Name: 基于二维Gabor滤波器的光散射显微镜 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-06-02T17:15:00.000+00:00
Duration: 14 min 58 s
Description: 学习使用基于二维Gabor滤波器的光散射显微镜技术，通过暗场成像定量检测活细胞中线粒体碎裂动态变化。该方法无需荧光标记即可实时监测细胞凋亡过程中的亚细胞结构变化。

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本研究中的微镜装置由Whitaker基金会资助，项目编号为RG-02-0682，授予N. Boustany。后续工作由美国国家科学基金会资助，项目编号NSF-DBI-0852857，授予N. Boustany。R.M. Pasternack部分受罗格斯大学校长研究生奖学金支持。我们还要感谢E. White博士为我们研究中使用的iBMK细胞提供的帮助，以及D.N. Metaxas博士在光学滤波策略方面提供的有益讨论。

1. 准备细胞
<ol>
 <li>前一日接种的细胞需要用Mitotracker Green进行标记，以便对线粒体进行荧光成像。</li>
 <li>从4°C冰箱中取出先前配制的DMSO溶解的100 μM Mitotracker Green储备液，用手温热至室温。同时取出先前准备好的牛主动脉内皮细胞（BAEC）培养基，放入台面水浴中温热至37°C。</li>
 <li>待Mitotracker和培养基升温后，将其放入超净台内，并用70%乙醇溶液对戴手套的手部及所有容器外表面进行消毒。请勿打开超净台的照明灯，因为荧光标记对光敏感，在环境光下会迅速发生光漂白。</li>
 <li>线粒体标记的浓度至关重要：浓度过低无法有效标记线粒体，而过高则可能导致Mitotracker产生毒性作用。通常使用100 nM终浓度的Mitotracker与细胞共孵育45分钟效果良好。配制方法为：将100 μL Mitotracker储备液加入10 mL培养基中，混匀后置于15 mL离心管中。此体积足以满足至少一次实验所需。</li>
 <li>使用连接真空泵的巴斯德吸管吸除原有培养基，随后立即向6孔板中每个接种了细胞的孔加入2 mL标记好的培养基。</li>
 <li>由于荧光标记物对光敏感，更换后应迅速将细胞放回培养箱，避免暴露于直射的室内光线。可用双手覆盖6孔板以实现避光。细胞将在培养箱中孵育45分钟。</li>
</ol>
2. 准备光学装置
<ol>
 <li>在细胞于培养箱中孵育的同时，我们需要开启光学装置。在光学间内，首先打开汞弧灯，然后依次开启计算机、显微镜、相机和激光器。接着，插入数字微镜装置（DMD）和旋转扩散器。</li>
 <li>通过显微镜目镜观察，检查光路是否对准，确保视野被激光均匀明亮地照亮。</li>
 <li>清洁物镜时，将一张镜头纸折叠成紧密的小方块，并用止血钳夹紧。将镜头纸浸入无氨玻璃清洁液中，使其吸收少量液体。用止血钳在空闲的手上轻敲数次，以去除多余液体。用干净、连续的一次性擦拭动作，从一端到另一端牢固地擦拭物镜，确保覆盖中央镜头区域。切勿重复擦拭或用力摩擦。使用后的纸张应丢弃。</li>
 <li>加载样品时，先将物镜降至最低位置，在63倍油浸物镜上滴加1–2小滴浸油。然后将网格片放置于载物台上。再缓慢升起物镜，使浸油与样品接触并“吸附”样品。通过目镜对样品进行聚焦。</li>
 <li>为对准聚光镜，调节其高度，使其在中心科勒照明下对齐，方法是聚焦聚光镜视场光阑的六边形边缘。如有必要，旋转聚光镜居中调节旋钮，将视场光阑居中于视野中央。聚光镜孔径光阑应保持关闭状态。</li>
 <li>启动IPlab程序，并输入设置以操作RoperScientific Cascade 512相机。确认相机已设置为帧转移模式。运行“Acquire focus”命令以启动实时预览。设置图像保存的索引前缀及存储路径。</li>
 <li>启动RSImage程序，并输入设置以操作CoolSnap程序。时钟模式应设置为正常（normal）。</li>
