Name: 斑马斑马模型系统中 CRISPR/Cas9-generated 基因挖空的高效生产与鉴定 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-28T12:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 27 s
Description: 学习在斑马鱼中使用CRISPR/Cas9技术进行靶向基因组编辑以产生基因敲除的方法。该方案结合异源双链迁移率分析和下一代测序技术，适用于各级别研究人员快速鉴定突变等位基因。

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本研究由美国国立卫生研究院（R21CA182197，授予 J.O.）、Ralph W. 和 Grace M. Showalter 研究信托基金以及普渡大学农业科学与经济发展推广（AgSEED）项目资助。Sanger 测序数据由普渡大学基因组学核心设施获得，该设施受 P30 CA023168 项目支持。Mary Witucki 受普渡大学癌症研究中心暑期本科生研究项目资助，该项目由卡罗尔县癌症协会支持。资助方未参与研究设计、数据收集与分析、发表决定或稿件撰写。我们感谢 Benjamin Carter、Ellen Denning 和 Taylor Sabato 对稿件提出的宝贵意见。我们感谢生物化学系对本研究的支持，以及普渡大学斑马鱼研究中心在斑马鱼种群护理与福利方面所做出的贡献。最后，我们感谢普渡大学基因组学核心设施，以及 Phillip San Miguel 在下一代测序（NGS）服务方面的支持与贡献。

本视频文章的出版由 New England Biolabs 赞助。

本方案描述了利用CRISPR-Cas9技术在斑马鱼这一脊椎动物模型系统中产生基因敲除的方法。此前已有多种方案被用于在斑马鱼中开展CRISPR介导的基因组编辑15,25,26,50,51,52。本方案在以往研究基础上，整合了多种简单且可重复性高的实验技术，特别是对多条杂合子鱼进行HMA和NGS分析，从而建立了一种简便、经济且实验可靠性高的斑马鱼CRISPR介导诱变方案，适用于研究人员培训背景和经验水平各异的实验室，也适用于教学实验室。
本方案中包含了指导RNA设计与合成的相关建议。在指导RNA设计中，一个主要考虑因素是最小化脱靶效应。目前已开发出多种预测算法，使CRISPR使用者能够通过用户友好的图形化计算工具，预测靶向指导RNA的活性以及发生脱靶效应的可能性34,35,36。斑马鱼系统的一个显著优势是脱靶效应的发生率较低，这是因为Cas9被直接注射到胚胎中，其表达具有瞬时性，而在小鼠中的研究已表明这种瞬时表达可降低脱靶效应53。尽管如此，斑马鱼中也已证实存在脱靶效应54。控制脱靶效应的一种方法是利用两个独立的靶向同一基因的指导RNA分别产生的F0代斑马鱼进行表型分析，因为这两个指导RNA极可能影响不同的脱靶位点。另一种未在本方案中描述的减少脱靶效应的方法是使用一种突变型Cas9，该酶可在靶DNA上产生单链断裂，而这类断裂可被高效修复。当两个互补于相反DNA链的切口在空间上彼此靠近时，可有效在目标位点形成插入或缺失突变（indel），同时显著降低脱靶效应55,56。
除了脱靶效应的发生率不同外，不同的sgRNA对目标位点的诱变效率也可能存在差异57,58,59。本实验方案采用异源双链分析法（HMA），通过检测异源双链带的形成来评估特定sgRNA的诱变效率33,40。异源双链带由含有错配的PCR扩增DNA链杂交形成，可通过凝胶电泳轻松分辨。与其他常用于检测插入缺失（indel）形成的方法（如T7核酸内切酶检测法或高分辨率熔解曲线分析25,26）相比，HMA无需使用昂贵的酶来切割错配DNA，也不需要对PCR熔解曲线进行复杂的分析。重要的是，通过HMA验证注射群体中高水平的indel形成，可使研究人员尽量减少后续构建基因敲除品系所需的斑马鱼数量，从而降低筛选具有理想特性的突变体的成本。
利用CRISPR技术产生插入缺失突变（indel）的相对简便性，使得能够同时创建多个基因的多种等位基因。目前已有多款基于网页的软件可用于通过PCR产物的Sanger测序分析杂合子鱼类中的单个突变49。当需要分析三个或更多CRISPR诱导的突变等位基因时，采用下一代测序技术（NGS）来鉴定插入缺失突变的性质可能更具成本效益，因为该方法可一次性表征多达50种不同等位基因的序列（参见材料表）60,61,62。这种规模化的检测优势在本科生实验教学环境中可能尤为适用。
综上所述，本实验方案提供了可重复地制备高质量CRISPR试剂（特别是sgRNA）的逐步操作指南，从而减少为成功鉴定目标突变等位基因所需培育和分析的成年斑马鱼数量，同时降低了构建目标品系所需的时间和成本。重要的是，本方案的设计使得资源有限的实验室也能够以经济可行的方式制备突变型斑马鱼。此外，我们发现该方法适用于本科生教学，因此为希望获得CRISPR基因组编辑实践操作经验的本科生提供了更多教育与培训机会。

