秀丽线虫绿色荧光蛋白标记和 4 '、6-Diamidino-2-苯基吲哚染色检测蛋白质亚细胞定位

该协议演示了如何在热应激下跟踪蛋白质核易位, 方法是使用绿色荧光蛋白 (GFP) 融合蛋白作为标记, 4 ', 6-diamidino-2-苯基吲哚 (DAPI) 染色。DAPI 染色协议快速, 保留了 GFP 和蛋白质亚细胞定位信号。

这种方法可以帮助回答秀丽隐杆线虫领域的关键问题，例如细胞生物学。该技术的主要优点是可以快速有效地同时获得核染色、GFP 和亚细胞定位变化的信号。首先，生成与靶基因的翻译构建体对齐的染色体外阵列。

或者，从 Caenorhabditis 遗传中心获得此类品系，该中心是秀丽隐杆线虫研究的公共资源。或者，来自以前发表的研究实验室。将蠕虫暴露于 γ 辐射以将染色体外线整合到基因组中后，选择稳定表达的线，使每只动物都表达一种标记蛋白，例如 GFP 或滚轮。

要去除辐射过程中产生的突变，请至少越过谱系两次。使用所得转基因系检测应激下的蛋白表达模式变化。接下来，根据文本方案制备 NGM 蠕虫板后，划线 OP50 克隆并在液体 LB 肉汤中培养细菌过夜。

用液体 OP50 培养物接种 NGM 板，并将板在 37 摄氏度的培养箱中孵育过夜，以在细菌草坪上生长作为蠕虫的食物来源。使用前，将板在室温下冷却至少 30 分钟。在 20 摄氏度下生长转基因系而不饥饿，在热应激测定之前至少两代。

将 8 到 10 只年轻的怀孕成虫挑选到新的蠕虫板中。然后让它们产卵约 3 到 5 小时，并将所有成虫从盘子中取出。为了同步蠕虫，让虫卵孵化并使幼虫生长大约 48 小时，直到第四只幼虫或 L4 阶段。

这可以通过外阴来识别，外阴是一个半月形结构。然后通过将板与 L4 幼虫在 35 摄氏度下孵育 2 到 5 小时来对蠕虫进行热应激。在培养箱中加入温度计以准确测量温度。

将 10 微升 M9 移液到载玻片的中心。然后挑选受热冲击的蠕虫并将它们转移到缓冲液滴中。或者，使用 M9 将蠕虫从板上洗掉。

然后在室温下以 1000 倍重力离心样品 1 分钟。弃去上清液，然后将蠕虫添加到载玻片中。在解剖显微镜下，使用软组织排出多余的液体。

然后，在显微镜下，将 10 微升 95% 酒精添加到蠕虫上并继续观察它们。乙醇干燥后，立即重复添加乙醇两次。对于在解剖显微镜下从动物身上蒸发的乙醇过程至关重要。

一旦乙醇从动物身上脱落，立即进行下一步。向蠕虫中加入 10 微升 DAPI。立即盖上盖玻片并用透明指甲油凝胶密封载玻片。

让指甲油凝固约 10 分钟后，在荧光显微镜下观察动物。要用丙酮固定动物，请使用 M9 洗掉热休克板，并在室温下以 1000 倍重力离心样品 1 分钟。弃去上清液，用一毫升蒸馏水洗涤沉淀。

去除上清液后，加入 400 μL 30% 丙酮，并将样品孵育 15 分钟。然后在室温下以 1000 倍重力离心管 1 分钟。弃去上清液后，用 500 微升蒸馏水洗涤动物两次。

向沉淀中加入 200 μL DAPI，或向试管中加入蠕虫总体积的四倍，并将样品孵育 15 分钟。离心样品并弃去上清液。然后使用 500 微升蒸馏水洗涤沉淀两次，然后像以前一样进行安装和成像。

要进行成像，请打开 UV 光源和荧光显微镜。然后打开连接到显微镜的计算机。将载玻片加载到荧光显微镜上。

使用 10 倍物镜定位蠕虫。然后将放大倍率增加到 400 倍并聚焦在标本上。接下来，打开显微镜随附的软件。

单击 Acquisition，然后单击 Camera，然后选择连接到显微镜的相机。在同一 Acquisition 下，单击 Multidimensional Acquisition。这将打开一个新的 Multidimensional Acquisition 导航窗口。

单击多频道按钮，将显示所有可用频道。选择蓝色、绿色和 DIC 以观察标本。在 Multidimensional Acquisition 导航窗口中，保持蓝色 DAPI、绿色 GFP 和灰色 DIC 通道处于打开状态，然后右键单击其他通道，例如红色 Rhodamine 和白色 Brightfield 通道，以关闭它们。

要测量每个通道的曝光时间，请左键单击蓝色 DAPI 通道以将其选中，然后单击"测量"以拍摄具有自动曝光时间的实时图像。在实时图像窗口的左侧，根据需要手动调整曝光时间，然后单击 确定.以类似的方式设置 GFP 和 DIC 通道的曝光时间。在 Multidimensional Acquisition 导航窗口中，单击 Start"以自动收集三个不同通道下的三张图像，按顺序和设置的曝光时间。

要保存文件，请在主菜单中单击 File（文件）、Save As（另存为），输入文件名和文件夹。将文件保存为默认文件格式，以保留详细的映像信息以供将来参考。要以其他格式导出文件，请在 File （文件） 下单击 Export （导出）。

设置文件名和文件夹。选中 Create a project folder"以更好地组织数据。从下拉菜单中选择所需的文件类型后，单击 Start 开始"导出。

秀丽隐杆线虫中有两种氯离子细胞内通道蛋白同源物，exl-1 和 exc-4。最近的一项研究表明，exl-1 调节动物应激管理。在这里，将翻译的 exl-1 GFP 构建体整合到动物基因组中，并创建了稳定表达绿色荧光 exl-1 的转基因系。

在热应激下，exl-1 GFP 在肠道区域的细胞核中积累，因为强的 GFP 信号与细胞核重叠。为了确认 exl-1 的亚细胞定位，在乙醇和丙酮固定动物中进行了 DAPI 染色。两种方法都显示动物体内的透明细胞核，重叠的 GFP 和 DAPI 信号证实 exl-1 GFP 确实在肠道区域的细胞核中积累。

一旦掌握，如果执行得当，这项技术可以在一小时内完成。观看此视频后，您应该对秀丽隐杆线虫在应激下如何进行快速固定以保持 GFP 信号和蛋白质核转位有很好的了解。