Name: 秀丽线虫绿色荧光蛋白标记和 4 、6-Diamidino-2-苯基吲哚染色检测蛋白质亚细胞定位 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 36 s
Description: 学习利用绿色荧光蛋白融合标记和DAPI染色技术，在秀丽隐杆线虫中快速检测蛋白质核转位及亚细胞定位变化的高效方法。该技术可同步观察核染色与蛋白定位动态。

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本研究中使用的 C. elegans 菌株来自线虫遗传学中心（Caenorhabditis Genetics Center），该中心由美国国立卫生研究院研究基础设施项目（P40 OD010440）资助。本工作得到以下资助：美国国立卫生研究院（NIH）1R03AG048578-01 项目、CUNY-CCRG 1501 项目以及 PSC-CUNY 66184-00 44 和 67248-00 45 项目，均由 Jun Liang 负责。我们感谢 Cathy Savage-Dunn 慷慨提供实验室空间。所有荧光图像均在皇后学院核心设施采集。我们感谢 William J. Rice 对稿件提出的修改意见。

1. 溶液
<ol>
	<li>NGM 平板
	<ol>
		<li>在2 L的锥形瓶中，加入3 g NaCl、17 g琼脂、2.5 g蛋白胨和975 mL dH₂O2O. 用铝箔封住烧瓶口，高压灭菌50分钟，冷却20–30分钟。</li>
		<li>然后加入灭菌溶液：1 mL 1 M CaCl2，1 mL 5 mg/mL 胆固醇乙醇溶液，1 mL 1 M MgSO₄4，以及25 mL 1 M KPO4 （pH 6.0）缓冲液。轻轻摇动溶液使其充分混匀。</li>
		<li>使用液体分配器将NGM溶液分装至60 mm培养皿中，加入琼脂至培养皿容量的2/3。将培养皿密封存放于4 °C环境中，以备后续使用。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>1 M KPO4 缓冲液（pH 6.0）
	<ol>
		<li>溶解 10.83 g KH2PO4 和 3.56 g 的 K2HPO4 在 dH₂O 中2O，然后将总体积调至100 mL。将溶液高压灭菌15分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>M9
	<ol>
		<li>溶解3 g KH2PO4, 6 g Na2HPO4，以及5 g NaCl溶于dH₂O中2O，加入1 mL 1 M MgSO₄4，并将总体积调至1 L。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>10 µg/mL DAPI
	<ol>
		<li>将1 µL的10 mg/mL DAPI加入999 µL的dH₂O中2O.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>95% 乙醇（v/v）
	<ol>
		<li>量取95 mL的100%酒精，加入蒸馏水定容至100 mL。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>30% 丙酮（v/v）
	<ol>
		<li>加入 30 mL 丙酮至 dH₂O 中2O，并调整总体积至100 mL。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 热应激
<ol>
	<li>构建含有目标基因翻译融合构建体的染色体外阵列品系9,10。或者，可从秀丽隐杆线虫遗传中心（Caenorhabditis Genetics Center, CGC）——一个面向 C. elegans 研究的公共资源库——或先前已发表的研究实验室获取此类品系。</li>
	<li>通过将线虫暴露于3,800 Rad的γ射线辐射，将染色体外阵列品系整合到基因组中9。随后筛选稳定表达的品系，确保每条线虫均表达一种标记蛋白，如GFP或Roller表型。</li>
	<li>为消除辐射过程中可能产生的突变，至少进行两次回交。使用该转基因品系检测在胁迫条件下蛋白表达模式的变化。</li>
	<li>按步骤1.1所述制备NGM线虫培养板。挑取OP50菌落并在液体LB培养基中过夜培养。将液体OP50培养物接种至NGM平板上，于37 °C培养箱中过夜培养以形成细菌菌苔，作为线虫的食物来源。使用前将平板在室温下冷却至少30分钟。</li>
	<li>在进行热激实验前，将转基因品系在20 °C条件下无饥饿培养至少两代。</li>
	<li>挑选8–10只年轻产卵期成虫（子宫内充满卵）转移至新的线虫培养板，让其产卵约3–5小时，随后移除所有成虫。</li>
	<li>为实现线虫同步化，让卵孵化并培养幼虫约48小时至四龄幼虫（L4）阶段。通过观察其阴门结构（半月形结构）来确认L4阶段（图1，箭头所示）11。</li>
	<li>将含有L4幼虫的线虫培养板置于35 °C培养箱中2–5小时，以实现热激处理。在培养箱内放置温度计以准确监测温度。</li>
</ol>
3. DAPI 染色
<ol>
	<li>乙醇固定
	<ol>
		<li>在玻璃载片中央加入 10 µL M9 缓冲液。</li>
		<li>从步骤 2.8 中挑取热激后的线虫，放入玻璃载片上的 M9 缓冲液中。
		<ol>
			<li>或者，用 M9 缓冲液冲洗培养皿，室温下以 1,000 × g 离心 1 分钟，弃去上清液，将线虫转移至玻璃载片。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>用柔软的纸巾吸去多余液体，在解剖显微镜下观察此步骤。</li>
		<li>在线虫上加入 10 µL 95% 乙醇，使其自然干燥。在解剖显微镜下观察该过程，注意不要让样品过于干燥。乙醇挥发后立即进行下一步操作。 
		注意：乙醇挥发非常迅速。</li>
		<li>重复步骤 3.1.4 两次，以完成线虫的固定。 
		注意：线虫颜色变深并出现形变是正常现象。</li>
		<li>向线虫中加入 10 µL DAPI（10 µg/mL），立即加盖盖玻片，并用透明指甲油密封载片。</li>
		<li>约 10 分钟后在荧光显微镜下观察样品。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>丙酮固定（替代方法）
	<ol>
		<li>用 M9 缓冲液冲洗步骤 2.8 中的热激培养皿，室温下以 1,000 × g 离心 1 分钟，弃去上清液。用 1 mL dH2O 洗涤沉淀，收集沉淀后弃去上清液。</li>
		<li>加入 400 µL 30% 丙酮，作用 15 分钟。室温下以 1,000 × g 离心 1 分钟，弃去上清液。用 500 µL dH2O 洗涤样品两次，每次均弃去上清液。</li>
		<li>在离心管中加入 200 µL DAPI（10 µg/mL），或加入总体积为线虫体积 4 倍的 DAPI，染色 15 分钟。</li>
