基于二维Gabor滤波器的光散射显微镜

在本视频中，光学散射显微镜用于量化细胞凋亡过程中的线粒体碎裂。尽管光学散射显微镜在该方案中通常不需要荧光，但将获取荧光图像以进行验证。设置成像系统后，用 MIT 追踪器绿色标记细胞并用 stor sporin 处理以诱导细胞凋亡。

获取光学数据以在两小时内检测细胞器方向的变化。可以使用光散射数据测量线粒体碎裂的开始，该数据显示亚细胞颗粒取向程度的降低。然后通过将光散射数据与含有线粒体的荧光区域相关联来验证数据。

大家好，我是来自罗格斯大学生物医学工程系生物光学实验室的 Nada Bustani。我是来自生物光学实验室的 Rob Pak，我是来自生物实验室的 Deen。今天，我们将向您展示一种使用不依赖荧光染料的方法量化亚细胞形态动力学的程序。

我们在实验室中使用这项技术来研究细胞凋亡或程序性细胞死亡过程中亚细胞结构的动态变化。那么让我们开始吧。通过用 70% 乙醇对戴手套的手进行消毒来开始此过程。

然后将准备好的 100 纳摩尔 miot tracker green 原液和预热的 BAEC 细胞培养基放入罩中，关灯并对所有表面进行消毒。接下来，将一个六孔培养皿，细胞接种在引擎盖下的盖玻片上。使用连接到真空管路的糊状移液器。

从孔中取出细胞培养基。然后立即向每个孔中加入 2 毫升标记培养基以标记细胞。线粒体。盖上组织培养板以防止暴露在室内光线直射下，并迅速将细胞放回培养箱中。

37 摄氏度下孵育 45 分钟。准备光学设置：首先打开汞弧夹。然后打开计算机显微镜相机和激光，插入数字微镜设备或旋转扩散器中的 DMD。

接下来，通过显微镜目镜观察光学发射是否对准。视野应由激光明亮地照亮。要加载样品，请在 63 x 油浸物镜上滴入一到两小滴浸油，同时将其完全向下。

然后在载物台上安装一个滑轨，该滑轨由规则的 10 微米间隔的网格组成，称为 gradi，并升高物镜，使油抓住它聚焦。接下来，聚焦聚光镜磁场的六边形边缘。停下来，使其在中央 Kohler 照明中对齐。

六边形边缘应在目镜中居中并清晰聚焦。然后使用聚光镜视场光阑位置旋钮居中，将聚光镜视场，光阑光阑置于视场上方。启动 IP lab 并输入设置以作摄像机。

确认相机已设置为帧传输模式。运行 acquire focus 命令以启动实时预览。然后设置索引前缀和图像将保存到的文件位置。

接下来，启动 RS 映像。指定用于作 Cool Snap 相机的设置。clocking mode 应设置为 normal。

启动 DMD 软件。将暗场 iris 放在脚本菜单上。然后点击 Load and reset。

要手动运行脚本，请将视区中的显微镜 optiv bar 设置为 LSM。这将通过对准光学元件中的 DMD 发送图像。将暗场图像投影到 Cascade five 12 相机的 CCD 上。

暗场图像应显示在 IP Lab 的实时预览中。如有必要，将图像聚焦在实时预览上。将曝光时间设置得足够高，以确保图像中至少有 10， 000 个信号计数。

然后在采集后使用 acquire single 命令拍摄视野快照。使用 save as indexed 命令将映像保存到光盘。GTI 的图像测量视野的大小。

现在移动 GTI 示例，使其超出视野，并且只有背景可见。捕获场的背景图像，曝光时间足以采集至少 5， 000 个计数。此图像将有助于对未过滤的图像进行背景扣除。

现在，要获取背景的 Gabor 过滤图像，请将 Gabor Filter Bank 脚本加载到 DMD 控制软件中。运行整个脚本，将滤波器缓冲到 DMD 的板载内存中。缓冲整个脚本后，这可能需要几分钟时间。

使用 DMD 软件中的开始和停止标记，确保一次只加载一组对应于一个 Gabor Like 过滤器的过滤器。运行脚本以获取筛选后的背景图像。实时图像预览应从暗场更改为过滤后的图像。

对于该过滤器，请在 IP lab 中从光盘打开采集脚本。调整曝光时间以确保至少采集 2000 个计数。当 DMD 脚本正在运行时，取消 IP lab 中的实时预览并运行采集脚本。

这将自动获取索引并将过滤后的图像保存到光盘。获取第一个图像后，停止在 DMD 中运行的脚本。从脚本中删除使用的命令。

然后替换下一个滤镜集开头和结尾的开始和停止标记。在 IP Lab 中重复采集，直到使用整个滤光片组并且采集并保存所有滤波图像。在实验室工作台上插入烙铁，然后将 L 15 培养基加热至 37 摄氏度，准备对细胞进行电镀。

用纸巾和 Kim 湿巾制作一个工作站，以吸收任何溢出的介质并保持该区域清洁。通过撕开和旋转 kimm 湿巾来准备几个灯芯。吸芯将用于将液体吸入细胞板。

接下来，使用金属样品架制作细胞夹层。使用注射器在机加工金属板孔的上外周涂抹一滴薄薄的真空润滑脂，大约延伸到每侧凹槽末端的一半。轻轻地将干净的 1 号盖玻片涂抹在油脂上。