 <li>启动DMD软件，在脚本菜单中选择暗场光阑，然后执行“Load and Reset”命令并运行该脚本。</li>
 <li>将显微镜的optovar和视窗设置为LSM模式，以将光线引导至DMD和Cascade 512相机。此设置将使图像通过DMD和已对准的光学系统，将暗场（DF）图像投射到CCD上。暗场（DF）图像应已出现在IPlab的实时预览中。如有必要，调节显微镜的微调焦旋钮，使预览图像清晰对焦。</li>
 <li>使用“acquire single”命令拍摄视野的静态图像。设置足够长的曝光时间，确保图像中信号计数至少达到10000。采集完成后，使用“save as indexed”命令将图像保存至磁盘。该网格片图像用于测量视野（FOV）的尺寸。</li>
 <li>移动网格片样品，使其完全移出视野范围，仅保留背景可见。以足够长的曝光时间采集背景图像，确保获得至少5000计数的信号。该图像将用于未滤波图像的背景扣除处理。</li>
</ol>
3. 加载滤波器组并使用该装置获取滤波背景图像
<ol>
 <li>现在，我们需要获取背景的Gabor滤波图像。将Gabor滤波器组脚本加载到DMD控制软件中。运行整个脚本，将滤波器缓存至DMD的板载内存；此过程可能需要几分钟时间。</li>
 <li>当整个脚本已缓存完成后，即可开始采集背景的滤波图像。在DMD软件中使用起始和终止标记，指示DMD每次仅加载对应于一个Gabor类滤波器的一组滤波器，并运行脚本。实时图像预览应从暗场变为该滤波器对应的滤波图像。</li>
 <li>从磁盘中打开IPlab中的采集脚本。调整曝光时间，确保采集到的信号至少达到2000计数。在DMD脚本运行期间，取消IPlab中的实时预览，并运行采集脚本。该操作将自动采集、索引并保存滤波图像至磁盘。</li>
 <li>获取第一幅图像后，停止DMD软件中正在运行的脚本，并从脚本中删除已使用的命令。将起始和终止标记移至下一组滤波器的开头和结尾位置，然后在IPlab中重复图像采集过程。</li>
 <li>重复步骤3.4，直至完成整个滤波器组的使用，并获取和保存所有滤波图像。</li>
</ol>
4. 细胞接种
<ol>
 <li>此时，细胞即将准备好用于实验接种。将实验台上的电烙铁插上电源。取出L15观察培养基并加热至37°C。准备一个工作台，铺上纸巾和擦镜纸。通过撕取并捻搓擦镜纸制作若干吸液芯。这些吸液芯将有助于向细胞培养板中添加或移除液体。</li>
 <li>接下来需要对样品进行接种。我们使用加工好的金属样品支架来承载细胞，将盖玻片夹在金属板之间，形成“盖玻片三明治”结构。用注射器在金属板孔的上缘均匀涂抹一圈薄薄的真空脂，涂抹范围约延伸至两侧凹槽的一半位置。轻轻将一片洁净的1号盖玻片压在真空脂上。翻转金属板，在孔的另一侧边缘也涂抹真空脂。关闭室内灯光。</li>
 <li>现在从培养箱中取出细胞，操作时佩戴经70%乙醇消毒的丁腈检查手套。从培养箱中取出细胞培养板，打开培养箱门时注意屏住呼吸。注意尽量减少细胞暴露在室内光线下。</li>
 <li>从六孔板中取出将用于实验的盖玻片，注意原来朝上的那一面是附着细胞的一面。小心地将盖玻片两面轻轻擦干，直至几乎完全干燥，同时始终明确标记有细胞的一面。然后将盖玻片有细胞的一面朝下，压入金属板上涂有真空脂的观察孔中，确保真空脂层内无任何气隙残留。真空脂必须形成防水密封，以便后续加入L15培养基。确认密封良好后，将金属板翻转回来。</li>
 <li>用移液器将L15培养基注入接种好的细胞中，使液体通过上层盖玻片与金属板之间的凹槽进入。每次移取200 μL效果较好。第一次加入的液体应充满两片盖玻片之间的空间，并几乎延伸至另一侧的凹槽处。</li>
 <li>再次向接种的细胞中加入200 μL培养基，但此次在相对一侧的凹槽处放置一根吸液芯，使培养基从一侧流向另一侧。此步骤可清洗细胞并去除残留的旧培养基。注意防止此过程中产生气泡。每次冲洗使用新的吸液芯，重复此过程2–3次。</li>
