斑马斑马模型系统中 CRISPR/Cas9-generated 基因挖空的高效生产与鉴定

该程序的总体目标是在斑马鱼中使用 CRISPR/Cas9 技术进行靶向基因组编辑，以稳健、廉价的方式设计基因敲除。这种方法可以帮助回答有关基因在脊椎动物模型系统背景下的生物学作用的关键问题，例如基因如何促进高等真核生物的发育过程。通过这些简单、稳健的程序，包括本科生在内的各种经验水平的实验室人员都可以对斑马鱼进行靶向基因组修饰。

刚接触这种方法的个体应该能够按照分步说明来确定 CRISPR 诱变的最佳基因组靶标，进行斑马鱼胚胎显微注射并识别修饰的等位基因。这种方法的视觉演示至关重要，因为这种方法适用于可能不熟悉一种或多种必要技术的本科生。文本方案中提供了用于向导 RNA 生产的模板特异性寡核苷酸设计指南。

首先，将 Cas9 蛋白悬浮在缓冲液中，以生成每毫升 1 毫克的溶液。将此溶液以可注射的等分试样储存在零下 80 摄氏度以备后用。然后根据制造商的说明，使用体外转录试剂盒合成 sgRNA，例如本文材料中建议的试剂盒。

使用不含 RNAse 的乙酸铵沉淀纯化合成的 sgRNA。向合成的 RNA 中加入 25 微升 5 摩尔乙酸铵，涡旋混合溶液。接下来，向样品中加入 150 μL 200 浓度不含核酸酶的乙醇。

并将反应物放入零下 80 摄氏度的冰箱中至少 20 分钟。然后，以最大速度离心样品。使用移液器去除上清液，注意不要干扰 RNA 沉淀。

然后加入 1 毫升 70% 乙醇，将试管倒置数次，以洗去试管中残留的盐分。再次以最大速度在 4 摄氏度下离心 7 分钟。使用 P1000 移液器去除大部分溶液。

接下来，使用 P200 移液器在不干扰沉淀的情况下去除尽可能多的剩余溶液。注意避免 RNAse 污染，在干净的空间内干燥沉淀，直到试管中没有可见的液滴。将沉淀重悬于 30 μL 不含 RNAse 的水中，并使用分光光度计定量产物。

将溶液分装在零下 80 摄氏度下长期储存。接下来，将 300 至 500 ng sgRNA 与等体积的 2X RNA 凝胶上样染料混合。然后，使用 P1000 移液器，用电泳缓冲液清除每个琼脂糖凝胶孔中的碎片数次。

将溶液加载到琼脂糖凝胶孔中，并以每厘米 10 伏特的速度运行凝胶，以有足够的时间分离凝胶上的 RNA 条带。时间可能因电泳仪而异。通常，染料前沿应运行到凝胶长度的 2/3 秒。

然后使用核酸染色剂观察条带。完整 RNA 显示为单个条带，如此处所示的泳道 1 和 2。降解的 RNA 以弥散条带的形式运行，例如在泳道 3 中。

首先，按照文本方案中的说明，在进行注射的前一晚准备斑马鱼受试者进行繁殖。然后以 2：1 的比例混合 Cas9 蛋白和 sgRNA。在室温下孵育溶液 5 分钟，同时 Cas9 和 sgRNA 形成核糖核蛋白复合物。

然后在足够的不含 RNAse 的水中加入 0.5 μL 的 2.5% 酚红溶液，以达到 5 μL 的最终体积。要准备注射针，请使用微量移液器拉拔器拉动 1 毫米玻璃毛细管。然后用剃须刀片切开所得玻璃针的尖端，以获得一个倾斜的开口。

将针头放入连接到显微注射器的显微作器中。使用光学显微镜，调整注射压力，直到针头始终在培养皿中注射 1 纳米的溶液。在进行胚胎显微注射之前，练习准备针头并使用仅染料溶液注射对照胚胎，并记录发育 24 小时后的存活率。

与未注射的对照相比，您应该能够获得超过 90% 的存活率。接下来，选择 10 到 15 个胚胎作为对照群体，并将它们放在单独的标记培养皿中。使用移液管，小心地将剩余的胚胎在室温注射板上排成一行。

