意：FITC Annexin V 通过磷脂酰丝氨酸的外翻标记细胞，包括凋亡细胞（绿色荧光）。PI 标记坏死细胞的细胞核（红色荧光）。明场成像用于记录细胞形态，并辅助判断细胞活力与细胞凋亡状态。
	<ol>
		<li>记录每个经处理细胞在微流控通道中的位置（可通过通道内的地址标签辅助实现，参见 图2b）的同时重复步骤 3.1。</li>
		<li>将处理后的细胞在细胞培养基中继续孵育2小时，然后用FITC Annexin V溶液灌注芯片15分钟。阳性细胞呈现绿色荧光。</li>
		<li>在串联气泡处理24小时后重复步骤3.3.2，以研究靶向细胞的长期生物效应。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>钙反应
	<ol>
		<li>混合 3 µL fura-2 AM 储存液（1 mg/mL，溶于 DMSO） 3 µL 10% w/v Pluronic F-127 溶液 500 µL 低血清培养基以制备最终标记溶液（6 µM).</li>
		<li>步骤1.5之后，将细胞培养基替换为标记溶液，在室温避光条件下孵育40分钟（1 µL/min 灌注速率</li>
		<li>用减血清培养基重新填充通道（0.75 µL/min 灌流速率）在开始细胞实验之前。</li>
		<li>使用商业化的PTI系统对目标细胞进行比率成像（波长：340/380 nm，曝光时间：50 ms）。</li>
		<li>在细胞静息状态下进行10秒的比率成像后，按照步骤2.1产生串联气泡；首先以0.1秒的帧间时间（IFT）记录1分钟，然后将IFT增加至1秒，持续记录1分钟，再于2分钟后进一步将IFT增加至5秒。</li>
		<li>使用PTI软件计算感兴趣区域（ROI）内的比值R = F340/F380，该比值与细胞内钙离子浓度成正比。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

单细胞分析与活细胞成像相结合，极大地加深了我们对单个细胞中动态且常具异质性的生物学过程的理解，例如表型发育和免疫应答23。与传统的培养皿或培养瓶中的细胞培养相比，微流控系统能够实时精确调控单细胞水平的微环境。因此，微流控技术与方法的进步显著提高了单细胞分析的通量和可重复性。通过整合软光刻和表面图案化技术，微流控系统可进一步设计用于深入分析单个细胞对时空动态变化刺激复杂模式的响应。例如，已成功向单个细胞递送瞬时的化学或机械信号，同时自动记录并分析其生物学或机械学响应24。尽管总体趋势如此，微流控技术在细胞水平上用于分析空化效应所诱导的生物效应仍十分有限。尤其值得注意的是，目前仅将其应用于被微柱捕获的悬浮单细胞中气泡诱导的膜穿孔研究11。在大多数贴壁细胞的研究中，通过控制细胞形态以保持动态气泡-细胞相互作用一致性的优势，要么无法实现，要么在很大程度上被忽视。
我们开发了一种微流控系统，可精确控制空化气泡的产生、后续膨胀及溃灭动力学过程；实现气泡间相互作用并形成射流；同时调控细胞的形态、取向、黏附模式以及与气泡之间的 st...

