乙醇固定和 DAPI 染色:C. elegans中可视化 DNA 的方法

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- 从显微镜载玻片上的一滴缓冲溶液开始,然后将完整的蠕虫转移到液滴中。蠕虫就位后,使用无绒纸巾吸收并去除缓冲液。用 90% 乙醇浸泡样品数次,使其在每次应用后蒸发,以固定样品。

最终冲洗后乙醇蒸发后,向样品中加入含有核酸染料 DAPI 的溶液。DAPI 优先与 DNA 小沟中的腺嘌呤和胸腺嘧啶碱基结合。结合后,DAPI-DNA 复合物吸收紫外光并发出可见蓝光。

接下来添加抗褪色防腐剂以延长样品的保质期。套上盖玻片并将其密封在载玻片上。然后使用带有蓝色滤光片的荧光显微镜观察 DAPI 小体,根据细胞及其周期状态,DAPI小体可以代表单条染色体、姐妹染色单体对或整个细胞核。在本实验中,我们将对卵母细胞中 DAPI 染色的姐妹染色单体对进行计数,以鉴定秀丽隐杆线虫的四倍体菌株。

- 四倍体菌株有 12 对染色体,可以通过对未受精卵母细胞中的 DAPI 染色体进行计数来验证。为此,将 5 到 10 微升 M9 缓冲液滴到载玻片上,并将 6 到 10 个假定的四倍体转移到液滴中。在解剖显微镜下,小心地将大部分 M9 吸收到不起毛的清洁纸巾中。

然后将 10 微升 90% 乙醇滴到蠕虫上,观察乙醇完全蒸发。蒸发完成后,重复添加乙醇并观察其蒸发的过程。总共分 4 次应用添加 10 μL。最后一滴蒸发后,以每微升 2 纳克的密度加入 6 微升 DAPI,或类似的染色剂。

为了长期储存载玻片,请将蠕虫安装在市售或自制的防褪色剂中。然后添加盖玻片并用指甲油密封边缘。指甲油干燥后,可以对载玻片进行评分。使用荧光显微镜和 100 倍放大倍率。

首先,找到最成熟的未受精卵母细胞,它紧邻腔,尚未进入或子宫。这里的 DAPI 小体可能是单对染色体。接下来,聚焦于卵母细胞的细胞核,并使用显微镜的精细聚焦从上到下缓慢扫描它,同时计数 DAPI 小体。然后通过将焦点从下到上移动来重新计算同一核中的 DAPI 体。

野生型卵母细胞平均有 6 个 DAPI 小体。12 个 DAPI 小体的存在表明该菌株中的动物是部分或完全四倍体。每个菌株至少分析 10 只动物。通常,染色体对会非常接近或接触,因此 DAPI 小体的数量通常小于染色体对的实际数量。

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Last updated: 4 July 2026