真核生物之间分子机制的保守性奠定了利用模式生物进行研究的强大基础。许多此类模式系统便于采用反向遗传学方法，例如靶向基因敲除，以鉴定某个基因产物在特定生物学过程或疾病过程中的作用。历史上，斑马鱼等生物体的基因破坏技术主要依赖于靶向引入移码突变，这些突变源于双链断裂（DSB）的不精确修复1,2。当基因组中引入DSB时，DNA损伤可通过两种普遍存在于几乎所有细胞类型和生物体中的修复途径之一进行修复：非同源末端连接（NHEJ）和同源定向修复（HDR）3,4。NHEJ机制的不精确性常常导致产生不同长度的插入或缺失（indels）5,6,7,8,9。在基因编码序列中引入移码突变可导致提前出现终止密码子，通常使该基因丧失功能。
早期在斑马鱼中用于诱导插入缺失（indels）的基因组编辑策略包括巨核酸酶、锌指核酸酶以及转录激活样效应子核酸酶，这些技术均利用DNA-蛋白质相互作用将核酸酶靶向特定基因组位点，从而引入双链断裂（DSB）10,11,12,13,14,15。然而，由于需要繁琐且复杂的工程化过程来构建靶向特定DNA序列的核酸酶，这些技术通常难以应用。与先前的策略不同，基于CRISPR的基因编辑不依赖于蛋白质-DNA相互作用进行靶向。相反，CRISPR相关（Cas）内切酶通过一条RNA引导链进行导向，该引导RNA利用核苷酸碱基配对作用靶向特定的基因组位点16,17,18,19,20,21。由于设计具有理想碱基配对特性的RNA引导链非常简便，因此可相对容易地将Cas内切酶靶向至目标基因座。其中，II型CRISPR系统因其多项优势特征而在基因组编辑应用中得到了广泛开发，包括使用单一的多结构域Cas核酸酶（Cas9），该酶需与DNA结合以激活其内切酶活性，以及使用单一引导RNA（sgRNA）将其靶向至对应的DNA序列18。目前对sgRNA靶向所需的序列条件已有充分了解19，且目标sgRNA可通过体外转录（in vitro transcription）轻松制备。CRISPR/Cas9方法的简便性与高效性极大地促进了斑马鱼及多种其他生物中的靶向遗传修饰。
由于开发了基于CRISPR的试剂，斑马鱼靶向基因组编辑能力显著增强，这大大增加了研究脊椎动物典型生物学过程（如中枢神经系统发育）的机会。斑马鱼基因组包含人类基因组中70%的蛋白编码基因的同源基因，以及84%与人类疾病相关的基因22。斑马鱼的发育具有多个关键特性，使其在反向遗传学研究中更具优势：其胚胎以大量产卵方式产出，体外发育，便于通过显微注射进行遗传操作；且斑马鱼在3个月龄时即可达到性成熟，有利于快速扩增目标品系23。
已有多种实验方案描述了在斑马鱼中生成和鉴定CRISPR来源的插入缺失（indel）的不同方法24,25,26,27,28,29,30,31。然而，其中许多方法耗时较长，需要使用昂贵的设备，对于经验有限的实验室而言操作难度较大。本文所述步骤提供了一种简单、可靠且经济的CRISPR/Cas9策略，用于构建斑马鱼基因敲除品系。本方案描述了利用高效试剂盒通过DNA寡核苷酸（oligos）合成单导向RNA（sgRNA）的方法，类似于此前已报道的其他方法32。该方案特别包含两个显著简化CRISPR突变品系分析的步骤：基于PCR的杂合双链分析法（HMA）33的逐步操作，以简便地检测基因组修饰的存在；以及对杂合子斑马鱼进行测序分析，从而以经济、快速且简便的方式确定多种indel的具体性质。此外，本方案还提供了关于向导RNA的可靠筛选、稳定制备和显微注射的详细分步说明。本文所提供的操作流程展示了一种稳健且相对低成本的实验方案，使具备不同技术水平的实验室人员均能有效参与斑马鱼基因敲除的鉴定工作。