 <li>还记得之前插上的电烙铁吗？现在是使用它的时候了。再次将金属板倒置，用手从边缘托住，使液体保留在细胞储存区而不会滴落。将电烙铁浸入瓦拉普（valap）烧杯中，使其尖端迅速熔化部分瓦拉普并附着其上。用电烙铁尖端作为涂抹工具，小心地将熔化的瓦拉普沿底部盖玻片（此时朝上）的边缘均匀涂抹。反复蘸取并涂抹，直至完全环绕盖玻片边缘一圈，将盖玻片牢固密封至金属板上。</li>
 <li>底部盖玻片上生长有细胞，其暴露面可能残留干燥培养基的痕迹。用揉成球状的擦镜纸，像清洁显微镜物镜一样，以单向滑动的方式清洁盖玻片表面，去除任何残留物。这样可确保在中心观察区域的盖玻片最为洁净。</li>
 <li>拔掉电烙铁电源，并将六孔板按相同的无菌与防护程序放回培养箱。将接种好的细胞样品送至光学实验室，并按照步骤2.4和2.5所述方法安装到物镜上。</li>
</ol>
5. 进行实验
<ol>
 <li>寻找一个细胞状态良好且形态健康的视野区域。</li>
 <li>获取该视野的暗场图像。将显微镜调整至微分干涉差（DIC）模式，并采集DIC图像。确保曝光时间足够长，以保证信号充足。</li>
 <li>现在需要在另一台相机上获取荧光图像。为了在CoolSnap相机上获得DIC图像，我们使用连接在聚光镜上的蓝色LED，根据需要进行安装或移除。在显微镜仍保持DIC对准的状态下，将显微镜的光学变倍器（optovar）设置为1.0x，视口设置为100%双目镜，将成像光路从目镜转向相机。将LED放置在聚光镜上方以照亮视野，在RSimage软件中预览视野（FOV），必要时进行精细调焦。采集DIC图像并保存至磁盘。注意此视野与Cascade相机所获取的视野存在差异。这些图像需在实验后的数据分析阶段进行图像配准。</li>
 <li>通过将滤光立方切换至荧光素（fluorescein）滤光立方来获取荧光图像。短暂开启显微镜的荧光激发光源进行成像，一旦图像采集完成即刻关闭光源。由于样品已在DIC模式下完成聚焦，因此荧光图像也处于聚焦状态。此举可减少荧光曝光时间，从而减缓光漂白现象。将荧光图像保存至磁盘。</li>
 <li>接下来需要获取经过滤波处理的图像。将显微镜重置回暗场模式，并按照步骤2.9的操作，将光路重新导向LSM端口。</li>
 <li>运行完整的Gabor滤波器组脚本，操作如步骤3.3–3.5所述。至此，我们已完成一个时间点的数据采集工作。</li>
</ol>
6. 更换培养基以使细胞暴露于星形孢菌素（STS），并在整个实验过程中维持该培养基
<ol>
 <li>在细胞仍位于载物台上且不干扰视野的情况下，将常规L-15培养基更换为含有1 μM STS的培养基，该培养基由DMSO中4 mM STS储备液稀释而成。使用步骤4.6中所述的毛细吸液法更换培养基。</li>
 <li>接下来，我们对后续时间点重复步骤5.2–5.6。重复此过程直至实验完成。</li>
 <li>在实验过程中，需添加更多培养基以防止样品干燥。可通过移液器将培养基直接加入细胞培养板的沟槽中完成，无需将样品从载物台上取下，也不干扰视野（FOV）。</li>
</ol>
7. 代表性结果
实验结束后，收集到的数据将包含大量需要处理的滤波图像，以提取亚细胞结构信息。以下是使用由9个类似Gabor滤波器组成的光学滤波器组的两个示例，滤波器周期S=0.95μm，高斯包络标准差s=S/2=0.45μm，取向Φ从0°到160°，以20°为增量递增。（更多细节参见[1]）。
示例 1：海洋硅藻
我们首先将方向敏感滤波器组应用于一种具有明显取向特征的海洋硅藻样本（Carolina Biological Supply Company），这些特征在暗场（DF）成像中清晰可见（图1）。经过光学滤波的图像与未滤波的样本图像并列展示，以便比较。
<img src="/files/ftp_upload/1915/1915fig1.jpg" alt="暗场显微镜图像、暗场设置、不同角度（Φ=0° 至 Φ=160°）、10 µm 比例尺。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 1"> 图 1：海洋硅藻的暗场（DF）及光学滤光图像。我们将分析图像右下角的硅藻（最左侧图中的白色箭头所示）。