人们日益认识到，在大量细胞群体中，由于基因、蛋白质和代谢物的随机表达，细胞间存在异质性，这种异质性是生物学中细胞适应与进化的基本原理之一1。因此，采用基于群体的总体测量方法来理解单个细胞的功能及其相互作用，往往不准确且不可靠。因此，开发用于单细胞分析的新技术在生物学和药理学研究中备受关注，例如可用于更深入地理解干细胞生物学和癌症治疗中的关键信号通路与过程2-4。近年来，微流控平台的出现极大地推动了单细胞分析的发展，通过新颖的分析策略实现了对单个细胞的定位、处理及其响应的观测5。
空化现象在多种生物医学应用中发挥着重要作用，包括高强度聚焦超声（HIFU）治疗癌症6、冲击波碎石术（SWL）无创粉碎肾结石7、通过声穿孔实现药物或基因递送8，以及最近报道的由流体动力学气泡空化导致的细胞或组织破坏9,10。然而，空化气泡与生物组织及细胞相互作用的动态过程尚未被充分理解。这主要是由于超声、冲击波以及局部液压所引发的空化起始和气泡动力学具有随机性；此外，目前仍缺乏能够解析生物细胞固有复杂且快速响应的有效技术，尤其是在单细胞水平上。
由于这些挑战，很少有研究在严格控制的实验条件下探讨气泡与细胞之间的相互作用也就不足为奇了。例如，已有研究利用微流控通道中激光生成的单个气泡，展示了悬浮状态下被捕获的单个细胞的细胞膜穿孔11以及人红细胞的脉冲式大幅变形12。然而，由于真核细胞含有细胞核，后一种技术只能在真核细胞中产生非常小的形变13。此外，在悬浮状态下处理细胞时，难以监测其下游的生物效应。在其他研究中，已有报道通过超声激发附着在细胞上的微泡（或超声造影剂），在单个贴壁细胞中诱导细胞膜穿孔和/或细胞内钙响应8。单个贴壁细胞的细胞膜穿孔也可通过在含有光吸收性台盼蓝溶液的薄液层中使用激光生成的串联气泡来实现14，或通过在微腔中利用微秒级激光脉冲照射光吸收基底产生振荡气泡来实现15。相比之下，光吸收基底相较于激光吸收性台盼蓝溶液具有优势，因为后者对细胞具有毒性。更重要的是，与声学激发产生的气泡相比，激光生成的气泡在气泡尺寸和位置方面更易于控制。然而，在所有这些先前的研究中，细胞的形态、取向和黏附状态均未得到控制，而这些因素可能会显著影响由机械应力引起的细胞响应和生物效应16。
为了克服以往研究中的这些缺点，我们近期开发了一种实验系统，该系统利用独特的微加工技术组合构建微流控芯片，可实现气泡生成、细胞图案化、气泡-气泡-细胞相互作用以及细胞响应的实时生物检测。本实验系统在该领域中区别于其他系统的三个主要特征是：1）在玻璃基底上制备微米级金点图案，以实现局域化的激光吸收从而生成气泡17；2）在同一基底上制备微米级细胞外基质（ECM）岛状图案，以控制单个细胞的位置和几何形态；3）将气泡-气泡-细胞相互作用区域的维度从三维压缩为准二维空间，从而便于在同一成像序列中对气泡-气泡相互作用、射流流场、细胞形变及生物效应进行面内可视化观察（图1d）。
<img alt="微流控装置示意图：细胞变形、穿孔、钙响应；串联气泡、射流流动。" src="/files/ftp_upload/55106/55106fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 
图1：微流控芯片及不同检测的示意图。a) 组装好的微流控芯片，通道中充满蓝色墨水以便观察。b) 微流控芯片内部区域，显示图案化排列的细胞和金点（相邻两个金点之间的距离为40 µm）。可在通道内排列多个工作单元对。c) 单个工作单元的放大图像，包含一对金点以及黏附在细胞图案化区域的HeLa细胞。d) 装置工作原理示意图。单个细胞黏附并铺展在涂有纤连蛋白的“H”形岛状结构上。通过脉冲激光照射金点产生一对反相振荡的空化气泡（串联气泡）（见图4a），从而生成高速且局部化的射流，流向邻近的目标细胞。根据细胞与串联气泡之间的 standoff 距离（Sd），细胞可能发生变形、发生大分子摄取所需的穿孔，和/或产生钙响应。<a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55106/55106fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
该平台可进一步结合荧光检测和固定在细胞表面的功能化微珠，用于研究空化诱导的生物效应。特别是，该平台为在单细胞水平上开展可靠且可量化的检测提供了途径。迄今为止，我们已利用该装置分析了串联气泡诱导的细胞膜形变、细胞穿孔和细胞内摄取、细胞活力、细胞凋亡以及细胞内钙响应。在以下实验方案中，我们描述了芯片的制备过程以及分析上述各种生物效应的操作步骤。此外，还介绍了芯片的使用方法。