<table><tbody><tr><td>CRISPOR</td><td></td><td></td><td>sgRNA 分析软件。http://crispor.tefor.net/</td></tr><tr><td>Breaking-Cas</td><td></td><td></td><td>sgRNA 分析软件。https://omictools.com/breaking-cas-tool</td></tr><tr><td>ChopChop</td><td></td><td></td><td>sgRNA 分析软件。https://chopchop.rc.fas.harvard.edu/</td></tr><tr><td>Primer 3</td><td></td><td></td><td>PCR 引物设计。http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/</td></tr><tr><td>Rnase free 技术</td><td></td><td></td><td>http://genomics.no/oslo/uploads/PDFs/workingwithrna.pdf</td></tr><tr><td>RNase-free 水</td><td>任意品牌</td><td></td><td>用于合成向导 RNA。Thermo Fisher 和 Qiagen 均提供合适的产品。</td></tr><tr><td>Rnase-free 乙醇</td><td>任意品牌</td><td></td><td>分子生物学级乙醇为 RNase-free。Fischer 和 VWR 均出售合适乙醇。</td></tr><tr><td>Cas9 蛋白</td><td>PNA Bio</td><td>CP01</td><td>带有核定位信号的 Cas9 蛋白。</td></tr><tr><td>靶向特异性寡核苷酸</td><td>Integrated DNA Technologies (IDT)</td><td></td><td>用于合成向导 RNA。</td></tr><tr><td>扩增向导 RNA 切割位点侧翼区域的 PCR 引物</td><td>Integrated DNA Technologies (IDT)</td><td></td><td>用于异源双链分析，扩增产物长度为 100–300 bp。</td></tr><tr><td>扩增向导 RNA 切割位点侧翼区域的 PCR 引物</td><td>Integrated DNA Technologies (IDT)</td><td></td><td>用于测序 CRISPR 等位基因，推荐扩增产物长度为 300–600 bp。</td></tr><tr><td>EnGen sgRNA 合成试剂盒</td><td>New England BioLabs</td><td>E3322</td><td>体外转录合成向导 RNA。</td></tr><tr><td>10X TBE</td><td>Thermo Fisher</td><td>B52</td><td>用于核酸电泳的 RNase-free 缓冲液。</td></tr><tr><td>6X 上样染料</td><td>New England BioLabs</td><td>B7025S</td><td>用于 DNA 电泳上样。</td></tr><tr><td>5M 醋酸铵</td><td>Thermo Fisher</td><td>AM9071</td><td>用于向导 RNA 纯化的清洗试剂。</td></tr><tr><td>乙醇（200 证明，无核酸酶）</td><td>任意品牌</td><td></td><td>用于向导 RNA 纯化的清洗试剂。分子级试剂为 RNase-free。</td></tr><tr><td>无核酸酶水</td><td>任意品牌</td><td></td><td>用于向导 RNA 的合成与纯化。</td></tr><tr><td>RNase away</td><td>Thermo Fisher</td><td>10328011</td><td>用于清除表面、设备和玻璃器皿上的 RNase 污染。</td></tr><tr><td>DNA Ladder，100 bp</td><td>New England BioLabs</td><td>N0467S</td><td>用于 DNA 凝胶电泳的分子量标准。</td></tr><tr><td>DNA Ladder，1 kb</td><td>New England BioLabs</td><td>N0552S</td><td>用于 DNA 凝胶电泳的分子量标准。</td></tr><tr><td>RNA Ladder</td><td>New England BioLabs</td><td>N0364S</td><td>单链 RNA 标记物，用于验证全长 sgRNA 是否成功合成。</td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Thermo Fisher</td><td>17919</td><td>用于制备聚丙烯酰胺凝胶。</td></tr><tr><td>过硫酸铵（APS）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3678</td><td>用于制备聚丙烯酰胺凝胶。</td></tr><tr><td>40% 聚丙烯酰胺（19:1）</td><td>BioRad</td><td>161-0154</td><td>用于制备变性聚丙烯酰胺凝胶。</td></tr><tr><td>尿素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>U5378-100G</td><td>用于制备变性聚丙烯酰胺凝胶。</td></tr><tr><td>RNA 上样染料（2x）</td><td>Thermo Fisher</td><td>R0641</td><td>用于将向导 RNA 上样至变性凝胶进行电泳。</td></tr><tr><td>溴化乙锭</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E1510-10ML</td><td>用于核酸的可视化检测。</td></tr><tr><td>SYBER Green</td><td>Thermo Fisher</td><td>S7563</td><td>用于在琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶中检测双链 DNA 的替代方法，可替代溴化乙锭。</td></tr><tr><td>微量离心机</td><td>Eppendorf</td><td>5424</td><td>用于 RNA 清洗和 PCR 产物纯化。