Encyclopedia of Experiments: Biology
需要订阅 JoVE 才能查看此 内容. 登录或开始免费试用。
Transcript
Please note that all translations are automatically generated.
- Когда инъекционные эмбрионы развиваются в G0 взрослых, крест всех отдельных мух подходящих запасов балансера для расширения потенциальных F1 CRISPR отредактированные линии и быть в состоянии отслеживать наследование геномной модификации. Затем, крест случайно выбрали F1 одиноких мужчин подходящих женщин балансера, чтобы иметь возможность восстановить потомство, если F1 самец положительный для мутации.
Чтобы извлечь геномную ДНК, хлюпать муху кончиком пипетки, содержащим буфер экстракции. После того, как ткань разбита, выброс жидкости.
Теперь, когда ДНК доступна, переходите к скринингу ПЦР. Например, используйте праймеры, предназначенные для усиления региона, который включает в себя новую последовательность. Только при наличии модификации будет усиливаться вторая грунтовка и продукт ПЦР. В примере мы увидим, что мухи разводятся и проверяются ПЦР для вставки трансактивации последовательности, заменяющего первый экзон без разветвленного гена.
- Когда nos-Cas9 эмбрионов ранее вводили как руководство РНК выражение плазмидной и замены донора развиваться во взрослых, крест G0 летит индивидуально балансер мух от линии, подходящей для целевых аллель. Anesthetize F1 потомство от каждого креста G0 на панели двуокиси углерода и случайно выбрать от 10 до 20 мужчин под стерео микроскопом. Индивидуально пересечь каждый выбранный мужчина к балансеру женщины от
Когда личинки F2 люк, выбрать F1 отца из каждого креста. Экстракт геномной ДНК, хлюпать каждую муху в течение 10 до 15 секунд с наконечником пипетки, содержащей 50 микролитров хлюпающий буфер без дозирования буфера. Затем, обойти оставшийся буфер в трубку и хорошо перемешать.
Инкубировать при температуре 37 градусов по Цельсию в течение 20 до 30 минут. После инкубации, поместите трубки в 95 градусов по Цельсию тепловой блок в течение 1 до 2 минут, чтобы инактивировать протеиназы K. После спиннинг вниз в течение 5 минут при 10000 раз г, хранить препарат при температуре 4 градусов по Цельсию для дальнейшего анализа ПЦР.
Выполните трехшаговой ПЦР на основе экранов с помощью грунтовки вперед 1 и обратного 1 на экран для того, чтобы наличие вставки или замены. Выполните ПЦР с помощью вперед 2 и обратного 2 грунтовки для проверки вставки или замены из трех премьер-региона. Выполните ПЦР с помощью грунтовки M13F и обратного 3 для проверки конца в HDR.
- Держите линии мухи с подтвержденным концами из HDR и установить баланс запасов от поколения F2. Из пересечь балансер летит снова, чтобы удалить любые непреднамеренные мутации на других хромосомах.
