一种带有表面图案化的微流控系统，用于在单细胞水平上研究空化气泡与细胞的相互作用及其产生的生物效应

本实验方案的总体目标是利用表面图案化技术精确控制串联气泡的产生以及单个靶细胞的位置和形态，从而在微流控限域环境中研究空化效应所引起的生物效应。该微流控系统可用于研究瞬态空化气泡与细胞之间的相互作用，相关结果对治疗应用及声学发表与声学操作具有重要意义。该技术的主要优势在于通过表面图案化显著提高了实验的精确性。

它使我们能够研究单个细胞的生物效应，并通过可靠的气泡间相互作用实现高流速加载。由于芯片制备步骤中的表面图案化和细胞准备过程涉及多种技术和技巧，因此实验操作的可视化演示至关重要。所有微加工操作均需在洁净室中进行，并穿戴洁净室防护服。

将每个金点的面积设计在25至30平方微米之间，使其足够大以吸收激光能量产生气泡，同时又足够小以避免单个细胞在其上黏附。按照文本方案在化学通风橱中清洗载玻片，随后转移至旋涂通风橱。将旋涂仪程序设置为在2秒内加速至1000 RPM，并维持该转速5秒，然后在3秒内线性升速至3000 RPM，并维持该转速30秒。

接下来，使用真空将玻璃载玻片固定在旋涂仪上。然后，将P20覆盖在载玻片上并启动旋涂程序。随后，采用相同的旋涂程序涂覆NFR负性光刻胶。

现在，将载玻片置于95摄氏度的加热板上烘烤60秒。待其冷却至室温后，进行光刻。将铬掩膜安装到掩膜对准仪上，并确保图案面朝下，面向载玻片。

然后，将光刻工艺参数设置为硬曝光模式，进行9秒的紫外光曝光，并将玻璃基底与掩膜对准。紫外光曝光后，将载玻片在95摄氏度下烘烤1分钟，然后如前所述使其冷却。为在载玻片上显影图案，将其放入显影液中60秒，随后用去离子水冲洗载玻片，并用氮气吹干。

通过显微镜检查确认图案后，将载玻片在120摄氏度下烘烤5分钟，然后冷却至室温。接着，在反应离子刻蚀机中以500托和100瓦的条件对载玻片进行等离子清洗90秒。使用电子束蒸发仪时，将样品用胶带固定在样品台支架上。

将设备编程为先沉积一层5纳米的钛，再沉积一层15纳米的金。该位置操作完成后，对设备进行通风。接着，将载玻片浸泡在盛有光刻胶去除剂溶剂的烧杯中过夜，以去除位于NFR胶顶层的金。

第二天，用丙酮清洗载玻片，接着用异丙醇（IPA）清洗，然后用氮气吹干。再用去离子水冲洗载玻片，并再次用氮气吹干。随后，将载玻片在115摄氏度下加热5分钟。

然后，使用100瓦的氧气等离子体清洗仪对金点阵列载玻片清洗90秒。将每个纤维连接蛋白编码岛的面积设定在700至900平方微米之间，以促进海拉细胞在方形区域内充分铺展，同时降低多个细胞在同一个岛上聚集的可能性。其制备方法与金图案的制备类似。

使用 S18 正性光刻胶以与之前相同的方式对载玻片进行旋涂，并在 115 摄氏度下进行烘焙。然后进行光刻，将掩模上的标记与基底上的标记对齐。检查中心区域的图案以确认正确的角度，并调整金点与 H 型图案之间的间距距离。