对硅藻的九幅Gabor滤波图像进行了逐像素处理，以确定目标物的方向性和圆度。处理过程包括：（1）对每个像素点上九幅Gabor滤波图像的测量响应值求和，以确定信号响应的整体幅度，从而编码响应的显著性；（2）找出响应最大的Gabor滤波器方向Φ，并将该最大响应与所有角度下的平均响应之比作为参数，从而编码每个像素处目标物具有偏好方向的程度。方向性程度与颗粒的几何长宽比密切相关。在图2B中，像素对滤波器组的整体响应（参数1）和方向性程度或长宽比（参数2）分别以颜色饱和度和色调进行编码。长宽比接近1的区域（蓝色）表示无明显偏好响应角度，而较大值的区域（红色）表示存在更强的偏好角度响应。亚结构颗粒的方向性以箭量图表示（图2C），其中每条线段的方向与未滤波暗场图像中可见的局部目标物方向高度一致（图2A）。
<img src="/files/ftp_upload/1915/1915fig2.jpg" alt="显示细胞结构和测量结果的显微镜图像；比例尺为 10 μm，带有矢量叠加。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 2"> 图 2：A：硅藻的暗场图像。B：物体取向图像。颜色标度表示取向程度（长宽比），亮度编码Gabor滤波器总响应的显著性。C：响应强度大于等于最大值10%的物体取向。线段表示相应结构的长轴。
示例 2：凋亡细胞
此处展示了经相同方式处理的牛内皮细胞在佛波酯（STS）处理后的滤光图像，其处理方式与硅藻样本一致。图3显示了STS处理前T=-180分钟时细胞的未滤光暗场（DF）图像及九幅滤光图像。
<img src="/files/ftp_upload/1915/1915fig3.jpg" alt="显微镜衍射图样，不同角度φ，暗场设置，空间分辨率分析。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图3"> 图3：包含多个活体血管内皮细胞区域的暗场（DF）与光学滤波图像。
在STS处理后，每隔20分钟采集一次滤波后的图像，持续三小时。图4a显示了细胞随时间变化的长宽比图。在此图中，颜色色调表示取向程度（标注为“取向性”），其含义与上述图2b中的颜色色调相同。然而，长宽比的亮度并未根据平均滤波响应进行加权。通过将我们的长宽比图与这些细胞中标记的线粒体的荧光图像进行配准（图4b），我们确定所测得的长宽比下降仅局限于含有线粒体的细胞区域，并且与线粒体断裂同时发生，而线粒体断裂可在同一细胞的荧光图像中直接观察到。图5显示了经历凋亡的细胞中长宽比随时间变化的时间曲线图。在每个细胞内，在与荧光标记线粒体对应的位置，T=60–100 min时出现长宽比下降，而在与弱背景荧光区域对应的位置则未出现该现象。
<img src="/files/ftp_upload/1915/1915fig4.jpg" alt="显示取向性和时间依赖性变化的细胞成像分析；显微镜结果。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图4"> 图4：经凋亡诱导剂星形孢菌素处理的内皮细胞的长宽比（a）和荧光（b）图像。
<img src="/files/ftp_upload/1915/1915fig5.jpg" alt="BAEC 细胞取向图；荧光区域与非荧光区域对比；STS 1µM；t 检验；p &lt; 0.01 和 p &lt; 0.15。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 5"> 图 5：比较经星形孢菌素处理的内皮细胞中颗粒长径比（取向性）下降的时间变化图。每条曲线代表单个细胞内的随时间变化情况。取向性的下降仅出现在与荧光标记线粒体相对应的细胞区域（左图），而在其余背景荧光区域则未观察到该现象（右图）。
现在我们已确定长宽比的下降对应于线粒体断裂，便可在此类细胞中诱导凋亡，并利用光学散射方法测量断裂程度 无需对细胞进行标记，并研究不同遗传和实验条件对这一动态过程的影响。