		<li>以 1,000 × g 离心 1 分钟，弃去上清液。用 500 µL dH2O 洗涤沉淀两次。将线虫转移至玻璃载片，加盖盖玻片，用透明指甲油密封载片，然后在荧光显微镜下观察样品。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 显微成像
<ol>
	<li>打开紫外光源和荧光显微镜，启动与显微镜连接的计算机。</li>
	<li>将载玻片放置在荧光显微镜上。使用低倍物镜（10X）定位线虫，然后将放大倍数调至400X，并对样本进行聚焦。</li>
	<li>打开显微镜配套的软件。在菜单中点击&#34;Acquisition&#34;，然后点击&#34;Camera&#34;并选择与显微镜连接的相机；此操作可使所选相机与软件建立通信。 
	注意：不同型号的显微镜操作可能有所差异。</li>
	<li>在同一&#34;Acquisition&#34;菜单下，点击&#34;Multidimensional Acquisition&#34;。这将打开一个新的&#34;Multidimensional Acquisition&#34;导航窗口。点击&#34;Multichannel&#34;按钮，所有可用通道将显示出来。</li>
	<li>选择蓝色、绿色和DIC（微分干涉差）通道以观察样本。在&#34;Multidimensional acquisition&#34;导航窗口中，保留&#34;Blue-DAPI&#34;、&#34;Green-GFP&#34;和&#34;Grey-DIC&#34;、&#34;Nomarski&#34;通道开启；右键单击其他通道（如&#34;Red-rhodamine&#34;和&#34;White-bright field&#34;）将其关闭。</li>
	<li>首先，测量每个通道的曝光时间：
	<ol>
		<li>左键单击&#34;Blue-DAPI&#34;通道以选中它，然后点击&#34;Measure&#34;，以在DAPI通道下自动设定曝光时间并获取实时图像。一个新的实时图像窗口将出现。</li>
		<li>在实时图像窗口的左侧，根据需要手动调整曝光时间，以获得理想的图像效果。</li>
		<li>最后，在实时图像窗口中点击&#34;OK&#34;。这将设定DAPI通道下的曝光时间。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>对其他通道&#34;Green-GFP&#34;和&#34;Grey-DIC&#34;、&#34;Nomarski&#34;重复步骤4.6，以设定这些通道的曝光时间。</li>
	<li>在&#34;Multidimensional acquisition&#34;导航窗口中，点击&#34;Start&#34;，系统将按照上述设定的曝光时间，依次自动采集三个不同通道下的三幅图像。</li>
	<li>为保存文件，请进入主菜单，点击&#34;File&#34;，然后点击&#34;Save as&#34;。输入文件名和文件夹名称。将文件保存为默认格式，以保留详细的成像信息供将来参考。</li>
	<li>以其他格式导出文件：
	<ol>
		<li>进入&#34;File&#34;，点击&#34;Export&#34;。这将打开导出设置窗口。</li>
		<li>设置文件名和文件夹。勾选&#34;Create a project folder&#34;以更好地组织数据。软件还允许用户指定另外四个选项：&#34;Generate merged images&#34;、&#34;Use color for channel images&#34;、&#34;Use channel names&#34;和&#34;Merged image only&#34;。</li>
		<li>从下拉菜单中选择所需的文件类型，例如&#34;TIF&#34;、&#34;BMP&#34;、&#34;PSD&#34;或&#34;JPG&#34;等其他格式，然后点击&#34;Start&#34;开始导出。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Essers, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FOXO+transcription+factor+activation+by+oxidative+stress+mediated+by+the+small+GTPase+Ral+and+JNK%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">FOXO transcription factor activation by oxidative stress mediated by the small GTPase Ral and JNK.</a> The EMBO Journal. 23 (24), 4802-4812 (2004).</li>
<li>Oh, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((JNK+regulates+lifespan+in+Caenorhabditis+elegans+by+modulating+nuclear+translocation+of+forkhead+transcription+factor%2FDAF-16%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">JNK regulates lifespan in Caenorhabditis elegans by modulating nuclear translocation of forkhead transcription factor/DAF-16.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (12), 4494-4499 (2005).</li>
<li>Gross, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caspase+cleaved+BID+targets+mitochondria+and+is+required+for+cytochrome+c+release%2C+while+BCL-XL+prevents+this+release+but+not+tumor+necrosis+factor-R1%2FFas+death%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Caspase cleaved BID targets mitochondria and is required for cytochrome c release, while BCL-XL prevents this release but not tumor necrosis factor-R1/Fas death.</a> The Journal of Biological Chemistry. 274 (2), 1156-1163 (1999).</li>
