Name: 图案与数字微镜装置Photostimulation调查跨分支点的树突状融合 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-02T17:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 30 s
Description: 了解数字微镜装置光刺激技术，用于研究神经元树突分支点的非线性整合机制。该方法通过精确控制时空光模式，实现多点位笼锁神经递质释放，为神经科学研究提供新工具。

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本工作获得了美国国立卫生研究院（NIH）的RO1项目、退伍军人事务部研究服务的杰出研究评审项目对C.-M. T.的资助，以及对C.W.L.的个人国家研究服务奖（NRSA）资助。

一般设计考虑
如果光刺激的波长位于可见光范围内，例如在光遗传学实验中，系统的光路布局将比紫外光解实验简单得多。此时只需从各显微镜厂商处购买双相机接口模块即可。数字微镜装置（DMD）平面可被放置在两个相机接口中任意一个的共轭像平面位置上。但在紫外光解实验中，来自DMD的光必须通过落射式照明光路引入（图3A），因为目前所有商用显微镜中通往相机的成像管镜均未针对紫外波长进行校正。在350 nm波长下，成像管镜的球面像差严重，导致无法将光聚焦成一个精细的光斑，也无法实现足够的空间分辨率。这一问题在共聚焦显微镜中不会出现，因为在沿相同光轴引入准直激光束时，管镜会被移除。通过落射荧光光路引入紫外光可解决该问题，因为该路径中的管镜均在一定程度上对紫外波长下的球面像差进行了校正。关于显微镜光学系统，我们可以根据期刊的要求进行任意深度的阐述。科学界普遍对此类主题兴趣浓厚，但目前能够清晰讲解这一内容的资料来源尚不多见。
为了尽量减少对显微镜的改造，并考虑到落射荧光单元空间有限，将数字微镜器件（DMD）置于由中继透镜新创建的共轭像平面处（指出DMD单元相对于显微镜的位置）。选用了一款商用的紫外校正中继透镜（Specialty Optics）（在图示和显微镜上标出该透镜的位置）。
DMD的光照
当接收到二进制输入信号后，微镜可在相对于芯片平面正负12°的倾斜角度之间切换。旋转轴沿每个微镜对角顶点方向（与芯片边沿成45°角）。微镜旋转方向由芯片正面某一角落处的金色三角形标记标示。微镜的倾斜角度决定了入射照明光束的俯仰角（pitch）和方位角（azimuth）的对准方式。照明光束的俯仰角需与DMD芯片的垂直轴成24°，而方位角需垂直于微镜的旋转轴。精确的光束对准对于系统的高效运行至关重要。在我们设计的原型系统中，采用了多种手动倾斜调节机构，以校正设计和加工中的不足。这导致系统体积明显大于实际所需。也可采用其他更紧凑的结构来引入照明光（若认为有必要，可展示替代设计方案）。
进行光解实验需要使用激光光源，以产生高强度聚焦光束，从而实现快速解笼。对于不需要高强度精确聚焦光的光遗传学实验，则可采用非相干光源。本文所述的光解实验中，我们使用了一台准连续二极管泵浦固态（DPSS）三倍频 NdVO4 激光器（1 W，355 nm）。（关于光解实验中光源选择的详细讨论，请参见参考文献2）。本实验需要相对高功率的激光器，因为在使用数字微镜器件（DMD）系统时，仅有激光输出的一小部分实际传递到样品上。传递到样品上的光量与激光光束照射区域内处于“开启”与“关闭”状态的微镜数量之比成正比。
如果需要使用激光光源，最好将激光输出端连接至多模光纤，以便于将光束精确地定位并沿正确轴向对准数字微镜器件（DMD）进行照明。通过光纤传输光可解决第二个问题，即如何消除相干照明固有的散斑图案。该光纤缠绕在一个压电光纤拉伸器（型号 915，Canadian Instrumentation &amp; Research, Ltd）上，并以约 40 kHz 的频率振荡。（在实验装置中标注此部件）光纤的微观拉伸足以在每次光刺激脉冲的毫秒级持续时间内使散斑图案快速移动多次，从而有效消除散斑效应。随后，利用紫外显微物镜（Olympus DApo20UV）对光纤输出光进行准直。（在装置中标注此部件）图 3B 展示了系统的光学分辨率校准结果。图 3C 显示了通过光刺激点位置变化下的电流幅值所测得的有效生理分辨率。图 3D 展示了不同强度光刺激引发的电流反应。
系统的操作：
将CCD像素与DMD微镜共配准
编写了一款内部软件，用于确定数字微镜器件（DMD）中各个微镜与成像CCD相机特定像素之间的对应关系。该软件中的图形用户界面（GUI）允许用户将DMD微镜分配给由鼠标标记的CCD图像上的特定区域。因此，只需将光标移至计算机屏幕上显示的图像并点击标记感兴趣的区域，即可完成光刺激位置的标记。（计算机屏幕上将显示一幅树突分支的荧光图像。学生将在计算机屏幕上的图像中标记多个位置。）
设定光递送的模式
操作员在计算机屏幕上标记的图案被存储为一系列独立的图像。随后，每个空间图案对应的激光脉冲时序被编程输入至与数据采集程序（pClamp）集成的软件中。（演示此过程）。
协调激光脉冲与DMD图案