<ol><li>Pasternack, R. M., Qian, Z., Zheng, J. -Y., Metaxas, D. N., White, E., Boustany, N. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+Subcellular+Texture+by+Optical+Gabor-Like+Filtering+with+a+Digitial+Micromirror+Device%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+Letters%22%5BJournal%5D)">Measurement of Subcellular Texture by Optical Gabor-Like Filtering with a Digitial Micromirror Device.</a> Optics Letters. 33 (19), 2209-2211 (2008).</li>
<li>Pasternack, R. M., Qian, Z., Zheng, J. -Y., Metaxas, D. N., Boustany, N. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+sensitive+size+discrimination+of+submicron+objects+using+optical+Fourier+filtering+based+on+two-dimensional+Gabor+filters%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Highly sensitive size discrimination of submicron objects using optical Fourier filtering based on two-dimensional Gabor filters.</a> Optics Express. 17 (14), 12001-12012 (2009).</li>
<li>Zheng, J. -Y., Pasternack, R. M., Boustany, N. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+scatter+imaging+with+a+digital+micromirror+device%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Optical scatter imaging with a digital micromirror device.</a> Optics Express. 17 (22), 20401-20414 (2009).</li>
</ol>

该方法的某些方面已包含在发明披露中，罗格斯大学档案号 # 09-049。

上述方法可生成物体的形态测量图，例如可用于编码颗粒大小或取向。此类结构信息可通过多种方式加以利用：
<ol>
 <li>该方法可作为初步筛选手段，用于识别特定处理过程中发生改变的组织或细胞区域，随后利用特异性的分子和生化检测方法对这些区域进行深入分析。</li>
 <li>该方法可与荧光技术联合使用，实现细胞的多模态分析，同时结合荧光法对分子活性的解析与本方法对亚细胞结构的定量表征。</li>
 <li>一旦某一特定的结构响应与特定生物学过程（如细胞凋亡）中的特定细胞器活动相关联，便可无需任何荧光标记，直接利用该方法筛选影响此结构响应的不同遗传和实验条件。</li>
</ol>
迄今为止，我们已证明该方法对粒径差异的检测灵敏度可达30-50 nm [2]。我们还表明，该方法能够检测颗粒取向和长径比的变化 [3]，以及与凋亡诱导的线粒体裂变一致的颗粒长径比降低（见上述图4-5）。
示例2的结果表明，我们的方法允许对细胞功能进行动态测量，这些测量结果可解释为特定细胞器功能的反映，并且无需使用荧光标记或外源性染料即可采集...

