同时双光子在体内突触输入的影像和突触后目标中的鼠标Retrosplenial的Cortex
March 13th, 2016
该视频展示了开颅手术，该程序允许在 Thy1-GFP 转基因系中使用体内双光子显微镜对小鼠脾后皮层中的神经元进行慢性成像。这种方法与将表达 mCherry 的腺相关病毒注射到背侧海马体相结合。这些技术允许长期监测 RSC 中经验依赖的结构可塑性。
以下描述的所有实验程序均已获得波兰科学院 Nenscki 体验生物学研究所当地伦理委员会的批准。该视频展示了开颅手术，该程序允许在 1-G 的足转基因系中使用体内双光子显微镜对小鼠脾后皮层中的神经元进行慢性成像。这种方法与在背侧海马体注射表达 mCherry 的腺相关病毒 AAV 相结合。
这些技术结合在一起，可以长期监测脾后皮层的经验依赖性、结构可塑性。在本文中，我们建议将颅窗植入脾后皮层上方，作为双光子体内显微镜的可能感兴趣区域。为了可视化神经元结构的形态变化，我们使用 B 小鼠的 1-G，在大脑中大约 10% 的神经元中表达荧光 GFP 蛋白。
我们提出的另一项创新是注射 AAV，在神经元特异性启动子下将荧光蛋白 mCherry 表达到大脑的更深结构（如海马体）中，以便可视化结构投射到脾后皮层。对高压灭菌器中的所有工具、液体玻璃容器和棉签进行消毒。你们这些可有可无的手套。
用 70% 乙醇清洁手术台、立体定向框架和所有周围区域。使用无菌手术垫为所有消毒设备创造一个无菌空间。将凝胶泡沫切成小块，然后浸泡在无菌盐水中。
将动物放入诱导室中，将异氟醚水平设置为 5%，氧气流量设置为每分钟 2 升。此过程大约需要 3 分钟。将动物从诱导室中取出。
使用尾巴或脚趾捏，以确保动物完全镇静。使用精确的修剪器，从后脑勺、耳朵之间到眼睛剃掉头发。将动物放在立体定向框架中，并用耳杆稳定头部。
将麻醉水平设置为 1.5% 至 2% 异氟醚，零点每分钟 3 升氧气。涂抹眼膏。皮下注射动物每公斤 4 毫克的托菲定、每公斤 2 毫克的布托米多和每公斤 5 毫克的拜曲尔，以分别预防炎症、疼痛和感染。
用地塞米松肌肉注射动物，零点每公斤 2 毫克，以防止脑肿胀。使用无菌棉签蘸有 betadine 和 70% 乙醇清洁皮肤。更换手套并喷洒 70% 乙醇。
用镊子提起皮肤，并使用微型剪刀沿头部底部水平切开皮肤，然后斜向到眼睛之间的前点。取下皮瓣。用无菌棉签将利多卡因软膏涂抹在骨膜上，以防止过度出血和疼痛。
使用无菌棉签或手术刀去除骨膜。用无菌拭子擦干颅骨。使用无菌针头，在皮肤边缘涂抹致密的氰基丙烯酸酯胶水以固定它们并防止进一步接触牙科水泥。
等待胶水干燥。在 lambdoid 缝合线前方的颅骨上铺设一个无菌的 3 毫米盖玻片。将盖玻片置于脾后坐标、前、后前囟减 2 点 8、内侧外囟零处。
用无菌针头刮擦颅骨表面，标记盖玻片边缘。将盖玻片放回含有 70% 乙醇的无菌容器中。使用带有小直径车针的高速牙钻勾勒出一个直径为 3 毫米的圆。
用无菌盐水棉签清洁钻孔部位的骨尘。使用凝胶泡沫和棉签止住偶尔的出血并清洁骨骼。在钻孔之间，用细镊子轻轻触摸骨圈并检查其活动度，检查骨厚度。
请记住，缝合区域的骨头较厚。当骨圈可以移动时停止钻孔，圆周上只留下一层均匀的薄骨。用盐水棉签清洁手术区域的所有剩余骨尘。
将无菌盐水滴在钻孔区域，覆盖钻孔的圆圈。用细镊子小心地撬开骨圈，然后轻轻但牢固地向上提起骨头。抬起骨圈时要小心不要歪斜，以防止对硬脑膜造成可能的损伤。
将浸泡在无菌盐水中的凝胶泡沫轻轻涂抹在硬脑膜上，以帮助补血。等到所有出血完全停止。小心去除凝胶泡沫，以免干扰凝固过程。
请注意，缝合区域血管丰富，因此此时的出血可能很严重。必须等待足够的时间让出血停止。将输液泵连接到立体定向塔并连接控制器。
将 35 号针头插入充填注射器。用乙醇冲洗注射器 10 次以对其进行消毒，并用无菌生理盐水冲洗 10 次以去除微量乙醇。去除注射器中的气泡。
将注射器插入泵中。填充单剂量的 AV 制剂并将其保存在冰上。用病毒溶液填充注射器。
将针头置于前囟的中心，然后使用以下坐标轻轻插入海马体：前、后负二、内侧外侧加负一、背侧腹侧负一。这些坐标将位于颅域边缘附近。等待 5 分钟，让组织稳定下来。
以每分钟 50 纳升的速度注入零点 7 微升 AV 溶液。等待 10 分钟，让病毒完全吸收。轻轻取出针头。
如果发生出血，请用凝胶泡沫吸干。对侧重复。将无菌干燥盖玻片放在钻孔圆形框架中的硬脑膜顶部。
用前额握住盖玻片，轻轻压平硬脑膜，并使盖玻片边缘更靠近颅骨表面。使用无菌针头，将致密的氰基丙烯酸酯胶涂在盖玻片边缘，使其连接到颅骨上。等待胶水干燥。
在颅骨前部放置固定杆、安东螺母或定制设计。请注意，固定杆应放置在成像过程中能够水平定位颅窗的位置。将胶水涂抹在棒材的边缘。
等待胶水干燥。请注意，固定杆应放置在尽可能远离窗户的位置。如果它放置在离窗口太近的地方，则杆和将其与定制支架连接的螺钉可能会在成像过程中对物镜构成障碍。
准备牙科丙烯酸树脂并将其涂抹在玻璃周围的颅骨表面。在窗户周围形成一个火山口状的形状是有帮助的。它将为稍后应用的水创建一个空腔，以便使用水物镜进行成像。
用牙科丙烯酸树脂制作一个帽子，覆盖手术区域的其余部分皮肤边缘固定杆，以加强颅窗周围的火山口。等待牙科粘接剂硬化。将动物从立体定向框架中取出，然后将其放入恢复室中。
等待动物从手术中恢复，同时观察生理功能。术后麻醉使用环丙铁蛋白（每公斤 10 毫克）和抗生素治疗拜曲尔（每公斤 5 毫克），持续 48 小时。启动 ti 蓝宝石激光器，启动显微镜。
本实验中使用的系统配备了双光子激光器、OPO 系统和双砷化镓伪造 PMT。将动物放入诱导室并诱导麻醉。将动物从诱导室中取出，放在显微镜下的气体麻醉面罩中。