<li>Doerflinger, M., Glab, J. A., Puthalakath, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BH3-only+proteins%3A+a+20-year+stock-take%5BTitle%5D)+AND+%22The+FEBS+Journal%22%5BJournal%5D)">BH3-only proteins: a 20-year stock-take.</a> The FEBS Journal. 282 (6), 1006-1016 (2015).</li>
<li>Mayorova, T. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cells+containing+aragonite+crystals+mediate+responses+to+gravity+in+Trichoplax+adhaerens+%28Placozoa%29%2C+an+animal+lacking+neurons+and+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Cells containing aragonite crystals mediate responses to gravity in Trichoplax adhaerens (Placozoa), an animal lacking neurons and synapses.</a> PLoS One. 13 (1), e0190905(2018).</li>
<li>Terron-Camero, L. C., Molina-Moya, E., Sanz-Fernandez, M., Sandalio, L. M., Romero-Puertas, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+reactive+oxygen+and+nitrogen+species+%28ROS%2FRNS%29+during+hypersensitive+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Detection of reactive oxygen and nitrogen species (ROS/RNS) during hypersensitive cell death.</a> Methods in Molecular Biology. , 97-105 (2018).</li>
<li>Pedrazzini, E., Vitale, A. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/29043678">Protein biosynthesis and maturation in the ER.</a> Methods in Molecular Biology. , 179-189 (2018).</li>
<li>Liang, J., Shaulov, Y., Savage-Dunn, C., Boissinot, S., Hoque, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chloride+intracellular+channel+proteins+respond+to+heat+stress+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Chloride intracellular channel proteins respond to heat stress in Caenorhabditis elegans.</a> PLoS One. 12 (9), e0184308(2017).</li>
<li>Evans, T. C. Transformation and microinjection. <a target="_blank" href="http://www.wormbook.org">Wormbook</a>. , edited by The C. elegans Research Community (2006).</li>
<li>Mello, C., Fire, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">DNA transformation.</a> Methods in Cell Biology. 48, 451-482 (1995).</li>
<li>Yochem, J. Nomarski images for learning the anatomy, with tips for mosaic analysis. <a target="_blank" href="http://www.wormbook.org">Wormbook</a>. , edited by The C. elegans Research Community (2006).</li>
<li>Dulhunty, A., Gage, P., Curtis, S., Chelvanayagam, G., Board, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+glutathione+transferase+structural+family+includes+a+nuclear+chloride+channel+and+a+ryanodine+receptor+calcium+release+channel+modulator%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The glutathione transferase structural family includes a nuclear chloride channel and a ryanodine receptor calcium release channel modulator.</a> The Journal of Biological Chemistry. 276 (5), 3319-3323 (2001).</li>
<li>Suh, K. S., Malik, M., Shukla, A., Yuspa, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CLIC4%2C+skin+homeostasis+and+cutaneous+cancer%3A+surprising+connections%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Carcinogenesis%22%5BJournal%5D)">CLIC4, skin homeostasis and cutaneous cancer: surprising connections.</a> Molecular Carcinogenesis. 46 (8), 599-604 (2007).</li>
