双光子同步 在体 内 小鼠压后皮层突触输入与突触后靶标的成像

以下所述的所有实验程序均由中国科学院波兰科学研究院神经斯基实验生物学研究所当地伦理委员会批准。本视频展示了开颅手术操作，该操作可实现对转基因小鼠品系中后顶叶皮层神经元的慢性成像，采用活体双光子显微镜进行观察。该方法结合了在背侧海马体注射表达 mCherry 的腺相关病毒（AAV）。

综合这些技术，可实现对经验依赖性和后顶叶皮层结构可塑性的长期监测。本文提出，将颅窗植入后顶叶皮层上方，作为双光子活体显微成像的一个可行感兴趣区域。为了可视化神经元结构的形态学变化，我们使用 Thy1-GFP 转基因小鼠，其脑内约 10% 的神经元表达荧光 GFP 蛋白。

我们提出的另一项创新是注射一种腺相关病毒（AAV），该病毒在神经元特异性启动子驱动下表达荧光蛋白mCherry，靶向脑内较深的结构（如海马体），以可视化这些结构向压后皮层的投射路径。将所有工具、盛装液体的玻璃容器以及棉签均在高压灭菌器中进行灭菌。请佩戴一次性手套。

使用70%乙醇清洁手术台、立体定位仪及周围所有区域。使用无菌手术垫为所有已灭菌设备创建无菌操作空间。将明胶海绵切成小块，并浸泡于无菌生理盐水中。

将动物放入诱导室，设置异氟烷浓度为5%，氧气流速为每分钟2升。此过程应持续约3分钟。将动物从诱导室中取出。

通过尾部或脚趾夹捏来确认动物是否完全镇静。使用精密修毛剪，剪去耳朵之间至眼睛区域的头部背侧毛发。将动物置于立体定位仪中，并用耳杆固定头部。

将麻醉水平设定为 1.5% 至 2% 异氟烷和每分钟 0.3 升氧气。涂抹眼膏。皮下注射托夫定（4 毫克/千克）、丁米地尔（2 毫克/千克）和拜菌灵（5 毫克/千克），分别用于预防炎症、疼痛和感染。

以每公斤0.2毫克的剂量，对动物进行肌肉注射地塞米松，以预防脑肿胀。使用含聚维酮碘的无菌棉签清洁皮肤，随后用70%乙醇擦拭。更换手套，并用70%乙醇喷洒手套表面。

用镊子提起皮肤，使用显微剪刀沿头部基底水平剪开皮肤，然后斜向剪至两眼之间的前点。移除皮肤瓣。用无菌棉签将利多卡因软膏涂抹于骨膜上，以防止过度出血和疼痛。

使用无菌棉签或手术刀去除骨膜。用无菌棉签将颅骨擦干。使用无菌针头，将浓稠的氰基丙烯酸酯胶水涂抹于皮肤边缘，以固定皮肤并防止其与牙科水泥进一步接触。

等待胶水干燥。将一片无菌的3毫米盖玻片置于颅骨上，位于人字缝前方。盖玻片中心对准后顶叶坐标，即以前囟为基准，前后方向负2.8，左右方向0。

用无菌针头在颅骨表面划痕标记盖玻片边缘。将盖玻片放回含有70%乙醇的无菌容器中。使用高速牙科钻配小直径钻头，刻出直径为三毫米的圆形轮廓。

使用无菌生理盐水棉签清除钻孔部位的骨屑。使用明胶海绵和棉签控制偶尔出现的出血并清洁骨骼。在钻孔间隙，用精细镊子轻轻触碰骨环并检查其活动度，以评估骨厚度。

需要注意的是，骨缝区域的骨质较厚。当骨环已可活动，且周围仅剩一层均匀的薄层骨质时，停止钻孔。使用生理盐水浸湿的棉签彻底清除手术区域残留的所有骨屑。

将无菌生理盐水滴加至钻孔区域，覆盖钻取的骨环。用精细镊子小心撬起骨环，然后轻轻但稳固地向上提起，将骨片取出。提起骨环时需注意避免倾斜，以防对硬脑膜造成可能的损伤。