</td></tr><tr><td>MyTaq 聚合酶</td><td>Bioline</td><td>BIO-21105</td><td>用于 PCR 扩增 DNA。</td></tr><tr><td>热循环仪</td><td>任意品牌</td><td></td><td>用于 PCR 扩增。</td></tr><tr><td>分光光度计</td><td>任意品牌</td><td></td><td>NanoDrop 或类似产品，用于定量 DNA/RNA 含量。</td></tr><tr><td>E3 胚胎培养基</td><td>实验室自制</td><td></td><td>用于胚胎培养和注射板制备。配方：http://cshprotocols.cshlp.org/content/2011/10/pdb.rec66449</td></tr><tr><td>亚甲蓝</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9140</td><td>添加至 1x E3 培养基中以防止胚胎真菌生长。</td></tr><tr><td>培养皿</td><td>Thermo Fisher</td><td>FB0875711Z</td><td>用于储存胚胎和制备注射板。</td></tr><tr><td>琼脂糖</td><td>Denville</td><td>CA3510-8</td><td>用于制备注射板和琼脂糖凝胶。</td></tr><tr><td>微注射模具</td><td>Adaptive Science Tools</td><td>TU-1</td><td>用于在注射过程中固定胚胎的凹槽制备。</td></tr><tr><td>酚红</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0290&amp;nbsp;</td><td>用于注射过程的可视化染料。</td></tr><tr><td>矿物油</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5904-5ML</td><td>用于校准注射针的注射体积。</td></tr><tr><td>移液管</td><td>任意品牌</td><td></td><td>用于转移胚胎。</td></tr><tr><td>剃须刀片</td><td>Thermo Fisher</td><td>11295-10</td><td>用于切割注射针和成年鱼尾部取样。</td></tr><tr><td>培养箱</td><td>任意品牌</td><td></td><td>用于在 28.5 &lt;sup&gt;o&lt;/sup&gt;C 下培养胚胎。</td></tr><tr><td>垂直式移液器拉针仪</td><td>David Kopf Instruments</td><td>700C</td><td>用于制备注射针。更多拉针操作说明：http://cshprotocols.cshlp.org/content/2006/7/pdb.prot4651.long</td></tr><tr><td>毛细管</td><td>Sutter Instruments</td><td>BF100-58-10</td><td>用于制备注射针。</td></tr><tr><td>微量加样头</td><td>Eppendorf</td><td>930001007</td><td>用于将溶液装入注射针。</td></tr><tr><td>显微注射仪</td><td>World Precision Instruments</td><td>PV 820</td><td>用于胚胎注射。</td></tr><tr><td>解剖显微镜</td><td>Leica</td><td></td><td>用于胚胎注射。</td></tr><tr><td>30% 聚丙烯酰胺（29:1）</td><td>BioRad</td><td>161-0156</td><td>用于异源双链凝胶制备。</td></tr><tr><td>MS-222（Tricaine）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A-5040</td><td>用于斑马鱼麻醉，以便进行尾部取样和胚胎基因组 DNA 提取。配方：https://wiki.zfin.org/display/prot/TRICAINE</td></tr><tr><td>微波炉</td><td>任意品牌</td><td></td><td>用于制备注射板和琼脂糖凝胶。</td></tr><tr><td>天平</td><td>任意品牌</td><td></td><td>用于制备注射板和琼脂糖凝胶。</td></tr><tr><td>手套</td><td>任意品牌</td><td></td><td>用于实验全过程。</td></tr><tr><td>N2</td><td>任意品牌</td><td></td><td>用于从毛细管中排出液体以进行胚胎注射。</td></tr><tr><td>1,000 &amp;micro;L&amp;nbsp; 吸头</td><td>任意品牌</td><td></td><td>用于实验全过程。</td></tr><tr><td>200 &amp;micro;L 吸头</td><td>任意品牌</td><td></td><td>用于实验全过程。</td></tr><tr><td>10 &amp;micro;L 吸头</td><td>任意品牌</td><td></td><td>用于实验全过程。</td></tr><tr><td>PCR 条形管</td><td>任意品牌</td><td></td><td>用于实验全过程。</td></tr><tr><td>微量移液器</td><td>任意品牌</td><td></td><td>用于实验全过程。</td></tr><tr><td>NGS 测序平台：Wideseq</td><td></td><td></td><td>若贵机构未提供此项服务，请访问：https://www.purdue.edu/hla/sites/genomics/wideseq-2/（外部费用：35 美元）。</td></tr><tr><td>序列分析软件</td><td></td><td></td><td>用于杂合鱼的 Sanger 测序分析。访问：http://yosttools.genetics.utah.edu/PolyPeakParser/</td></tr><tr><td>序列分析软件</td><td></td><td></td><td>SnapGene Viewer、Sequence Scanner，用于 NGS 测序数据分析。</td></tr></tbody></table>