数据采集程序启动并协调DMD电子器件的时序、激光的门控，以及从目标神经元获取膜片钳电信号的过程。（在计算机上模拟此序列）
实验数据：
远端树突分支点的非线性整合
传统的树突整合电极实验通常通过在离散位置改变刺激强度来实现，而不是在保持刺激强度恒定的同时扩展刺激区域。电发生饱和以及位置依赖性通道的激活等问题可能影响实验结果与结论。使用基于数字微镜器件（DMD）的系统可轻松实现树突的分布式刺激（图4A）。通过增加光刺激光斑的数量来调节输入强度。可以看出，跨分支点的空间整合可能是非线性的，并且随着两个子分支上输入强度的增加，其整合效应逐渐呈现超线性特征。这种超线性效应主要由NMDA受体介导，而非电压门控通道所致（图5）
代表性结果
<img src="/files/ftp_upload/2003/2003fig1.jpg" alt="静态平衡示意图，侧视图和顶视图，角度测量，结构分析，倾斜力学。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 图1. DMD中微镜的操作。（侧视图）作用于单个镜面的静电力使镜面相对于水平方向向两个可能的方向之一倾斜12°。在“开启”位置，入射光束沿垂直于芯片表面的光轴方向反射；在“关闭”位置，入射光束偏离光轴48°。照射到镜面之间微小间隙的光束则偏离光轴24°。（顶视图）镜面的倾斜方向相对于镜面和芯片的边沿呈45°。
<img src="/files/ftp_upload/2003/2003fig2.jpg" alt="光学显微镜示意图，CCD检测，弧光灯照明，荧光成像装置。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 2"> 图 2. 现代荧光显微镜的基本结构。滤光立方体位于物镜与管镜之间的“无限远空间”中。存在一条通向相机的成像光路，以及一条将光引导至样品的照明光路。这两条光路所用的管镜在设计和焦距上通常不同。用于照明光路（而非成像光路）的管镜设计适用于紫外光谱范围内的工作。
<img src="/files/ftp_upload/2003/2003fig3.jpg" alt="光学激发装置示意图；包含DPSS激光器、CCD、LCD和用于光谱研究的二向色镜。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图3"> 图3. 基于紫外光的DMD系统布局。如果照明光源位于紫外光谱范围内，则必须通过专为紫外光校正的管镜引入。成像光路中的管镜并未针对紫外光设计，因此需要一个中继系统以创建一个易于接近的共轭像平面。显微镜中不同的共轭像平面由红色虚线标示。某一像平面上的明亮图案会被投射到其他共轭平面上。在成像过程中，样品平面上的图案被投射到探测器/相机上；而在照明过程中，由DMD生成的图案则被投射到样品上。
<img src="/files/ftp_upload/2003/2003fig4.jpg" alt="光学激发示意图，CCD，DMD，用于发射分析的光谱装置，弧光灯光源" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图4"> 图4. 可见光DMD投影系统的布局。如果照明光处于可见光范围，可将DMD生成的光图案导入成像光路中。通过商用双相机接口附件和合适的二向色镜即可轻松实现。
<img src="/files/ftp_upload/2003/2003fig5.jpg" alt="衍射图样分析；光强、峰值电流图、电生理结果。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 5"> 图 5. 系统的横向分辨率。（A）在荧光靶标上的光学分辨率为 ~2 μm。（B）通过在树突上光解笼锁型谷氨酸所测得的有效分辨率为 ~5 μm。分辨率距离的增加是由于谷氨酸的扩散以及树突有限宽度共同造成的。（C）光解过程可模拟突触事件的动力学特性。电压钳制下的电流响应簇是由递送到树突的光能量变化所引起的。
<img src="/files/ftp_upload/2003/2003fig6.jpg" alt="神经元信号成像，荧光显微镜，电生理学，10 µm 比例尺，膜电位图。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 6"> 图 6. 树突分支点处的非线性叠加。 （A）分别在两条树突分支上施加分布输入。其相应的电压响应如下所示。（B）随后同时施加刺激。测得的响应（红色迹线）与两个单独响应的算术和（灰色迹线）不同。
<img src="/files/ftp_upload/2003/2003fig7.jpg" alt="神经反应分析，APV效应比较，电生理数据，观测峰与预期峰。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 7"> 图 7. 超线性叠加依赖于NMDA受体。(A) APV（一种选择性NMDA受体拮抗剂）阻断了超线性叠加效应。(B) 绘制了刺激强度关系及其对NMDA受体拮抗剂的敏感性。