将板翻转过来，在孔周围涂抹润滑脂。戴上乙醇消毒的 NI 试用检查手套关掉房间的灯。从培养箱中取回细胞。

从六孔板中取出将用于实验的盖玻片。小心擦干盖玻片。然后将盖板单元的一面向下压入观察孔上方的润滑金属板中。

将细胞夹在板内。确保没有气隙残留，并且润滑脂已形成防水密封，以便可以加载介质。现在将板向后翻转，一次移液 200 μL。

通过上盖玻片和金属板之间的凹槽，将预热的 L 15 培养基加入三明治中，直到液体几乎到达另一侧的凹槽。接下来，将吸芯放在对面的凹槽中，然后将另外 200 微升培养基移液到三明治中，以洗涤细胞。当灯芯去除旧介质时，介质将从一侧流向另一侧。

在此步骤中，请小心防止液体内形成任何气泡。每次冲洗时使用新灯芯重复此过程 2 到 3 次。现在再次倒置板，从边缘支撑板，以便将液体捕获在细胞储液器中。

将烙铁浸入 veap 烧杯中以快速熔化一些 veap，然后这些 veap 会附着在烙铁头上。使用烙铁头小心地将蜕皮液涂抹在底盖衬片的边缘。继续浸入并一直涂抹在盖玻片周边，将其密封到金属板上。

这形成了良好的机械密封，因此盖玻片在查看时不会从板上脱落。清理底部的残留物。用 kim 抹布擦干净盖子，盖住滑板表面。

以单个滑动动作滑动，以确保盖玻片在观察它的中心最干净。将 6 壁板放回培养箱中。将电镀的样品池带到光学实验室并安装在物镜上。

和以前一样，找到一个看起来健康的细胞区域，并获取视野的暗场图像。然后在 DIC 中对齐显微镜并确保曝光时间足够。使用级联相机采集 DIC 图像。

在此设置中，使用凉爽的 SNAP 相机获取荧光图像，同时显微镜仍在 DIC 中对准。将显微镜 VAR 设置为 1 x，将视口设置为 100% 双目，并将图像从目镜转移到相机。将蓝色 LED 放在冷凝器上以照亮磁场。

然后预览 RSS 图像中的视野并调整微调焦距。如有必要，获取 A DIC 图像并保存到光盘。请注意，视野与从级联相机获得的视野有何不同。

这些图像必须在实验的分析阶段进行注册。接下来，将荧光滤光片立方体移动到位，并使用显微镜快门短暂打开荧光激发，获取荧光图像，然后在采集完成后立即将其关闭。为了最大限度地减少光漂白，请将荧光图像保存到光盘中。

要获取过滤后的图像，请将显微镜重置为视场并通过 LSM 端口发送光线。和以前一样，像以前一样运行整个 Gabor 过滤器组脚本，以完成一个时间点的数据采集，而细胞仍在舞台上并且不会干扰视野。使用芯吸方法换掉含有 STS 的 1 微摩尔溶液的常规 L 15 培养基。

在实验过程中，通过将培养基移液到细胞板的凹槽中，而不将其从载物台上移开或干扰视野，添加额外的培养基以防止干燥。现在，对后续时间点重复这些步骤，直到实验完成。收集的数据将包括大量过滤图像，必须对其进行处理才能提取亚细胞结构数据。

这里显示了两个示例实验。该图显示了海洋硅藻样品的连续图像。定向特征清晰可见。

在暗场成像中。标记为 5 等于 0 度到 5 等于 160 度的光学过滤图像与样品的未过滤图像一起显示。为了进行比较，硅藻的 9 张 Gabor 滤波图像集针对对象方向进行了逐像素处理。

在每个像素处，最大信号除以平均信号作为滤波器方向的函数，得到一个纵横比值。在这里，在没有首选响应角度的区域中存在接近 1 的纵横比（由蓝色表示）。红色表示的值较大，表示存在较高首选角度响应的区域。

总 GABOR 滤波器响应的亮度和代码重要性，即滤波器方向，在每个像素处给出的最大信号对应于垂直于底层对象方向的方向。子结构粒子方向编码在颤动图中，其中每条线都与未过滤暗场中可见的基本局部对象方向密切相关。Quiver 图显示响应强度大于最大值 10% 的物体的方向。

这些暗场和光过滤的视野图像包含活牛内皮细胞，随后在用细胞凋亡诱导剂 stor sporin 处理后 3 小时内每 20 分钟采集一次过滤图像。在这里，上图中的纵横比图和下图中线粒体的荧光成像显示为时间的函数。色调代表取向的程度，因为在这些时间图比较用 S thoro 孢子素处理的内皮细胞中颗粒取向程度的降低之前，单个轨迹代表单个细胞内的时间图。

即用定向性仅限于与荧光区域配准的细胞区域。现在，针对荧光的验证已经实现。它变成了档案。

因此，在接下来的实验中，可以通过省略荧光成像步骤并直接使用光散射方法进行线粒体测量。我们刚刚向您展示了如何使用基于 Gabor 过滤器的光散射特征来监测细胞凋亡过程中的线粒体片段化。进行此程序时，重要的是要做好良好的生活方式准备，并确保光学设置正确对齐和校准。

因此，让我们了解一下观看和 CoLab 与 UI 实验的意义。