高效构建与鉴定模式生物danio rerio中crispr/cas9介导的基因敲除

Efficient Production and Identification of CRISPR/Cas9-generated Gene Knockouts in the Model System Danio rerio

对Streptococcus pyogenes的成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）系统进行表征，使得开发一种可定制的平台成为可能，该平台能够快速在多种生物体（包括斑马鱼）中实现基因修饰。基于CRISPR的基因组编辑利用单链引导RNA（sgRNA）将CRISPR相关（Cas）核酸酶靶向至特定的基因组DNA（gDNA）位点，在该位点Cas核酸酶产生双链断裂（DSB）。通过易错机制修复DSB会导致插入和/或缺失（indels）。这可能引起移码突变，通常在编码序列中引入提前终止密码子，从而产生无功能蛋白的等位基因。基于CRISPR的基因组工程仅需少数几种分子组分，并可通过显微注射轻松导入斑马鱼胚胎中。本实验方案描述了用于制备斑马鱼显微注射用CRISPR试剂以及鉴定具有CRISPR修饰基因生殖系传递的鱼类的方法。这些方法包括sgRNA的体外转录、CRISPR试剂的显微注射、利用基于PCR的异源双链迁移率分析法（HMA）检测靶位点处诱导产生的indel，以及采用低通量和高效的下一代测序（NGS）方法对indel进行表征，后者可分析从杂合子鱼中收集的多个PCR产物。本方案经过优化，旨在最小化所需鱼类数量及分析过程中所需的设备种类。此外，该方案设计为适用于各种经验水平的实验人员，包括本科生，从而使任何希望在斑马鱼中开展基于CRISPR的基因组修饰研究的科研团队均可经济高效地使用这一强大工具。