<ol><li>Scanziani, M., Hausser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophysiology+in+the+age+of+light%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Electrophysiology in the age of light.</a> Nature. 461, 930-939 (2009).</li>
<li>Tang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photolysis+of+caged+neurotransmitters%3A+Theory+and+procedures+for+light+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Prot.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Photolysis of caged neurotransmitters: Theory and procedures for light delivery.</a> Curr. Prot. Neurosci. , 6.21.1-6.21.12 (2006).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nature+Technology+Feature%2C+Cell+imaging%3A+Light+activated%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Nature Technology Feature, Cell imaging: Light activated.</a> Nature. 456, 826-827 (2008).</li>
<li>Lutz, C., Otis, T. S., DeSars, V., Charpak, S., DeGregorio, D. A., Emiliani, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Holographic+photolysis+of+caged+neurotransmitters%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Holographic photolysis of caged neurotransmitters.</a> Nature Methods. 5, 821-827 (2008).</li>
<li>Hornbeck, L. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHornbeck%2C+LJ+%22Digital+Light+Processing+and+MEMs%3A+An+overview%22">Digital Light Processing and MEMs: An overview</a>. , Texas Instrument White Papers. Forthcoming.</li>
</ol>

无利益冲突声明。

基于DMD的光刺激方法的优势在目标区域相对较大时最为明显。如果感兴趣的目标非常小，例如少数几个树突棘，则顺序扫描共聚焦和双光子系统可能是更合适的方法。DMD方法的一个显著缺点是其对可用光源的利用效率较低，大部分可用光必然被导向“关闭”状态的微镜而未被利用。
基于DMD的系统最适合在可见光范围内运行。我们预计，基于DMD的光刺激系统在与光遗传学实验结合使用时将产生重要影响。

Erratum: Patterned Photostimulation with Digital Micromirror Devices to Investigate Dendritic Integration Across Branch Points

<table><tbody><tr><td>现代直立式荧光显微镜</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CCD相机及图像采集软件</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>计算机及数据采集/接口系统</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DLP Discovery 开发套件</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ALP3 USB 接口</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>S2 + 光学组件（带LED）</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>双相机接口单元</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>355 nm 三倍频 NdVO4 激光器（约 1 W）</td><td>DPSS Laser Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>激光快门 Model LS6</td><td>Uniblitz</td><td></td><td></td></tr><tr><td>多模光纤及光纤拉伸器 Model# 915</td><td>Canadian Instrument and Research, Ltd</td><td></td><td>100 μm 芯径多模光纤</td></tr><tr><td>多模光纤耦合器</td><td>Oz Optics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>信号发生器</td><td></td><td></td><td>最高 50 kHz</td></tr><tr><td>光束准直器</td><td>Olympus Corporation</td><td>DApo20UV340</td><td></td></tr><tr><td>紫外中继透镜</td><td>Special Optics</td><td>#: 54-25-60-355</td><td></td></tr></tbody></table>