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>低糖DMEM</td></tr><tr><td>Liebowitz L15培养基</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>不含酚红</td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mitotracker Green</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>牛脑提取物</td><td>Clonetics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Gemini Bio Products</td><td></td><td></td></tr><tr><td>肝素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>星形孢菌素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>二甲基亚砜</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>倒置显微镜</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td>Axiovert 200M</td><td></td></tr><tr><td>DMD</td><td>Texas Instruments</td><td>TI 0.7 XGA DMD 1100</td><td></td></tr><tr><td>CCD</td><td>Roper Scientific</td><td>Cascade 512B</td><td>高动态范围（16位）CCD</td></tr><tr><td>CCD</td><td>Roper Scientific</td><td>Coolsnap cf</td><td></td></tr></tbody></table>

基于二维加博尔滤波器的光散射显微技术

Optical Scatter Microscopy Based on Two-Dimensional Gabor Filters

我们展示了一种显微仪器，能够测量未染色活细胞中由细胞器形态及其组织方式引起的亚细胞纹理。该仪器将无标记光学显微镜的灵敏度扩展至细胞器尺寸与形状的纳米级变化，可用于加速研究与基本生物过程（如程序性细胞死亡或细胞分化）相关的细胞器动力学结构-功能关系。该显微镜可轻松集成于现有的显微镜平台，因此可推广至各个独立实验室，使科研人员能够自由实施并使用所提出的方法。
该技术通过二维光学Gabor滤波器观察细胞，能够表征亚细胞结构。这些滤波器可被调节至对非球形亚细胞器的尺寸和取向等特定形态学特征具有纳米级（数十纳米）灵敏度的感知能力。尽管该技术基于弹性散射产生的对比度，但其提取形态测量参数时并不依赖于详细的逆散射模型或Mie理论。因此，该方法适用于那些难以用精确理论散射模型描述的非球形细胞器，并可在未染色的活细胞内获取独特的形态计量参数以评估其功能。与数字图像处理技术相比，该方法的优势在于直接作用于物体场的变换域，而非离散化物体的强度图像。它不依赖高图像采样率，因而能够快速同步筛选数百个细胞内的形态学活动，从而极大推动了对细胞器结构的研究，超越了通过荧光共聚焦显微镜对有限视场的高倍数字图像进行单个细胞器分割与重建的传统方法。
在本演示中，我们展示了来自一种海洋硅藻的数据，以说明该方法。我们还展示了从活细胞中获得的初步数据，以说明该方法在相关生物学背景下的可能应用方式。

我们展示了一种基于类伽博滤波的暗场显微技术，用于测量单个活细胞内的亚细胞动态。该技术对细胞器结构的变化具有高灵敏度，例如线粒体断裂。

我们展示了一种显微仪器，可测量未染色活细胞内由细胞器形态及排列所引起的亚细胞纹理。