<table><tbody><tr><td>&lt;强&gt;试剂/材料&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>75 mm × 38 mm 普通载玻片</td><td>康宁</td><td>2947-75X38</td><td></td></tr><tr><td>丙酮</td><td>Sigma Aldrich, Co.</td><td>320110</td><td>ACS试剂， &amp;ge;99.5%</td></tr><tr><td>异丙醇</td><td>Sigma Aldrich, Co.</td><td>W292907</td><td>&amp;ge;99.7%，FCC，FG</td></tr><tr><td>硫酸</td><td>Sigma Aldrich, Co.</td><td>320501</td><td>ACS试剂，95.0-98.0%</td></tr><tr><td>过氧化氢</td><td>Sigma Aldrich, Co.</td><td>216763</td><td>30 wt.% in H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td></tr><tr><td>引物 P-20</td><td>微化学</td><td>MCC引物80/20</td><td></td></tr><tr><td>NFR光刻胶</td><td>JSR</td><td>NFR016D2</td><td></td></tr><tr><td>光刻掩模</td><td>Photoplotstore</td><td>N/A</td><td>4x4 直接写入掩模</td></tr><tr><td>MF-319 显影剂</td><td>希普利（罗门哈斯）</td><td>Microposit MF-319</td><td></td></tr><tr><td>1165 光刻胶去除剂</td><td>陶氏化学公司</td><td>DEM-10018073</td><td>基于1-甲基-2-吡咯烷酮的</td></tr><tr><td>S1813 光刻胶</td><td>希普利（罗门哈斯）</td><td>S1813</td><td></td></tr><tr><td>PLL-g-PEG</td><td>SuSoS</td><td>PLL(20)-g[3.5]-PEG(2)</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>石蜡膜</td><td>HACH</td><td>251764</td><td></td></tr><tr><td>SU-2025 光刻胶</td><td>微化学</td><td>SU-2025</td><td></td></tr><tr><td>PDMS</td><td>道康宁</td><td>184 SIL ELAST KIT 0.5KG</td><td></td></tr><tr><td>微孔管</td><td>Saint-Gobain PPL 公司</td><td>S-54-HL</td><td></td></tr><tr><td>金属针</td><td>新英格兰小型管</td><td>NE-1300-01</td><td>直切管，0.025&amp;rdquo; OD × 0.017&amp;rdquo; ID × 0.50&amp;rdquo; 长</td></tr><tr><td>HeLa 细胞</td><td>杜克大学细胞培养中心</td><td>(307-CCL-2) HeLa，第148页</td><td></td></tr><tr><td>DPBS (1x) 缓冲液</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>DMEM培养基</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>11995065</td><td></td></tr><tr><td>纤维连接蛋白 牛 蛋白，血浆</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>33010018</td><td></td></tr><tr><td>0.25% 胰蛋白酶-EDTA（1×）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>碘化丙啶</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>P21493</td><td></td></tr><tr><td>羧酸盐微球 1.00&amp;nbsp;&amp;mu;m</td><td>Polysciences, Inc</td><td>08226-15</td><td></td></tr><tr><td>羧基微球 2.00&amp;nbsp;&amp;mu;m</td><td>Polysciences, Inc</td><td>18327-10</td><td></td></tr><tr><td>EDC（1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>22980</td><td></td></tr><tr><td>Sulfo-NHS</td><td>磺基-NHS（N-羟基琥珀酰亚胺）</td><td>24510</td><td></td></tr><tr><td>Peptite-2000</td><td>Advanced BioMatrix</td><td>5020-5MG</td><td></td></tr><tr><td>FITC Annexin V</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>A13199</td><td></td></tr><tr><td>Fura-2, AM</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>F1221</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma Aldrich, Co.</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>F-127</td><td>invitrogen</td><td>P6866</td><td>0.2 &amp;micro;m 过滤（水中 10% 溶液）</td></tr><tr><td>低血清培养基&amp;nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11058021</td><td></td></tr><tr><td>&lt;强&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;强&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;强&gt;货号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;强&gt;评论&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;强&gt;仪器设备&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>等离子体灰化器</td><td>Emitech</td><td>K-1050X</td><td>O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; / 光刻胶及其他有机材料的氩等离子体灰化</td></tr><tr><td>掩模对准器</td><td>SUSS MicroTec&amp;nbsp;</td><td>Karl Suss MA6/BA6</td><td></td></tr><tr><td>电子束蒸发仪</td><td>CHA Industries</td><td>CHA Industries Solution E-Beam</td><td></td></tr><tr><td>RIE</td><td>Trion Technology&amp;nbsp;</td><td>Trion Technology Phantom II</td><td>（氧化物/氮化物/聚合物）刻蚀</td></tr><tr><td>体视显微镜</td><td>AmScope</td><td>American Scope SM-4TZ-FRL</td><td>体视显微镜</td></tr><tr><td>注射泵</td><td>Chemyx 公司</td><td>NanoJet</td><td></td></tr><tr><td>细胞培养箱</td><td>NuAire</td><td>AutoFlow NU-8500 水套式二氧化碳培养箱&lt;sub&gt;2 &lt;/sub&gt;培养箱</td><td></td></tr><tr><td>生物安全柜</td><td>NuAire</td><td>NU-425-400</td><td></td></tr><tr><td>水浴锅</td><td>VWR</td><td>1122s</td><td></td></tr><tr><td>离心</td><td>IEC</td><td>Centra CL2</td><td></td></tr><tr><td>显微镜</td><td>Zeiss</td><td>Axio Observer Z1</td><td></td></tr><tr><td>Nd:YAG激光器&amp;nbsp; （激光器1）</td><td>New Wave Research</td><td>风暴</td><td></td></tr><tr><td>Nd:YAG 激光器&amp;nbsp; （激光器 2）</td><td>新波研究</td><td>Orion</td><td></td></tr><tr><td>延时发生器</td><td>伯克利核子学&amp;nbsp;</td><td>BNC 565-8c</td><td></td></tr><tr><td>闪光灯</td><td>Dyna-Lite</td><td>ML1000 光纤耦合闪光灯</td><td></td></tr><tr><td>高速相机</td><td>DRS Hadland</td><td>&amp;nbsp;Imacon 200</td><td></td></tr><tr><td>高速&amp;nbsp; 相机</td><td>岛津</td><td>HPV-X</td><td></td></tr><tr><td>高速相机</td><td>视觉研究</td><td>Phantom V7.3</td><td></td></tr><tr><td>PIV 软件</td><td>LaVision</td><td>DaVis 7.2</td><td></td></tr><tr><td>相机</td><td>Zeiss</td><td>AxioCam MRc 5</td><td></td></tr><tr><td>软件</td><td>Zeiss</td><td>AxioVision</td><td></td></tr><tr><td>PTI 系统</td><td>Horiba</td><td>S/N: 1705 RAM-X</td><td></td></tr><tr><td>EasyRatio 软件</td><td>Horiba</td><td>Easy Ratio Pro 2</td><td>版本 2.3.125.86</td></tr><tr><td>63&amp;times; 目的</td><td>蔡司</td><td>LD Plan Neofluar</td><td></td></tr></tbody></table>