<li>Yao, Q., Qu, X., Yang, Q., Wei, M., Kong, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CLIC4+mediates+TGF-beta1-induced+fibroblast-to-myofibroblast+transdifferentiation+in+ovarian+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Oncology+Reports%22%5BJournal%5D)">CLIC4 mediates TGF-beta1-induced fibroblast-to-myofibroblast transdifferentiation in ovarian cancer.</a> Oncology Reports. 22 (3), 541-548 (2009).</li>
<li>Ronnov-Jessen, L., Villadsen, R., Edwards, J. C., Petersen, O. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+expression+of+a+chloride+intracellular+channel+gene%2C+CLIC4%2C+in+transforming+growth+factor-beta1-mediated+conversion+of+fibroblasts+to+myofibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Differential expression of a chloride intracellular channel gene, CLIC4, in transforming growth factor-beta1-mediated conversion of fibroblasts to myofibroblasts.</a> The American Journal of Pathology. 161 (2), 471-480 (2002).</li>
<li>He, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+CLIC4+in+the+host+innate+responses+to+bacterial+lipopolysaccharide%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Role of CLIC4 in the host innate responses to bacterial lipopolysaccharide.</a> European Journal of Immunology. 41 (5), 1221-1230 (2011).</li>
<li>Zhong, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+CLIC4+enhances+autophagy+and+triggers+mitochondrial+and+ER+stress-induced+apoptosis+in+human+glioma+U251+cells+under+starvation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Inhibition of CLIC4 enhances autophagy and triggers mitochondrial and ER stress-induced apoptosis in human glioma U251 cells under starvation.</a> PLoS One. 7 (6), e39378(2012).</li>
<li>Liang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Caenorhabditis+elegans+schnurri+homolog+sma-9+mediates+stage-+and+cell+type-specific+responses+to+DBL-1+BMP-related+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The Caenorhabditis elegans schnurri homolog sma-9 mediates stage- and cell type-specific responses to DBL-1 BMP-related signaling.</a> Development. 130 (26), 6453-6464 (2003).</li>
<li>Leopold, L. E., Heestand, B. N., Seong, S., Shtessel, L., Ahmed, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lack+of+pairing+during+meiosis+triggers+multigenerational+transgene+silencing+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Lack of pairing during meiosis triggers multigenerational transgene silencing in Caenorhabditis elegans.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (20), E2667-E2676 (2015).</li>
<li>Schultz, R. D., Bennett, E. E., Ellis, E. A., Gumienny, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+extracellular+matrix+organization+by+BMP+signaling+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Regulation of extracellular matrix organization by BMP signaling in Caenorhabditis elegans.</a> PLoS One. 9 (7), e101929(2014).</li>