将氧气流量降低至零点每分钟 3 升，将异氟醚浓度降至 1.52%使用 MT 螺钉或其他定制系统将动物固定在定制的显微镜框架上。调平颅窗。请注意，可以使用显微镜制造商的头部固定系统，尽管特定的定制框架会提供更好的结果、提高头部稳定性、在慢性实验期间多次固定定位。
使用宽视场显微镜设置（低放大倍率物镜），将视图置于脾后皮层的一侧居中，并将其聚焦在盖玻片表面上。将一滴水滴入火山口状的丙烯酸井中。切换到远距离水浸物镜。
将物镜移向颅窗，直到水弯月面连接标本和物镜。切换到双光子设置，并使用最低缩放率从上到下开始扫描样品。硬脑膜物质的交叉将作为高非特异性信号的眩光可见。
根据荧光细胞的信号强度调整 GFP 和 mCherry 两个通道中的显微镜采集设置，以覆盖整个动态范围。在找到合适的神经元后，树突状树与其他细胞分离，仅使用设置最低缩放和 Z 距离为 5 微米的 GFP 过滤器进行初始扫描。获取扫描堆栈的最大投影，并使用反转颜色打印它以进行注释。
将 zoom 设置为允许对所需形态细节进行成像的值。使用最大投影作为指导，在 GFP 和 mCherry 通道中对整个树突树进行成像。使用此协议，将有可能重复监测脾后皮层中的突触前和突触后结构。
这种方法可以用于一项慢性实验，其中当树突、突触棘或突触前中子的形态发生变化时，行为作预期会相关。成像疗程可以以任何频率进行，但最好间隔 24 小时，以便让动物适当恢复并最大限度地减少麻醉的影响。如果应用得当，该技术允许在几个月内进行多次成像。
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概述
该视频展示了使用体内双光子显微镜进行小鼠后扣带皮层神经元慢性成像的开颅手术程序。该方法涉及将表达mCherry的腺相关病毒注射到背侧海马，从而实现对结构可塑性的长期监测。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 成像技术
- 结构可塑性
背景
- 慢性成像技术对于研究神经元随时间的变化至关重要。
- 后扣带皮层是理解空间导航和记忆的关键区域。
- 双光子显微镜允许对神经元结构进行高分辨率成像。
- 腺相关病毒常用于神经科学研究中的基因递送。
研究目的
- 可视化神经元结构随时间的形态变化。
- 探索后扣带皮层在体验依赖性可塑性中的作用。
- 建立一种可靠的活体动物慢性成像方法。
使用的方法
- 开颅手术以便接触后扣带皮层。
- 体内双光子显微镜用于成像神经元活动。
- 将表达mCherry的腺相关病毒注射到背侧海马。
- 使用Thy1-GFP转基因小鼠来可视化特定神经元。
主要结果
- 成功植入用于成像的颅窗。
- 长期监测后扣带皮层的结构变化。
- 展示了神经元结构中的体验依赖性可塑性。
- 验证了该方法在未来活体动物模型研究中的应用。
结论
- 开颅手术和成像技术为神经元可塑性提供了宝贵的见解。
- 这种方法可以应用于涉及后扣带皮层的各种研究。
- 未来的研究可以在这些方法的基础上探索其他脑区域。
常见问题
Executive Industry Relevance
Simultaneous two-photon in vivo imaging of synaptic inputs and postsynaptic targets in the mouse retrosplenial cortex enables direct, longitudinal assessment of structural plasticity in a brain region critical for spatial memory. This capability supports mechanistic de-risking and predictive confidence in early CNS target validation, especially for pathways involving hippocampal-cortical connectivity. The method's chronic imaging design positions it as a reusable platform for experience-dependent plasticity studies across discovery and preclinical research.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct visualization of synaptic and dendritic structural changes in response to behavioral or pharmacological manipulations.
- Supports functional target validation by correlating morphological plasticity with specific interventions.
- Facilitates mechanistic de-risking for CNS targets by providing high-resolution, longitudinal data in a disease-relevant brain region.
Screening & Assay Development
- Establishes a validated in vivo imaging system for quantifying synaptic and dendritic changes over time.