本方案中描述的实验方法可利用 CRISPR/Cas9 技术高效、低成本地制备斑马鱼基因敲除品系。本文附有以下图示，以帮助解读和排查使用本方案获得的结果。在成功制备并显微注射 CRISPR 试剂后，可通过表型观察和 HMA 检测对斑马鱼胚胎进行分析，以评估明显表型及插入/缺失（indel）的形成情况。为直观评估 CRISPR 实验是否成功，一个有效的对照方法是使用步骤 1.5 中描述的 sgRNA 靶向色素生成基因 tyrosinase。在 tyrosinase 基因位点由 Cas9 诱导产生的 indel 会导致色素缺失，该表型在 48 hpf 时即可轻松判读（图 1）。另一个有助于确认 CRISPR 注射试剂制备是否成功的对照，是通过变性聚丙烯酰胺凝胶验证全长（120 nt）sgRNA 是否成功合成（图 2，第 1 和第 2 泳道）。若 RNA 发生降解，则会在凝胶上呈现弥散条带；例如，图 2 中的第 3 泳道即显示了已降解的 RNA，此类 RNA 不适用于注射。
为了分析由CRISPR-Cas9靶向但未产生明显表型（如tyrosinase）的基因的插入缺失（indel）形成频率，HMA是一种简单且可靠的方法。通过HMA分析sgRNA/Cas9显微注射后的胚胎，会产生异源双链带，并伴随同源双链带强度的降低（图4）。本方案进一步利用异源双链带的存在，用于鉴定显微注射胚胎及其成鱼中的潜在 Founder 鱼（图4 和 图5），分析 Founder 个体的生殖系传递效率（图6），以及验证杂合F1代鱼中是否存在插入缺失（indel）（图7）。含有插入缺失的杂合子鱼可作为候选样本，进行下一代测序（NGS），以确定插入缺失的具体性质，并判断目标基因的编码区是否含有提前终止密码子。
<img alt="斑马鱼胚胎发育；显微镜图像；比较分析；生物学研究。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56969/56969fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Figure 1"> 
图1：在单细胞阶段注射靶向tyrosinase的sgRNA后，斑马鱼胚胎表现出色素缺陷。（A）48小时未注射的野生型胚胎，以及（B）48小时注射后的胚胎。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56969/56969fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="凝胶电泳结果，1-3 泳道显示 120 nt DNA 条带，DNA 分离分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56969/56969fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图2"> 
图2: 体外 使用合成试剂盒进行sgRNA的转录。 寡核苷酸的合成采用 体外 根据sgRNA合成试剂盒说明书进行转录。取500 ng RNA在尿素/PAGE凝胶上电泳分析。第1道和第2道中加载的sgRNA显示出对应于全长完整120 nt RNA的条带。第3道中的sgRNA显示出降解的RNA样本，不适合用于显微注射。
<img alt="胚胎发育阶段的显微镜图像，比较，比例尺500 µm，实验分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56969/56969fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Figure 3"> 
图3：注射后24 hpf胚胎健康状况的比较。 一个存活的胚胎（A）发育至24 hpf，可明显区别于发育中止的胚胎（B）。与（A）相比，形态类似（B）或出现显著异常特征（如脊柱弯曲、头部和眼睛发育异常）的胚胎应从培养皿中移除。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56969/56969fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="显示异源双链和同源双链DNA条带的电泳凝胶；泳道M、1、2、3；100 bp标记物。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56969/56969fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图4"> 
图4：sgRNA-Cas9显微注射斑马鱼胚胎的异源双链迁移率分析。 每个样本收集5个胚胎组成的池样，在72 hpf时取样并提取基因组DNA。按照所述方法进行异源双链分析，各样本等量上样，DNA量为500 ng。泳道：M = 100 bp标记物；1 = 未注射对照；2 = 注射样本1；3 = 注射样本2。预期条带大小 = 98 bp。
<img alt="用于序列分析的DNA电泳凝胶显示异源双链和同源双链条带。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56969/56969fig5.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 5"> 
图 5：成年CRISPR注射斑马鱼尾部提取基因组DNA的异源双链迁移率分析。 注射了sgRNA和Cas9蛋白的胚胎培养至成年（3个月）。鱼B和鱼C显示出异源双链条带，随后用于繁殖以鉴定种系传递的插入缺失突变；鱼A因未显示阳性异源双链条带，未用于后续分析。泳道：1 = 野生型对照；2 = 鱼A；3 = 鱼B；4 = 鱼C。预期条带大小 = 98 bp。 <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56969/56969fig5large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="凝胶电泳结果；使用100 bp标记物的异源双链分析；DNA分离过程。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56969/56969fig6.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图6"> 
图6：通过将F0代CRISPR显微注射斑马鱼与野生型鱼交配产生的单个胚胎进行异源双链迁移率分析，以鉴定生殖系传递的插入缺失突变（indels）。 斑马鱼交配后，F1代胚胎培养72小时。收集单个胚胎，并按前述方法进行异源双链分析。泳道：1 = 野生型对照；2–10 = 每泳道一个F1代胚胎。该凝胶结果显示，10个胚胎中有7个显示出阳性异源双链条带，表明插入缺失突变的生殖系传递率为70%。预期条带大小为98 bp。 <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56969/56969fig6large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="凝胶电泳结果，DNA条带，泳道WT 1-3，显示139 bp和120 bp标记物。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56969/56969fig7.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图7"> 
图7：成年F1代斑马鱼尾鳍组织的异源双链迁移率分析。 通过异源双链迁移率分析（HMA）对成年F1代鱼进行评分，以鉴定插入/缺失突变（indels）。出现阳性异源双链条带的个体经PCR扩增后进行全序列测序分析，以确定突变性质。（A）泳道：1 = 野生型对照；2 = 鱼A（4 bp缺失，1 bp错配）。（B）这些F1代鱼源自同一创始个体（founder），却表现出不同的异源双链图谱，表明单个创始个体可将多种修饰后的等位基因通过生殖系传递给后代。泳道：1 = 野生型对照；2 = 鱼B（4 bp插入，7 bp错配），3 = 鱼C（4 bp缺失，4 bp错配）。根据高通量测序（NGS）结果，这些插入/缺失突变均在靶基因的编码序列中引入了提前终止密码子。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56969/56969fig7large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>