用无菌生理盐水浸湿的明胶海绵轻轻敷于硬脑膜上，以帮助止血。等待直至所有出血完全停止。小心移除明胶海绵，避免干扰凝血过程。

注意，缝合区域血管丰富，因此此处出血可能较为严重。必须等待足够时间，直至出血完全停止。将输液泵连接至立体定位仪支架，并连接控制器。

将35号针头插入填充注射器中。用乙醇冲洗注射器10次以灭菌，并用无菌生理盐水冲洗10次以去除乙醇残留。排除注射器中的气泡。

将注射器插入泵中。取单剂量AV制剂并置于冰上保存。用病毒溶液填充注射器。

将针尖定位在前囟中心，然后根据以下坐标轻柔插入海马：前后方向减二，内外方向正负一，背腹方向减一。这些坐标位于颅腔区域边缘附近。等待五分钟，使组织稳定。

以每分钟 50 纳升的速度注射 0.7 微升的 AV 溶液。等待 10 分钟，使病毒充分吸收。轻轻拔出针头。

若发生出血，用凝胶海绵按压止血。对侧重复相同操作。将无菌干燥盖玻片置于钻孔环形区域硬脑膜上方。

用镊子夹住盖玻片，轻轻压平硬脑膜，并使盖玻片边缘贴近颅骨表面。使用无菌针头，将浓稠的氰基丙烯酸酯胶水涂抹在盖玻片边缘，以将其固定于颅骨上。等待胶水完全干燥。

在颅骨前部放置一个固定杆、安东螺母或定制设计的装置。注意，固定杆的位置应确保在成像过程中颅窗能够水平放置。将胶水涂抹在固定杆的边缘处。

等待胶水干燥。注意，固定杆应尽可能远离窗口放置。如果固定杆距离窗口过近，则固定杆及其与自制支架相连的螺钉可能在成像过程中阻碍物镜。

制备牙科丙烯酸树脂，并将其涂抹于玻璃窗周围颅骨表面。在窗口周围形成类似火山口的形状有助于后续成像时在水浸物镜下加水形成水腔。

使用牙科丙烯酸材料制作一个帽状结构，覆盖手术区域其余部分的皮肤边缘，并固定加强颅窗周围的 crater 结构。等待牙科水泥完全硬化。将动物从立体定位架上取下，并放入恢复舱中。

在观察动物生理功能的同时，等待其从手术中恢复。术后给予镇痛剂cyroproferrin（10毫克/千克）和抗生素baytril（5毫克/千克），持续48小时。启动钛蓝宝石激光器，开启显微镜电源。

本实验所用系统配备双光子激光器、OPO 系统和双镓砷化物假制 PMT。将动物放入诱导室并诱导麻醉。从诱导室中取出动物，置于显微镜下的气体麻醉面罩中。

将氧气流速降低至0.3升/分钟，异氟烷浓度降至1.52%。使用MT螺丝或其他定制系统将动物固定在定制的显微镜框架上。调平颅窗。注意：虽然可以使用显微镜制造商提供的头部固定系统，但特定的定制框架可获得更佳效果，在慢性实验的多次操作中提供更优的头部稳定性与位置一致性。

使用宽场显微镜设置和低倍物镜，将视野中心对准压后皮层的一侧边缘，并聚焦于盖玻片表面。在类似火山口状的丙烯酸腔体中加入一滴水。切换至长距离水浸物镜。

将物镜移向颅窗，直至水的弯月面连接样本与物镜。切换至双光子设置，从上到下以最低放大倍数开始扫描样本。硬脑膜的穿越位置会表现为强烈的非特异性信号闪光。

根据荧光细胞的信号强度，调整显微镜在 GFP 和 mCherry 两个通道中的采集参数，以覆盖整个动态范围。找到一个树突树与其他细胞分离的合适神经元后，仅使用 GFP 滤光片进行初始扫描，设置最低放大倍数和五微米的 Z 距离。获取扫描图像栈的最大投影，并使用反色打印以供标注。

调整放大倍数，使其能够成像所需的形态学细节。使用最大投影法作为向导，对GFP和mCherry通道中的整个树突树进行成像。采用本方案，可对后扣带皮层中的突触前和突触后结构进行重复监测。

该方法可用于慢性实验，以观察树突、突触棘或突前神经元形态变化与行为学操作之间的相关性。成像实验可按任意频率进行，但建议采用24小时的时间间隔，以确保动物得到充分恢复，并尽量减少麻醉带来的影响。若操作得当，该技术可在数月内实现多次成像。