<li>Matus, D. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Invasive+cell+fate+requires+G1+cell-cycle+arrest+and+histone+deacetylase-mediated+changes+in+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Invasive cell fate requires G1 cell-cycle arrest and histone deacetylase-mediated changes in gene expression.</a> Developmental Cell. 35 (2), 162-174 (2015).</li>
<li>Reddy, K. C., Villeneuve, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C.+elegans+HIM-17+links+chromatin+modification+and+competence+for+initiation+of+meiotic+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">C. elegans HIM-17 links chromatin modification and competence for initiation of meiotic recombination.</a> Cell. 118 (4), 439-452 (2004).</li>
<li>Ames, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+non-cell-autonomous+role+of+BEC-1%2FBECN1%2FBeclin1+in+coordinating+cell-cycle+progression+and+stem+cell+proliferation+during+germline+development%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">A non-cell-autonomous role of BEC-1/BECN1/Beclin1 in coordinating cell-cycle progression and stem cell proliferation during germline development.</a> Current Biology. 27 (6), 905-913 (2017).</li>
<li>Pekar, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Linking+the+environment%2C+DAF-7%2FTGFbeta+signaling+and+LAG-2%2FDSL+ligand+expression+in+the+germline+stem+cell+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Linking the environment, DAF-7/TGFbeta signaling and LAG-2/DSL ligand expression in the germline stem cell niche.</a> Development. 144 (16), 2896-2906 (2017).</li>
<li>Schvarzstein, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+helicase+HIM-6%2FBLM+both+promotes+MutSgamma-dependent+crossovers+and+antagonizes+MutSgamma-independent+interhomolog+associations+during+caenorhabditis+elegans+meiosis%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">DNA helicase HIM-6/BLM both promotes MutSgamma-dependent crossovers and antagonizes MutSgamma-independent interhomolog associations during caenorhabditis elegans meiosis.</a> Genetics. 198 (1), 193-207 (2014).</li>
<li>Flemming, A. J., Shen, Z. Z., Cunha, A., Emmons, S. W., Leroi, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Somatic+polyploidization+and+cellular+proliferation+drive+body+size+evolution+in+nematodes%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Somatic polyploidization and cellular proliferation drive body size evolution in nematodes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (10), 5285-5290 (2000).</li>
<li>Nagamatsu, Y., Ohshima, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+for+the+control+of+body+size+by+a+G-kinase+and+a+downstream+TGFbeta+signal+pathway+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+to+Cells%22%5BJournal%5D)">Mechanisms for the control of body size by a G-kinase and a downstream TGFbeta signal pathway in Caenorhabditis elegans.</a> Genes to Cells. 9 (1), 39-47 (2004).</li>
</ol>

作者无任何声明。

本文介绍了一种快速高效验证蛋白质从细胞质向细胞核转移的方法。通过GFP融合蛋白显示目标蛋白的表达，同时利用DAPI染色验证细胞核结构（图3）。由于对C. elegans蛋白质进行免疫染色具有挑战性，大多数C. elegans蛋白的亚细胞定位研究通常采用标记蛋白（如GFP、Laz、mCherry等）进行标记18,19,20,21。在本研究中，使用gfp标记目标基因exl-1，以展示其蛋白在细胞内的定位情况。为确认蛋白的核定位，采用了DAPI染色法。本文提供了两种DAPI染色的替代方法，均可在合理的工作时间范围内（少于1小时）有效显示线虫中清晰的细胞核信号。乙醇固定法适用于小样本量的收集，例如质量观察（收集少于50条线虫）。关键在于防止线虫完全干燥；一旦95...