在模式生物Danio rerio（斑马鱼）中，基于CRISPR的技术的出现极大地促进了靶向基因组编辑。本文介绍了一种简化且稳健的实验方案，用于生成和鉴定CRISPR诱导的无义等位基因，该方案结合了异源双链迁移率分析法以及利用高通量测序进行突变鉴定。

高效构建与鉴定模式生物Danio rerio中CRISPR/Cas9介导的基因敲除

对化脓性链球菌（Streptococcus pyogenes）中成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）系统的表征，推动了……的发展

本实验的总体目标是利用 CRISPR/Cas9 技术在斑马鱼中进行靶向基因组编辑，以稳定且经济的方式构建基因敲除模型。该方法有助于回答关于基因在脊椎动物模型系统中生物学功能的关键问题，例如基因如何参与高等真核生物的发育过程。通过这些简单而可靠的实验流程，各级经验水平的实验室人员（包括本科生）均可在斑马鱼中实现靶向基因组修饰。初次接触该方法的研究人员应能够根据逐步说明，确定CRISPR诱变的最佳基因组靶点，完成斑马鱼胚胎的显微注射，并鉴定出修饰后的等位基因。本方法的可视化演示至关重要，因为该方法主要面向可能对其中一项或多项必要技术不熟悉的本科生。文本方案中提供了用于指导RNA合成的模板特异性寡核苷酸设计指南。首先，将Cas9蛋白悬浮于缓冲液中，配制浓度为1毫克/毫升的溶液。将该溶液分装成适合注射的 aliquot，于-80摄氏度保存，以备后续使用。随后，按照本文章材料部分推荐的体外转录试剂盒（如文中所述）的制造商说明书合成sgRNA。使用无RNA酶的乙酸铵沉淀法纯化合成的sgRNA。向合成的RNA中加入25微升5摩尔的乙酸铵，通过涡旋混合溶液。接着，向样品中加入150微升200度无核酸酶乙醇。将反应物置于–80摄氏度的冰箱中至少20分钟。随后，以最大速度离心样品。使用移液器小心移除上清液，注意不要扰动RNA沉淀。然后加入1毫升70%乙醇，反复倒置离心管数次，以洗涤管壁上残留的盐分。在4°C下以最大速度离心7分钟。使用P1000移液器吸除大部分溶液。接下来使用P200移液器小心吸除残留溶液，注意不要扰动沉淀。为避免RNase污染，在洁净环境中将沉淀干燥，直至离心管内无可见液滴。将沉淀重悬于30 µL无RNase的水中，并使用分光光度计对产物进行定量。将溶液分装后于-80摄氏度长期保存。接下来，取300至500纳克的sgRNA与等体积的2X RNA上样缓冲液混合。然后，使用P1000移液器，用电泳缓冲液反复冲洗琼脂糖凝胶的每个加样孔，以清除其中的杂质。将溶液加入琼脂糖凝胶孔中，并以每厘米10伏的电压电泳足够时间，使RNA条带在凝胶中充分分离。电泳时间可能因电泳装置不同而有所差异。一般情况下，应使染料前沿迁移至凝胶长度的2/3处。然后使用核酸染料对条带进行可视化。完整的 RNA 呈现为单一的条带，如本图中第 1 泳道和第 2 泳道所示。降解的 RNA 则呈现为弥散条带，如第 3 泳道所示。首先，按照文本方案中的描述，在进行注射前一晚准备好用于繁殖的斑马鱼实验对象。然后将 Cas9 蛋白与 sgRNA 按 2:1 的比例混合。在室温下孵育该溶液 5 分钟，使 Cas9 与 sgRNA 形成核糖核蛋白复合物。然后加入0.5 µL的2.5%酚红溶液，并用足量的无RNA酶水稀释，使终体积达到5 µL。为制备注射针，使用微量移液器拉制仪将一根直径1毫米的玻璃毛细管拉制成针。随后用剃刀片切割所得玻璃针的尖端，以获得一个倾斜的开口。将针头安装到连接显微注射仪的显微操作器上。在光学显微镜下调节注射压力，直至针头能在培养皿中稳定地注入一纳升溶液。在进行胚胎显微注射前，应练习制备针头，并使用仅含染料的溶液对对照胚胎进行注射操作，记录发育24小时后的存活率。