利用数字微镜装置进行模式化光刺激以研究树突分支点处的整合功能

Patterned Photostimulation with Digital Micromirror Devices to Investigate Dendritic Integration Across Branch Points

光是一种多功能且精确的调控神经元兴奋性的手段。近年来，光敏效应分子如通道视紫红质（channel-rhodopsin）和笼锁型神经递质（caged neurotransmitters）的引入，激发了人们对开发更优方法以在空间和时间上精确控制光模式的兴趣，这些方法在实验神经科学中具有重要应用价值。一种传统策略是在共聚焦和双光子显微镜中采用的方法，即将光聚焦到一个衍射极限的光斑，然后依次扫描该光斑覆盖目标区域。当需要在短时间内刺激较大区域时，这种方法会遇到困难，这一问题在光刺激实验中比在成像中更为突出。另一种替代策略是借助数字微镜装置（DMD）将完整的空间光模式投射到目标区域。DMD方法具有吸引力，因其硬件组件相对便宜，并且有商业支持。由于目前尚无适用于直立显微镜的现成DMD系统，本文将讨论此类DMD系统构建与操作中的关键问题。尽管我们主要描述的是用于紫外光解（UV photolysis）的系统构建，但也会提供构建更为简单的可见光系统以用于光遗传学实验的修改方案。该紫外光解系统已被用于开展神经科学中一个基础问题的研究：空间分布的输入信号如何在远端树突分支点之间进行整合。实验结果表明，这种整合在分支点之间可能呈现非线性特征，且超线性整合主要由NMDA受体介导。

数字微镜装置（DMD）能够生成复杂的时间和空间光图案，用于控制神经元的兴奋性。本文讨论了DMD系统的设计、构建和操作中的相关问题。此类系统已成功实现了对远端树突分支点间非线性整合的验证。