在解剖显微镜下，将 1 纳升溶液注入每个胚胎的卵黄囊中。然后将注射的胚胎放回标记的培养皿中，并用亚甲蓝的 1X E3 培养基覆盖它们。将注射的胚胎放入 28 摄氏度的培养箱中 24 小时。

然后检查注射的胚胎以去除死亡或发育异常的个体。首先，从含有注射胚胎的板中收集两组五个 72 小时龄的胚胎，从未注射的对照组中收集一组五个 72 小时龄的胚胎到微量离心管中。轻轻地从每个胚胎组中吸取培养基并麻醉它们。

两分钟后去除麻醉剂，加入 45 微升 50 毫摩尔氢氧化钠。然后将样品在 95 度下孵育 10 分钟。接下来，从培养箱中取出样品，让它们冷却至室温。

加入 5 微升 1 摩尔 pH 的 tris 盐酸盐，并剧烈涡旋样品。然后在室温下以最大速度离心溶液 3 分钟。将含有基因组 DNA 的上清液转移到新标记的试管中，并将 gDNA 储存在零下 20 摄氏度。

如文中所述，使用设计用于在 sgRNA 靶区周围扩增的引物扩增 PCR 片段以进行异源双链体分析。使用 PCR 纯化试剂盒纯化 PCR 反应产物。用 30 微升水稀释样品，并使用分光光度计定量 DNA。

将含有 PCR 扩增子的试管放在沸水浴中的浮动架中。接下来，使用 30% 聚丙烯酰胺制备 15% 聚丙烯酰胺 TBE 凝胶。凝胶凝固后，将其放入含有 TBE 电泳缓冲液的电泳仪中。

然后加载 500 ng 重新退火的 PCR 产物，并在每组 sgRNA 样品旁边加载对照。在 150 伏特下运行凝胶 2 个半小时，或直到染料前沿位于凝胶底部。长大后注射斑马鱼胚胎到成年，在 HMA 中显示异源双链带。

为了解释 HMA，将野生型未注射对照的 PCR 的同源双链条带的强度与相应的注射样品进行比较。如果发生了足够的切割，则注射鱼的条带强度应比野生型对照低约 50%。为了确认潜在创始亲鱼中存在插入缺失，请在 0.004% 三卡因中麻醉鱼，并使用干净的剃须刀片去除 1/2 至 3/4 的尾鳍。

然后，将尾部放入 45 微升 50 毫摩尔氢氧化钠中。将鱼放回回收箱并如前所述进行 gDNA 提取。接下来，对尾夹 gDNA 进行 HMA，以确定该个体是否通过 CRISPR 注射成功修饰。

然后将尾部 DNA 中表现出异源双链带的成鱼繁殖到野生型鱼。选择创始人鱼，根据池的 HMA 分析生成 F1 鱼。最后，对目标鱼的 gDNA 进行测序，以表征插入缺失的性质。

在成功生产和显微注射 CRISPR 试剂后，使用 HMA 分析斑马鱼胚胎的显性表型和插入缺失形成。Cas9 诱导的酪氨酸酶插入缺失形成导致色素沉着丧失，并且在受精后 48 小时很容易评分。使用 HMA 鉴定不会导致明显发育表型的 CRISPR 修饰等位基因。

成功靶向目的基因导致异源双链条带的形成和同源双链条带的强度降低，例如在泳道 3 和 4 中。不要忘记，与脊椎动物生物一起工作需要承担道德责任。该协议描述了最大限度地减少获得敲除所需的斑马鱼数量的策略，这是在执行此过程时应考虑的目标。

一旦掌握，该技术可用于快速生成和识别携带 CRISPR 修饰等位基因的斑马鱼，这些等位基因将在种系中高效传递。重要的是，这种技术已经过优化，是一种低成本的方法，适合本科生和其他之前经验很少的人。观看此视频后，您应该对如何使用斑马鱼轻松设计和实施基于 CRISPR 的基因敲除方法有很好的了解。