与未注射的对照组相比，存活率应能达到90%以上。接下来，选取10至15枚胚胎作为对照群体，置于另一个标记好的培养皿中。使用移液器，将剩余的胚胎小心地排列在室温下的注射板上。在解剖显微镜下，将一纳升溶液注射到每个胚胎的卵黄囊中。然后将注射后的胚胎放回已标记的培养皿中，并用含亚甲蓝的1× E3培养基覆盖。将注射后的胚胎置于28摄氏度的培养箱中孵育24小时。随后检查已注射的胚胎，剔除死亡或发育异常的个体。首先，从含有已注射胚胎的培养皿中收集两组各五个72小时龄的胚胎，并从未注射的对照组中收集一组五个72小时龄的胚胎，分别放入微量离心管中。轻轻吸去每组胚胎的培养液，并将胚胎麻醉。两分钟后移除麻醉剂，加入45微升50毫摩尔的氢氧化钠。然后在95摄氏度下孵育样品10分钟。接着将样品从孵育器中取出，使其冷却至室温。加入5 µL 1 M pH值为三羟甲基氨基甲烷盐酸盐溶液，充分涡旋混匀样品。然后在室温下以最高速度离心3分钟。将含有基因组DNA的上清液转移至一个新的已标记试管中，并将gDNA于-20 °C保存。使用文中所述设计的引物扩增sgRNA靶向区域附近的片段，以进行异源双链分析。采用PCR纯化试剂盒对PCR反应产物进行纯化。将样品溶于30微升水中，并使用分光光度计对DNA进行定量。将含有PCR扩增产物的试管放入沸水浴中的浮置试管架中。随后使用30%丙烯酰胺配制15%聚丙烯酰胺TBE凝胶。待凝胶凝固后，将其放入含有TBE电泳缓冲液的电泳装置中。然后将500纳克复性后的PCR产物上样，并在每组sgRNA样本旁边上样一个对照。以150伏电压电泳两个半小时，或直至染料前沿迁移至凝胶底部。将HMA中显示杂合双链条带的显微注射斑马鱼胚胎培育至成年。为解读高分辨率熔解曲线分析（HMA）结果，需比较野生型未注射对照样本与相应注射样本在PCR后产生的同源双链条带的强度。若切割效率足够高，注射鱼样本的条带强度应比野生型对照低约50%。为确认潜在创始人亲本鱼中存在插入/缺失突变（indels），使用0.004%三卡因麻醉鱼类，并用洁净的剃须刀片切除尾鳍的1/2至3/4部分。然后，将尾鳍组织放入 45 µL 的 50 mmol/L 氢氧化钠溶液中。将鱼放回恢复用鱼缸，并按照之前所述方法进行基因组 DNA 提取。接着，对尾鳍组织提取的基因组 DNA 进行 HMA 分析，以确定该个体是否通过 CRISPR 注射成功实现基因修饰。然后将尾部DNA中显示异源双链带型的成年鱼与野生型鱼杂交。根据HMA对混合样本的分析结果，筛选 founder 鱼以产生F1代鱼。最后，对目标鱼的基因组DNA进行测序，以鉴定插入缺失（indel）的性质。在成功制备并显微注射CRISPR试剂后，利用HMA分析斑马鱼胚胎的明显表型及插入缺失（indel）的形成情况。Cas9在酪氨酸酶（tyrosinase）基因位点诱导产生的插入缺失会导致色素缺失，该表型在受精后48小时即可通过肉眼轻松判别。对于未引起明显发育表型的CRISPR修饰等位基因，则通过HMA进行鉴定。成功靶向目标基因将导致异源双链带的形成，并使同源双链带的强度降低，如第3和第4泳道所示。请勿忘记，使用脊椎动物进行实验负有伦理责任。本方案描述了减少获得基因敲除所需斑马鱼数量的策略，这一目标在执行该操作时应予以充分考虑。一旦掌握，该技术可用于快速生成并鉴定携带 CRISPR 修饰等位基因的斑马鱼，这些等位基因能够以高效率通过生殖系遗传。重要的是，该技术已优化为低成本方法，适合本科生及缺乏经验的研究人员操作。观看本视频后，您应能充分理解如何简便地设计并实施基于 CRISPR 的斑马鱼基因敲除方法。

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遗传学

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