Encyclopedia of Experiments: Biology
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-जब इंजेक्शन भ्रूण G0 वयस्कों में विकसित, उपयुक्त F1 CRISPR संपादित लाइनों का विस्तार करने के लिए उपयुक्त बैलेंसर शेयरों के लिए सभी व्यक्तिगत मक्खियों को पार और जीनोमिक संशोधन की विरासत को ट्रैक करने में सक्षम हो । फिर, पार बेतरतीब ढंग से चुना F1 एकल पुरुषों के लिए उपयुक्त बैलेंसर महिलाओं को संतानों को ठीक करने में सक्षम होने के लिए अगर एक F1 पुरुष उत्परिवर्तन के लिए सकारात्मक है । एक बार क्रॉस ले लिया है, स्क्रीनिंग के लिए एक ट्यूब के लिए F1 पुरुष हस्तांतरण ।
जीनोमिक डीएनए निकालने के लिए, फ्लाई को एक पिपेट टिप के साथ स्क्वैश करें जिसमें निष्कर्षण बफर होता है। एक बार ऊतक टूट जाने के बाद, तरल को बाहर निकाल दें। निष्कर्षण बफर में प्रोटीन के होता है, एक एंजाइम जो नमूने में प्रोटीन को पचाता है और उच्च गर्मी से निष्क्रिय हो जाता है।
अब जब डीएनए सुलभ है, तो पीसीआर स्क्रीनिंग के लिए आगे बढ़ें । उदाहरण के लिए, एक क्षेत्र है कि नए अनुक्रम भी शामिल है बढ़ाना डिजाइन प्राइमर का उपयोग करें । केवल संशोधन की उपस्थिति में दूसरा प्राइमर बांध और एक पीसीआर उत्पाद परिलक्षित किया जाएगा । उदाहरण में, हम देखेंगे कि मक्खियों को एक लेनदेन अनुक्रम के सम्मिलन के लिए पीसीआर द्वारा पैदा किया जा रहा है और जांच की जा रही है शाखाहीन जीन के पहले exon की जगह ।
- जब नग-Cas9 भ्रूण पहले दोनों गाइड आरएनए अभिव्यक्ति प्लाज्मिड और प्रतिस्थापन दाता वयस्कों में विकसित के साथ इंजेक्शन, क्रॉस जी 0 लक्षित एलील के लिए उपयुक्त लाइन से बैलेंसर मक्खियों के लिए व्यक्तिगत रूप से उड़ता है। कार्बन डाइऑक्साइड पैड पर प्रत्येक जी0 क्रॉस से एफ 1 संतान को एनेस्थेटाइज करें और बेतरतीब ढंग से स्टीरियो माइक्रोस्कोप के तहत 10 से 20 पुरुषों को चुनें। व्यक्तिगत रूप से प्रत्येक चयनित पुरुष को लक्षित एलील के लिए उपयुक्त लाइन से एक बैलेंसर मादा को पार करें।
जब F2 लार्वा हैच, प्रत्येक क्रॉस से F1 पिता उठाओ । प्रत्येक फ्लाई को 10 से 15 सेकंड के लिए एक पिपेट टिप के साथ एक पिपेट टिप के साथ स्प्लिट टिप के साथ निकालें जिसमें बफर को वितरित किए बिना बफर के 50 माइक्रोलीटर होते हैं। फिर, शेष बफर को ट्यूब में वितरित करें और अच्छी तरह से मिलाएं।
20 से 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। इनक्यूबेशन के बाद ट्यूबों को 1 से 2 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस हीट ब्लॉक में रखें। 10,000 बार जी पर 5 मिनट तक नीचे घूमते रहने के बाद तैयारी को आगे पीसीआर विश्लेषण के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
एंट्री या रिप्लेसमेंट के अस्तित्व के लिए स्क्रीन करने के लिए प्राइमर फॉरवर्ड 1 और रिवर्स 1 का उपयोग करके तीन-स्टेप पीसीआर आधारित स्क्रीन करें। तीन प्राइम क्षेत्र से प्रविष्टि या प्रतिस्थापन को सत्यापित करने के लिए फॉरवर्ड 2 और रिवर्स 2 प्राइमर का उपयोग करके पीसीआर करें। HDR में समाप्त होने की जांच करने के लिए प्राइमर M13F और रिवर्स 3 का उपयोग करके पीसीआर करें।
- कन्फर्म एंड्स-आउट एचडीआर के साथ फ्लाई लाइन्स रखें और F2 जेनरेशन से बैलेंस स्टॉक्स स्थापित करें। बाहर क्रॉस बैलेंसर अन्य गुणसूत्रों पर किसी भी अनपेक्षित म्यूटेशन को हटाने के लिए फिर से उड़ता है।