在本视频中，采用光散射显微技术定量分析细胞凋亡过程中的线粒体断裂现象。尽管光散射显微技术通常无需荧光标记，但本实验方案中将采集荧光图像以用于验证目的。在完成成像系统的设置后，细胞将用MIT tracker green进行标记，并用stor sporin处理以诱导细胞凋亡。获取光学数据以检测细胞器在两小时内方向性的变化。线粒体断裂的起始可通过光学散射数据进行测量，该数据显示亚细胞颗粒方向性程度降低。随后通过将光学散射数据与含线粒体的荧光区域进行关联，对数据进行验证。大家好，我是来自罗格斯大学生物医学工程系生物光学实验室的 Nada Bustani。我是生物光学实验室的 Rob Pak，我是来自生物实验室的 Deen。今天我们将向您展示一种无需使用荧光染料即可量化亚细胞形态动态变化的实验方法。我们在实验室中使用该技术来研究细胞凋亡或程序性细胞死亡过程中亚细胞结构的动态变化。现在让我们开始。首先用70%乙醇对戴手套的手进行消毒。然后将一管配制好的100纳摩尔浓度的Miot Tracker Green储备液和预热的BAEC细胞培养基放入超净台内，并关闭光源，对所有表面进行消毒。接着将接种在盖玻片上的六孔培养板置于超净台中。使用连接真空泵的巴斯德吸管。从孔中移除细胞培养基，然后立即向每孔加入2毫升标记培养基以标记线粒体。盖好组织培养板，避免暴露于直射的室内光线下，并迅速将细胞放回培养箱中。在细胞孵育的同时，于 37 摄氏度孵育 45 分钟。首先打开汞弧灯电源，启动光学装置。然后开启计算机、显微镜相机和激光器，将数字微镜装置（DMD）插入旋转扩散器中。接下来，通过显微镜目镜观察光学激发是否已对准。视野应被激光均匀明亮地照亮。加载样品时，将一至两小滴浸油滴加在63倍油镜物镜上，此时物镜应处于最低位置。然后在载物台上安装一个载玻片，其上带有以10微米为间隔的规则线条网格，称为格栅，并升高物镜，使镜油接触并聚焦。接着，调节聚光镜视场的六边形边缘，使其对焦，并调整至居中，实现科勒照明。六边形边缘应在目镜中居中并清晰对焦。然后使用聚光镜视场光阑位置调节旋钮，将聚光镜视场光阑居中于视场内。启动 IP 实验室软件，并输入设置以操作相机。确认相机已设置为帧转移模式。运行采集对焦命令以启动实时预览。然后设置索引前缀以及图像将要保存的文件位置。接下来，启动 RS 成像。设置 Cool Snap 相机的工作参数，时钟模式应设为正常。启动 DMD 软件。将暗场光圈放置在脚本菜单上，然后点击加载和重置。手动运行脚本时，将显微镜视窗中的 optiv 栏设置为 LSM。这会将图像通过已对准光学系统的 DMD 进行传输，并将暗场图像投射到 Cascade five 12 相机的 CCD 上。暗场图像应显示在IP实验室的实时预览中。如有必要，在实时预览中对图像进行聚焦。将曝光时间设置得足够长，以确保图像中的信号至少达到10,000计数。然后在采集后使用“采集单张图像”命令拍摄视野快照。使用“另存为索引图像”命令将图像保存到磁盘。GTI 的图像用于测量视野的大小。现在移动 GTI 样品，使其超出视野范围，仅显示背景。以足够的曝光时间拍摄该区域的背景图像，以获取至少 5,000 个计数。该图像将有助于对未滤波图像进行背景扣除。现在，为了获取背景的加博尔滤波图像，请将加博尔滤波器组脚本加载到DMD控制软件中。运行整个脚本，以将滤波器缓存至DMD的板载内存中。一旦整个脚本完成缓存，可能需要几分钟时间。使用 DMD 软件中的开始和停止标记，确保每次仅加载一组与一个类Gabor滤波器对应的滤波器。运行脚本以获取背景的滤波图像。实时图像预览应从暗场变为滤波后的图像。对于该滤光片，从磁盘中在IP实验室中打开采集脚本。调整曝光时间，以确保至少采集到2000个计数。当DMD脚本运行时，取消IP实验室中的实时预览，并运行采集脚本。这将自动获取索引并将滤波后的图像保存到磁盘。获取第一幅图像后，停止 DMD 中运行的脚本，并从脚本中删除已使用的命令。然后替换下一组滤光片起始和结束位置的起始与终止标记。在 IP 实验室中重复采集过程，直至使用完全部滤光片组并获取和保存所有滤波后的图像。准备接种细胞：将电烙铁插入实验台电源并加热，同时将 L 15 培养基加热至 37 摄氏度。准备一个工作台，铺上纸巾和无尘擦拭纸，以吸收任何溢出的培养基并保持区域清洁。通过撕开并捻搓无尘擦拭纸制备多个灯芯。这些灯芯将用于引导液体穿过细胞培养板。接下来，使用金属样品托架制作细胞夹心结构。用移液器将一细条真空脂涂抹在加工好的金属板孔洞的上部边缘周围，涂抹范围约延伸至两侧凹槽末端的一半位置。轻轻地将一块洁净的1号盖玻片覆于真空脂上。将培养皿翻转，在孔周围涂抹润滑脂。关闭室内灯光，戴上经乙醇消毒的NI试验检查手套。从培养箱中取出细胞。从六孔板中取出将用于实验的盖玻片，小心地将盖玻片晾干。然后将盖玻片细胞面朝下压入涂有润滑脂的金属板上的观察孔中。