一种带有表面图案化的微流控系统，用于在单细胞水平上研究空化气泡与细胞的相互作用及其产生的生物效应

A Microfluidic System with Surface Patterning for Investigating Cavitation Bubble(s)&#8211;Cell Interaction and the Resultant Bioeffects at the Single-cell Level

本文中，我们首先描述了一种微流控芯片的制备方法，该芯片在同一块玻璃基底上具有金点和纤连蛋白包被区域，可精确控制串联气泡的生成，并在明确定义的位置和形状上实现邻近单个细胞的图案化。接着，我们通过使用两束脉冲激光以数微秒的时间延迟分别照射一对金点，展示了串联气泡的生成过程。我们利用高速成像技术观察气泡-气泡相互作用及射流的形成，并采用粒子图像测速技术（PIV）对所产生的流场进行表征。最后，我们展示了该技术在单细胞分析中的一些应用，包括大分子摄取的细胞膜穿孔、通过整合素结合微珠位移测定的局部膜形变，以及基于比率成像的细胞内钙离子响应。实验结果表明，串联气泡相互作用可产生快速且具有方向性的射流，从而在邻近生长的细胞表面施加高度局域化的剪切应力。此外，通过调节细胞与串联气泡之间的 standoff 距离以改变射流强度，可诱导不同的生物效应。

本研究中描述的微流控平台可用于研究气泡-气泡相互作用，并在单细胞水平上分析多种空化诱导的生物效应。本文展示了多个示例，以说明在本实验系统中可开展的各种实验研究和生物检测。首先，我们将阐述串联气泡在射流形成过程中的瞬态相互作用、相应流场的可视化以及射流速度的计算（图5a）。随后，我们将展示串联气泡引起的局部细胞膜变形（图5b）、通过PI摄取实现的精确定位膜穿孔（图5c）以及细胞内钙离子响应（图5d）的示例。其他示例，如细胞活力和细胞凋亡检测，可参见参考文献22。
图5a展示了通过高速成像捕捉到的串列气泡相互作用及射流形成的示例，以及通过PIV揭示的相应流场。具体而言，在第一个气泡B1（在0 µs时产生）达到最大膨胀后，其坍塌过程受到第二个气泡B2</sub...

制备了一种微流控芯片，用于生成成对的金点以实现串联气泡产生，并在附近形成纤维连接蛋白包被的岛状结构用于单细胞图案化。通过粒子图像测速技术对所产生的流场进行了表征，并用于研究多种生物效应，包括细胞膜穿孔、膜形变以及细胞内钙离子响应。

