图案与数字微镜装置Photostimulation调查跨分支点的树突状融合

该程序的总体目标是控制时间和空间上复杂的光模式，以便它可以用于刺激神经元。这是通过首先将 DMD 芯片定位在显微镜光路中适当的共轭图像平面来实现的。该程序的第二步是用强光源（如激光）正确照亮 DMD。

该过程的第三步是消除相干照明的斑点效应。该过程的最后一步是集成图形用户界面以作 DMD 芯片。最终，可以获得结果表明，通过使用 DMD 系统对笼状神经递质进行多位点裂解，现在可以相对容易地完成以前难以完成的实验。

大家好，我是 Michael Mohammed，是马里兰大学神经病学系 Chaman Tang 博士的实验室。今天，我们将向您展示一种在光学显微镜中生成复杂消除模式的程序。我们在实验室中使用该程序来研究树突整合。

那么让我们开始吧。该协议将演示用于实验神经科学的数字微镜设备或 DMD 照明系统的作。DMD 是一种光学半导体芯片，在其表面有数十万个微型可移动镜子，排列成矩形阵列，每个镜子的位置对应于图像的像素。

每个镜子都可以单独控制，以便在两个方向之间倾斜。在关闭方向上，光线被引导远离样品照明的光轴。在 on 方向上，光线沿光轴定向。

DMD 非常适合裂解，因为它可以耐受非常强的紫外光，在开和关像素之间产生高对比度，并且可以在数十微秒内在两种状态之间切换。图像处理软件和硬件的广泛使用以及图像显示领域的商业利益有助于 DMD 在生物医学研究中的应用。德州仪器 （TI） 将模块化组件作为 DLP 发现工具包进行销售，提供支持的电子驱动程序，使 DMD 适应微观系统。

需要了解有关显微镜光学的基本概念。基本的现代荧光显微镜由成像路径和照明路径组成。它由一个物镜、一个滤光片立方体和两个用于成像和照明路径的不同镜筒透镜组成。

显微镜设计为具有与标本图像平面共轭的位置，其中在标本平面上聚焦的物体也将出现在这些共轭图像平面上。这个概念的一个推论是，在共轭图像平面上创建的任何明亮图像也会被急剧投影到标本图像平面上。该策略用于将计算机生成的照明图案投影到试样上。

激光束用作非常明亮的光源，将照亮位于共轭图像平面上的 DMD 芯片上的微镜实现的图案。DMD 照明系统的设计取决于用于光遗传学实验的激发光，该激发光利用可见光波长的光。发光图案可以通过相机路径引入。

因此，DMD 芯片可以简单地安装在双摄像头端口模块的两个摄像头端口之一上。相反，对于使用 UV 范围内光的实验，例如笼状化合物的裂解，必须将光引入落射照明路径，并且必须创建更易于访问的共轭图像平面。这是因为成像管镜头不是为紫外线透射而设计的。

相反，照明管透镜用于紫外线透射，并在图像形成中发挥足够的作用。DMD 上的每个微镜都可以在相对于芯片平面的 12 度正倾斜和负倾斜之间切换。根据它从计算机接收到的数字输入，旋转轴沿着每个镜子的对角线角，与芯片的矩形边成 45 度角。

镜子倾斜的方向由芯片前表面一角的金色三角形表示。微镜的倾斜度决定了入射照明光束的间距和方位角的对齐方式。要照亮 DMD，首先将照明光束的间距配置为与 DMD 芯片的垂直轴成 24 度角，并将方位角配置为垂直于反射镜旋转轴。

精确的光束对准对于高效运行至关重要。用于裂解实验。使用激光源产生快速解笼所需的高强度可聚焦光束。

这里采用准连续二极管泵浦固态频率三倍 ND ate 激光器，使用相对高功率的激光器，因为实际上只有一小部分激光输出被传送到样品。使用 DMD 系统时，然后将激光器的输出发射到多模光纤中，以便可以轻松地将其定位并沿正确的轴定向，以便照亮 DMD，从而为散斑提供解决方案。相干照明产生的问题通过光纤传输光。

光纤缠绕在 pazo 电动光纤拉伸器上，该拉伸器被驱动使其振荡约 40 kHz。纤维的微观拉伸足以在每个光刺激脉冲的毫秒持续时间内将散斑图案移动多次，从而有效消除斑点。最后，将光纤的输出与紫外显微镜物镜进行核对，以照亮 DMD，以将 CCD 像素与 DMD 图像软件共配准，该软件将单个 DMD 反射镜与成像 CCD 相机的特定像素相关联。

软件中的图形用户界面允许用户使用图形用户界面通过计算机鼠标分配与 CCD 图像上的区域相对应的 DMD 镜像方向。通过将光标移动到计算机屏幕上显示的图像上来标记光刺激的位置，然后单击标记的感兴趣区域以对光传输模式存储进行编程。在计算机屏幕上标记为一系列单独图像的图案将每个空间图案的激光脉冲时间编程到软件中。

这将与数据采集程序 P clamp 集成。最后，使用数据采集程序来协调 DMD 电子设备的定时、激光的门控以及从目标神经元采集膜片钳电信号。这里显示了光学系统分辨率的校准。

最小光斑尺寸显示为从荧光靶标测量。有效的生理分辨率是通过电流的振幅作为光刺激的函数来测量的。这里的斑点位置，笼状谷氨酸被拍摄到一个直径为 2 微米的树突分支附近。

随着地点的移动。正交对着不同强度的光刺激的电反应被说明了。图中显示了作为裂解强度函数的电压钳位响应。

分布式树突刺激可以使用基于 DMD 的系统轻松实现。在这里，通过增加两个树突状分支上标记为圆圈的照片刺激点的数量来改变输入强度。空间求和可以是跨分支点的非线性。

随着到达两个门到分支的 input 幅度的增加，它变得越来越超线性。这些结果清楚地说明了树突状分支点之间的非线性求和方式。超线性度主要由 NMDA 受体介导，而不是由电压门控通道介导。

这可以证明为两种 NMDA 拮抗剂 A PV 和 MK 8 0 1 的应用在很大程度上消除了非线性行为。我们刚刚向您展示了基于 DMD 的系统的基本设计和作，用于神经组织的模式光刺激。该系统可适应可见光刺激，例如用于光遗传学实验。

它还可以适应用于单光子裂解的近紫外光。在执行此程序时，请务必记住，如果要使用波长小于 400 纳米的光，并且大多数人通过 Epi 照明路径外出，则照明光束在几度内的精确对准至关重要，如果使用相干光，则必须有效消除斑点。就是这样。

感谢您的观看，祝您的实验好运。