- Provides reproducible, quantitative outputs suitable for screening compounds that modulate structural plasticity.
- Enables assay standardization and platform reuse for multiple CNS research programs.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with translational biomarker strategies by enabling monitoring of experience-dependent plasticity in a region implicated in memory and cognition.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation by allowing repeated, non-terminal measurements in the same animal.
- Reduces biological risk by providing predictive, longitudinal data on synaptic remodeling relevant to disease models.
Pipeline & Workflow Integration
This imaging platform integrates into the CNS discovery continuum from early mechanistic studies through preclinical validation, supporting both hypothesis testing and translational continuity.
- Discovery Biology: Enables hypothesis-driven interrogation of synaptic and dendritic remodeling in response to defined manipulations.
- Screening: Provides quantitative, reproducible imaging outputs for compound or genetic screening in vivo.
- Analytics: Delivers high-content morphological measurements for statistical comparison across experimental conditions.
- Translational Research: Bridges discovery and preclinical phases by supporting longitudinal studies in a memory-relevant brain region.
- Enterprise Reuse: Offers a standardized, chronic imaging workflow adaptable to diverse CNS research programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in CNS target validation.
- Operational Value: Standardizes chronic imaging procedures for reproducibility and scalability across studies.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making by providing longitudinal, quantitative data on synaptic plasticity.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of CNS targets and interventions based on in vivo structural outcomes.
Implementation Considerations
- Requires expertise in stereotactic surgery, in vivo imaging, and viral vector delivery.
- Demands access to two-photon microscopy and advanced image analysis infrastructure.
- Necessitates rigorous cross-team standardization of surgical and imaging protocols.
- Adaptation to other brain regions or disease models may require protocol optimization.
- High vascularization of the retrosplenial cortex presents practical challenges for window implantation and imaging stability.