在本文中，我们首先描述了一种微流控芯片的制备方案，该芯片在同一块玻璃上具有金点和纤维连接蛋白包被区域……

本实验方案的总体目标是利用表面图案化技术精确控制串联气泡的产生以及单个靶细胞的位置和形态，从而在微流控限域环境中研究空化效应所引起的生物效应。该微流控系统可用于研究瞬态空化气泡与细胞之间的相互作用，相关结果对治疗应用及声学发表与声学操作具有重要意义。该技术的主要优势在于通过表面图案化显著提高了实验的精确性。它使我们能够研究单个细胞的生物效应，并通过可靠的气泡间相互作用实现高流速加载。由于芯片制备步骤中的表面图案化和细胞准备过程涉及多种技术和技巧，因此实验操作的可视化演示至关重要。所有微加工操作均需在洁净室中进行，并穿戴洁净室防护服。将每个金点的面积设计在25至30平方微米之间，使其足够大以吸收激光能量产生气泡，同时又足够小以避免单个细胞在其上黏附。按照文本方案在化学通风橱中清洗载玻片，随后转移至旋涂通风橱。将旋涂仪程序设置为在2秒内加速至1000 RPM，并维持该转速5秒，然后在3秒内线性升速至3000 RPM，并维持该转速30秒。接下来，使用真空将玻璃载玻片固定在旋涂仪上。然后，将P20覆盖在载玻片上并启动旋涂程序。随后，采用相同的旋涂程序涂覆NFR负性光刻胶。现在，将载玻片置于95摄氏度的加热板上烘烤60秒。待其冷却至室温后，进行光刻。将铬掩膜安装到掩膜对准仪上，并确保图案面朝下，面向载玻片。然后，将光刻工艺参数设置为硬曝光模式，进行9秒的紫外光曝光，并将玻璃基底与掩膜对准。紫外光曝光后，将载玻片在95摄氏度下烘烤1分钟，然后如前所述使其冷却。为在载玻片上显影图案，将其放入显影液中60秒，随后用去离子水冲洗载玻片，并用氮气吹干。通过显微镜检查确认图案后，将载玻片在120摄氏度下烘烤5分钟，然后冷却至室温。接着，在反应离子刻蚀机中以500托和100瓦的条件对载玻片进行等离子清洗90秒。使用电子束蒸发仪时，将样品用胶带固定在样品台支架上。将设备编程为先沉积一层5纳米的钛，再沉积一层15纳米的金。该位置操作完成后，对设备进行通风。接着，将载玻片浸泡在盛有光刻胶去除剂溶剂的烧杯中过夜，以去除位于NFR胶顶层的金。第二天，用丙酮清洗载玻片，接着用异丙醇（IPA）清洗，然后用氮气吹干。再用去离子水冲洗载玻片，并再次用氮气吹干。随后，将载玻片在115摄氏度下加热5分钟。然后，使用100瓦的氧气等离子体清洗仪对金点阵列载玻片清洗90秒。将每个纤维连接蛋白编码岛的面积设定在700至900平方微米之间，以促进海拉细胞在方形区域内充分铺展，同时降低多个细胞在同一个岛上聚集的可能性。其制备方法与金图案的制备类似。使用 S18 正性光刻胶以与之前相同的方式对载玻片进行旋涂，并在 115 摄氏度下进行烘焙。然后进行光刻，将掩模上的标记与基底上的标记对齐。检查中心区域的图案以确认正确的角度，并调整金点与 H 型图案之间的间距距离。进行九秒紫外光曝光，无需后烘。下一步的不同之处在于显影

a-microfluidic-system-with-surface-patterning-for-investigating

Research

科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

用的表面图案化微流体系统用于在单细胞水平调查空泡（S） - 细胞的相互作用及产生的生物效应

我们描述了一种用于制备微流控装置的方案，该装置可实现细胞捕获与培养。在此方法中，通过在微流控通道内设计具有特定图案的微结构（如沟槽），以形成低剪切应力区域，从而使细胞能够在其中停靠。...

一种带沟槽图案的微流控装置用于研究细胞行为

微流控装置可用于实时观察复杂自然过程，并在适当的物理尺度上进行可视化。我们开发了一种简单的微流控装置，可模拟天然多孔介质的关键特征，用于研究地下环境中细菌的生长与迁移。...

微观世界的窗口：用于研究多孔介质中微生物迁移的简单微流控系统

来源：Kurz, D. L., 等。用于研究多孔介质中生物堵塞的微流控平台。J. Vis. Exp.

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本方案描述了一种微流控平台，通过结合高分辨率显微成像与同步压力差测量，用于研究生物膜在准-二维多孔介质中的发育过程。该平台可量化多孔介质中孔隙尺寸和流体流速对生物堵塞的影响。...

一种用于研究多孔介质中生物堵塞的微流控平台

了解表面图案化微流体系统用于研究空泡诱导的单细胞生物效应。该技术通过精确控制串联气泡生成和细胞位置，实现细胞膜穿孔与钙响应的可视化分析。

一种带有表面图案化的微流控系统，用于在单细胞水平上研究空化气泡与细胞的相互作用及其产生的生物效应

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