光是一种多功能且精确的手段，可用于调控神经元的兴奋性。近年来，光敏感效应分子（如通道视紫红质）的引入……

本实验的总体目标是控制光在时间和空间上的复杂模式，从而用于刺激神经元。实现这一目标的第一步是在显微镜光路中的适当共轭像平面位置放置一个DMD芯片。实验的第二步是使用高强度光源（如激光）对DMD进行正确照明。该操作流程的第三步是消除相干照明产生的散斑效应。最后一步是集成图形用户界面，以操控DMD芯片。最终结果表明，以往难以实现的实验现在可以通过使用DMD系统进行笼锁神经递质的多位点裂解而相对容易地完成。大家好，我是 Michael Mohammed，来自马里兰大学神经病学系 Chaman Tang 博士的实验室。今天我们将向您展示一种在光学显微镜下生成复杂消融模式的方法。我们实验室利用该方法研究树突整合功能。那么，让我们开始吧。本实验方案将演示用于实验神经科学的数字微镜器件（DMD）照明系统的工作原理。DMD 是一种光学半导体芯片，其表面排列有数十万个微小的可动反射镜，构成矩形阵列。每个微镜的位置对应于图像中的一个像素。每个微镜均可独立控制，以在两种取向之间倾斜。在“关”取向时，光线被导向偏离样本照明光轴的方向；在“开”取向时，光线沿光轴方向传播。DMD 非常适用于细胞裂解，因为它能够耐受极强的紫外光，像素的“开启”和“关闭”状态之间具有高对比度，并且可在数十微秒内实现两种状态之间的切换。DMD 在生物医学研究中的应用得益于图像处理软件和硬件的广泛应用，以及图像显示领域的商业支持。德州仪器公司（Texas Instruments）以 DLP 探索套件的形式销售模块化组件，提供配套的电子驱动装置，以便将 DMD 适配到显微系统中。需要理解显微镜光学的基本概念。现代荧光显微镜的基本结构包括成像光路和照明光路，主要由物镜、滤光立方体以及分别用于成像和照明光路的两个独立的管镜组成。显微镜设计有与标本像平面共轭的位置，位于标本平面处于焦平面的物体在这些共轭像平面上也会呈现清晰对焦。这一概念的推论是，在共轭像平面产生的任何明亮图像也会被清晰地投射到标本像平面上。该策略用于将计算机生成的照明图案投射到标本上。激光束作为非常明亮的光源，可照亮数字微镜芯片（DMD）上微镜在共轭像平面位置所形成的图案。DMD照明系统的设计取决于光遗传学实验所用的激发光，这类实验利用的是可见光波长范围内的光。照明图案可通过相机光路导入。因此，DMD 芯片可直接安装在双相机端口模块的两个相机端口之一。相反，对于使用紫外光范围（如解笼化合物裂解）的实验，必须通过落射照明路径引入光线，并需创建一个更易接近的共轭像平面。这是因为成像管镜未设计用于紫外光的透射。相反，照明管镜用于紫外光传输，在成像方面表现足够良好。DMD 上的每个微镜均可相对于芯片平面在正负 12 度之间切换倾斜角度。根据从计算机接收到的数字输入信号，每个微镜的旋转轴位于其对角顶点方向，与芯片矩形边呈 45 度角。微镜倾斜方向由芯片正面一角的金色三角形标记指定。微镜的倾斜度决定了入射照明光束的俯仰角和方位角的对准。首先将照明光束的俯仰角设置为偏离DMD芯片垂直轴24度，并将方位角设置为垂直于微镜旋转轴方向，以实现对DMD的照明。精确的光束准直对高效运行至关重要。用于裂解实验时，使用激光源产生高强度可聚焦光束，以实现快速解笼。此处采用一种准连续二极管泵浦固体三倍频Nd:YAG激光器，需使用相对高功率的激光，因为仅有小部分激光输出能实际传递到样品上。当使用DMD系统时，需将激光输出耦合入多模光纤，以便于调整其位置和方向，使其沿正确轴线照射DMD，从而解决由相干照明产生的散斑问题。光线通过光学光纤进行传输。将光纤缠绕在由 pazo 电动光纤拉伸器驱动的装置上，使其以约 40 千赫兹的频率振荡。在每次持续毫秒级的光刺激脉冲期间，光纤的微小拉伸足以使散斑图案发生多次移动，从而有效消除散斑效应。最后，使用紫外显微物镜对光纤输出端的光束进行准直，以照射数字微镜器件（DMD），并通过将 CCD 像素与 DMD 图像软件共定位，实现将各个 DMD 微镜与成像 CCD 相机的特定像素相对应的软件编写。软件中的图形用户界面允许用户使用计算机鼠标，在图形用户界面上将DMD微镜的方向指定给CCD图像上对应的区域。通过将光标移动到计算机屏幕上显示的图像上来标记光刺激的位置，并单击标记的兴趣区域，以编程设定光传递模式的存储。在计算机屏幕上以一系列独立图像标记的模式，可将每个空间图案对应的激光脉冲时序程序输入软件中。这将与数据采集程序P clamp集成。最后，使用数据采集程序协调DMD电子器件、激光门控以及来自目标神经元的膜片钳电信号的采集时间。此处展示了光学系统分辨率的校准。最小光斑尺寸是通过荧光靶标测量得到的。有效生理分辨率通过光电流幅度随光刺激的变化来测定。此处的光斑位置是在直径为两微米的树突分支附近进行光解谷氨酸的照射。当光斑移动时，垂直穿过微沟槽，展示了不同强度光刺激引发的电反应。图中显示了电压钳制条件下，反应幅度随光刺激强度变化的关系。使用基于DMD的系统可轻松实现分布式树突刺激。在此实验中，通过增加标记为圆形的光刺激点数量，来调节输入强度，这些刺激点位于两条树突分支上。空间整合作用在分支点之间可能呈现非线性特征。随着传入两个分支的输入幅度增加，其叠加效应变得越来越显著地超线性。这些结果清楚地说明了跨树突分支点的叠加具有非线性特征。这种超线性效应主要由NMDA受体介导，而非电压门控通道所致。这可以通过应用两种NMDA拮抗剂PV和MK-801来证明，它们在很大程度上消除了非线性行为。我们刚刚向您展示了基于DMD的神经组织模式光刺激系统的基本设计与操作。该系统可进行改造，以适用于可见光刺激，例如用于光遗传学实验。它也可适用于单光子裂解所用的近紫外光。进行此操作时，需注意：若使用波长小于400纳米的光源，且大多数情况下通过落射照明路径进行，照明光束的精确对准（误差需在几度以内）至关重要；此外，若使用相干光源，则必须有效消除散斑效应。以上即为全部要点。感谢观看，祝您的实验顺利。

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