进行九秒紫外光曝光，无需后烘。下一步的不同之处在于显影步骤仅需45秒。对于反应离子刻蚀，将参数设置为500托、100瓦和90秒。

然后，将一滴 PLLG peg 封端溶液滴加到一片石蜡膜上，并将溶液与载玻片的图案面贴合，形成夹心结构。注意避免产生气泡。45 分钟后，将载玻片从石蜡膜上取下。

用去离子水冲洗载玻片，然后用氮气吹干。接着，将载玻片依次浸入光刻胶去除剂1165中，随后浸入50%的1165溶液（溶于去离子水中）。

然后仅用去离子水清洗。每次清洗时，在超声波水浴中振荡溶液90秒。现在，将载玻片放在加热板上干燥，然后密封于干燥器中，并在4摄氏度下保存。

按照文本方案所述，将载玻片组装成微通道芯片。在使用反应离子刻蚀去除周边区域的PLLG接枝层之前，务必注意用小块PDMS覆盖并保护玻璃基底上的图案化区域。从反应离子刻蚀仪中取出图案化玻璃，并移除小块PDMS。

用较低剂量的氧气等离子体处理微通道PDMS后，在体视显微镜下将其与图案化玻璃基底对齐。使微通道PDMS与图案化玻璃基底紧密贴合。此时，即可使用该芯片。

首先，以每分钟1 µL的流速向微通道中注入PBS，润洗芯片30分钟。随后以相同的流速注入纤连蛋白（fibronectin）溶液，孵育45分钟。在此期间，将细胞制备为浓度为500万细胞/毫升的悬液。

健康的细胞状态和高汇合度对此实验步骤至关重要。随后，用 PBS 替换流经芯片的溶液，并将流速提高至 10 µL/min。让 PBS 流动 5 分钟。

接下来，使用注射器将制备好的细胞注入芯片中。当液滴从管路末端流出时，停止注射并夹闭出口。然后，将芯片放入培养箱中孵育30分钟。

随后，松开出口，以每分钟10 µL的速度用细胞培养基冲洗芯片，持续5分钟。5分钟后，将流速降至每分钟0.75 µL，将芯片和泵转移至培养箱中孵育2小时。2小时后，在倒置显微镜下进行串联气泡生成实验，同时启用两个脉冲式NDI激光器，通过时序控制器对准金点阵列，并准备好高速相机以捕获实验结果。

对于50微米的气泡，将两台激光器之间的延迟设置为2.5微秒，并将激光能量设为10微焦。然后，将高速相机的记录与激光器同步，以每秒200万帧的速度进行记录，每帧曝光时间为200纳秒。由此，可记录气泡膨胀、气泡坍塌、气泡间相互作用以及射流形成的动态过程。

利用所述技术在单细胞水平上研究了气泡-气泡相互作用以及多种由空化引起的生物效应，例如串联气泡的瞬态相互作用、射流形成的可视化以及射流速度的计算。串联气泡周围定向射流流速约为每秒十米，宽度约为十微米，因此能够对邻近的目标细胞产生脉冲式且局部的剪切应力及应力梯度。还研究了串联气泡诱导的细胞膜形变。

通过附着在细胞膜前缘的功能化微珠的位移，突出显示了膜的形变与恢复过程。根据相邻三个微珠的坐标，计算出局部面积应变。该示意图展示了细胞表面不同位置的最大面积变化。

细胞的前缘主要受到拉伸，而后缘或侧缘则受到压缩，表明由串联气泡诱导的射流流动导致了细胞的异质性和形变。细胞前缘面积应变的时间变化包括若干次快速振荡，随后是持续约100微秒的大范围且持续的拉伸，之后在数毫秒的时间尺度上逐渐恢复。观看本视频后，您应能充分理解如何通过表面图案化实现形状和位置可控的单细胞，进而构建可控的气泡-气泡相互作用以研究其生物效应。

完成此操作后，可进一步进行细胞骨架变薄和共焦成像等其他检测，以研究串联气泡处理对细胞骨架重排的影响。该技术发展后，将为亚微米超声领域的研究人员探索单细胞水平上由空化诱导的生物效应铺平道路。在实施该操作时，必须注意保持良好的细胞汇合度和状态，以确保细胞图案化过程的成功。

请务必注意，使用洁净室化学品和激光器可能具有极高的危险性，进行本实验操作时，必须采取佩戴手套和激光防护眼镜等安全防护措施。