通过绿色荧光蛋白标记与4',6-二脒基-2-苯基吲哚染色检测蛋白质亚细胞定位 秀丽隐杆线虫

该方法有助于解答秀丽隐杆线虫（C.elegans）研究领域中的关键问题，例如细胞生物学问题。该技术的主要优势在于能够快速高效地同时获得细胞核染色、绿色荧光蛋白（GFP）以及亚细胞定位变化的信号。首先，构建一个包含目的基因翻译融合结构的染色体外阵列。

或者，可从秀丽隐杆线虫遗传中心（Caenorhabditis Genetic Center）获取此类品系，该中心是提供 C. elegans 研究公共资源的机构；也可从先前已发表的研究实验室获得。将线虫暴露于γ射线以使染色体外阵列整合到基因组中后，筛选稳定表达的品系，使每条线虫均表达标记蛋白，例如 GFP 或 Roller 蛋白。

为消除辐射过程中产生的突变，需将品系至少回交两次。利用获得的转基因品系检测在胁迫条件下蛋白质表达模式的变化。接着，按照文本方案制备NGM线虫平板，划线接种OP50克隆，并在液体LB培养基中过夜培养细菌。

用液体OP50培养物接种NGM平板，并在37摄氏度培养箱中过夜培养，以形成供线虫食用的细菌菌苔。使用前将平板在室温下冷却至少30分钟。在进行热应激实验前，将转基因品系在20摄氏度条件下无饥饿培养至少两代。

挑选八到十条年轻的成年线虫（带有大量卵）转移到新的线虫培养板上。让它们产卵约三到五小时，然后将所有成虫从培养板上移除。为了同步线虫发育，让卵孵化并继续培养幼虫约48小时，直至发育至第四龄幼虫（L4期）。

可通过阴门（一种半月形结构）进行识别。将含有L4幼虫的培养皿置于35摄氏度下孵育2至5小时，对线虫进行热应激处理。在培养箱中放置一支温度计，以准确测量温度。

用移液器吸取10微升M9缓冲液，滴加到玻璃载玻片中央。然后挑取热激后的线虫，将其转移至缓冲液滴中。或者，也可使用M9缓冲液将线虫从培养皿上冲洗下来。

然后在室温下以1000 × g离心样品1分钟。弃去上清液，将线虫转移至玻片上。在体视显微镜下，用柔软的纸巾吸去多余的液体。

然后，在显微镜下向线虫加入 10 微升 95% 乙醇，并继续观察。乙醇干燥后立即重复添加乙醇，共重复两次。此步骤的关键在于乙醇必须在解剖显微镜下从动物样本上完全蒸发。

乙醇挥发后，立即进行下一步操作。向线虫中加入10 µL DAPI。立即加盖盖玻片，并用透明指甲油凝胶封片。

待指甲油固定约10分钟后，在荧光显微镜下观察动物。如需用丙酮固定样本，先用M9缓冲液冲洗热激后的平板，然后在室温下以1000 × g离心样品1分钟。弃去上清液，用1毫升蒸馏水洗涤沉淀。

去除上清液后，加入400微升30%丙酮，将样品孵育15分钟。然后在室温下以1000 × g离心1分钟。弃去上清液后，用500微升蒸馏水洗涤生物样本两次。

向沉淀中加入 200 微升 DAPI，或向试管中加入总体积的线虫体积四倍量的 DAPI，样品孵育 15 分钟。离心样品并弃去上清液。然后用 500 微升蒸馏水洗涤沉淀两次，再按照之前的方法进行封片和成像。

进行成像时，打开紫外光源和荧光显微镜，然后启动与显微镜连接的计算机。将玻片载入荧光显微镜。

使用10倍物镜定位线虫，然后将放大倍数调至400倍，并对样本进行聚焦。接着，打开显微镜配套的软件。

单击“采集”，然后单击“相机”，并选择连接到显微镜的相机。在相同的“采集”菜单下，单击“多维采集”。这将打开一个新的多维采集导航窗口。

单击多通道按钮，所有可用通道将显示出来。选择蓝色、绿色和 DIC 以观察样本。在多维采集导航窗口中，保持蓝色 DAPI、绿色 GFP 和灰色 DIC 通道开启，右键单击其他通道（如红色 Rhodamine 和白色 Brightfield）以关闭它们。

为测量每个通道的曝光时间，用鼠标左键单击蓝色的 DAPI 通道以选中该通道，然后单击“measure”以自动曝光时间采集实时图像。在实时图像窗口的左侧，可根据需要手动调整曝光时间，然后单击“OK”。以类似方式设置 GFP 和 DIC 通道的曝光时间。在多维采集导航窗口中，单击“Start”即可按照设定的曝光时间，依序自动采集三个不同通道下的三幅图像。

要保存文件，请在主菜单中点击“文件”，然后选择“另存为”。输入文件名和文件夹路径。请将文件以默认文件格式保存，以保留详细的成像信息，供日后参考。如需以其他格式导出文件，请在“文件”菜单下点击“导出”。

设置文件名和文件夹。勾选“创建项目文件夹”以更好地组织数据。从下拉菜单中选择所需的文件类型后，点击“开始”以导出。

秀丽隐杆线虫中有两种氯离子细胞内通道蛋白同源物，即 exl-1 和 exc-4。最近一项研究表明，exl-1 调控动物的应激管理。本文中，将一个翻译水平的 exl-1 GFP 构建体整合到动物基因组中，并建立了稳定表达绿色荧光 exl-1 的转基因品系。

在热应激条件下，exl-1 GFP 在肠区细胞核中积累，表现为强烈的 GFP 信号与细胞核重叠。为确认 exl-1 的亚细胞定位，对经乙醇和丙酮固定的动物均进行了 DAPI 染色。两种方法均清晰显示了动物体内的细胞核，且 GFP 信号与 DAPI 信号的重叠证实 exl-1 GFP 确实积累于肠区细胞核中。

一旦掌握，若操作得当，该技术可在一小时内完成。观看本视频后，您应能充分理解如何快速固定以保存线虫（C.elegans）在胁迫条件下GFP信号及蛋白质的核转位。