将细胞夹在培养板内，确保无气泡残留，并且石蜡已形成防水密封，以便加入培养基。现在将培养板翻转回来，每次移液 200 µL。通过上层盖玻片与金属板之间的槽口，将预热的 L-15 培养基加入灌流小室，直至液体几乎到达另一侧的槽口。接着，在相对一侧的槽口处用吸水纸作为引 Wick，再用移液器向灌流小室内加入 200 µL 培养基，以洗涤细胞。随着吸水纸将旧培养基吸出，新鲜培养基会从一侧流向另一侧。此步骤中需小心避免液体中产生任何气泡。每次冲洗使用新的灯芯，重复此过程两到三次。现在再次倒置培养板，从边缘支撑培养板，以使液体保留在细胞储液区中。将烙铁浸入盛有 Veap 的烧杯中，快速熔化部分 Veap，使其附着在烙铁尖端。用烙铁尖小心地将熔化的 Veap 涂抹在底部盖玻片的边缘。持续重复浸入和涂抹操作，沿盖玻片的整个周边进行，将其密封固定在金属板上。这样可形成良好的机械密封，防止在观察过程中盖玻片从培养板上脱落。用无尘纸揉成团擦拭盖玻片底面，清除任何残留物。以单次滑动动作盖上盖玻片，确保盖玻片中心区域最洁净，该区域将用于观察。将六孔板放回培养箱。将接种有细胞的培养板送至光学实验室，并安装到物镜上。与之前相同，找到一个状态良好的细胞区域，获取该视野的暗场图像。然后调整显微镜至微分干涉差（DIC）模式，并确保曝光时间适当。使用级联相机采集一幅DIC图像。在此设置中，当显微镜仍处于微分干涉差（DIC）对准状态时，使用cool SNAP相机采集荧光图像。将显微镜的VAR设置为1倍，视口设置为100%双目，并将图像从目镜转向相机。在聚光镜上方放置一个蓝色LED以照亮视野。然后在 RSS 图像中预览视野并调整细焦。如有必要，采集微分干涉相差（DIC）图像并保存至磁盘。注意此视野与级联相机所获得的视野有何不同。这些图像需要在实验的分析阶段进行配准。接下来，将荧光滤光立方体移至工作位置，并通过显微镜快门短暂开启荧光激发光源以获取荧光图像，一旦图像采集完成，立即关闭光源。为尽量减少光漂白，应将荧光图像保存至磁盘。为获得滤波图像，将显微镜重置至明场模式，并将光线导入 LSM 端口。与之前相同，运行完整的 Gabor 滤波器组脚本，以完成一个时间点的数据采集，此时细胞仍保留在载物台上，且不改变视野位置。采用毛细引流法，将常规 L-15 培养基更换为含有 1 µM STS 溶液的培养基。在实验过程中，通过移液将培养基加入细胞培养板的沟槽中，以防止干燥，注意不要将培养板从载物台上取下或干扰观察视野。接下来，重复上述步骤，持续获取后续时间点的数据，直至实验结束。所收集的数据将包含大量经过筛选的图像，需进一步处理以提取亚细胞结构信息。此处展示了两个示例实验。该图显示了一种海洋硅藻样品的连续图像，其定向特征清晰可见。在暗场成像中，展示了标记为五等于0度至五等于160度的光学滤波图像，以及样品的未滤波图像。作为对比，对硅藻的一组九幅Gabor滤波图像进行了逐像素处理，以分析物体的取向。在每个像素点，将最大信号与不同滤波器方向下的平均信号相除，得到一个各向异性比值。此处，接近1的各向异性比值以蓝色表示，出现在无显著偏好响应角度的区域；而以红色表示的较大比值则指示存在较高偏好角度响应的区域。总GABOR滤波器响应的亮度和编码意义，以及在每个像素处产生最大信号的滤波器方向，对应于基础物体方向的垂直方向。亚结构颗粒的方向信息被编码在矢量图中，其中每条线段均与未滤波暗场图像中可见的基础局部物体方向高度一致。该矢量图显示了响应强度超过最大值10%的物体的取向。该视野的暗场和光学滤光图像包含活体牛内皮细胞，在使用凋亡诱导剂staurisporin处理后，每隔20分钟采集一次滤光图像，持续三小时。此处，上方图显示了随时间变化的长宽比图谱，下方图显示了线粒体的荧光成像。颜色色调表示取向程度，与之前相同，这些时间曲线比较了经staurisporin处理的内皮细胞中颗粒长宽比取向程度的下降情况，单个轨迹代表单个细胞内的随时间变化曲线。液滴的取向性局限于与荧光区域对应的细胞区域。现在，已实现对荧光的验证，结果具有可存档性。因此，在接下来的实验中，可以通过省略荧光成像步骤，直接采用光散射方法进行线粒体测量。我们刚刚向您展示了如何利用基于伽博滤波器的光散射特征来监测凋亡过程中的线粒体断裂。在执行该操作时，重要的是要做好良好的细胞状态准备，并确保光学系统已正确对准和校准。因此，让我们以合理的方式进行观察，并通过UI实验与CoLab协作。

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