蛋白质亚细胞定位的改变是响应内部或外部信号（如热应激、饥饿、氧化应激、细胞凋亡、蛋白质磷酸化等）的常见机制。例如，热应激可诱导FOXO家族成员DAF-16发生核转位1,2，而促凋亡BCL-2蛋白BID在接收到死亡信号后会转位至线粒体3,4。目前已有多种技术可用于检测这些变化。结合蛋白质印迹（western blotting）与亚细胞结构（例如，线粒体或细胞核）的生化分离方法可有效实现该目的3。然而，该方法需要针对目标蛋白的特异性抗体，因此高质量且经过验证的抗体成为实验成功的关键。另一种方法是利用绿色荧光蛋白（GFP）、红色荧光蛋白（RFP）、黄色荧光蛋白（YFP）和mCherry等标记不同的亚细胞结构或细胞器，同时用其他标记物标记目标蛋白，然后通过共聚焦显微镜观察以确定其定位5,6。放射性同位素也可用于标记目标蛋白，进而检测其亚细胞定位7，但该方法需要专业培训以及对放射性废物的妥善处理。在缺乏特异性抗体、合适标记物或共聚焦显微镜等设备的情况下，需要考虑替代方案。为鉴定蛋白质的核转位，一种具有吸引力的方法是仅用标记物标记目标蛋白，并使用化学试剂4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）对细胞核进行染色，因为此方法仅需普通的荧光显微镜即可完成。
由于卵壳或包裹在线虫体表的胶原蛋白角质层通透性较低，使用抗体对 C. elegans 进行免疫标记具有较大挑战性。同时，由于 C. elegans 蛋白质与其脊椎动物同源蛋白差异显著，仅有少数商业公司提供针对 C. elegans 的特异性产品。小型实验室自行制备 C. elegans 抗体也十分困难。因此，研究者通常使用带标签的蛋白作为标记物，以展示蛋白定位或基因表达情况。本文以 EXL-1::GFP 为例，追踪在热应激条件下蛋白的核转位过程8。通过将翻译融合型 exl-1::gfp 整合至线虫基因组中，实现 gfp 融合基因的稳定表达。研究表明，exl-1 在肠道、体壁肌及其他亚细胞结构中均有表达8。本实验方案详细介绍了如何将线虫同步至第四龄幼虫（L4）阶段，进行热应激实验，并完成 DAPI 染色、乙醇固定、丙酮固定以及在常规荧光显微镜下的成像操作。

<table><tbody><tr><td>DAPI</td><td>Biotium</td><td>40043</td><td>Hoechst 33258 和 Hoechst 33342 同样适用</td></tr><tr><td>OP50</td><td>CGC</td><td>OP50</td><td>https://cgc.umn.edu/</td></tr><tr><td>秀丽隐杆线虫遗传中心（Caenorhabditis Genetics Center, CGC）</td><td></td><td></td><td>https://cgc.umn.edu/</td></tr><tr><td>Kim Wipe</td><td>Kimberly-Clark Corporation</td><td></td><td>柔软纸巾</td></tr><tr><td>Zeiss&amp;nbsp; AX10</td><td>Zeiss</td><td></td><td>荧光显微镜</td></tr><tr><td>Axiovision Rel 4.8</td><td>Zeiss</td><td></td><td>显微镜软件</td></tr><tr><td>AxioCam MR Rev3</td><td>Zeiss</td><td></td><td>数码相机</td></tr><tr><td>培养箱&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>微量离心机</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>透明指甲油凝胶</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>60 mm 培养皿</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>载玻片</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>盖玻片</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1-20 &amp;micro;L 移液器</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>20-200 &amp;micro;L 移液器</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>200-1000 &amp;micro;L 移液器</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1-200 &amp;micro;L 移液器吸头</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>200-1000 &amp;micro;L 移液器吸头</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL 微量离心管</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>铂金丝线虫挑取工具</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

通过绿色荧光蛋白标记与4',6-二脒基-2-苯基吲哚染色检测蛋白质亚细胞定位 秀丽隐杆线虫

Detecting Protein Subcellular Localization by Green Fluorescence Protein Tagging and 4',6-Diamidino-2-phenylindole Staining in Caenorhabditis elegans

在本实验方案中，通过绿色荧光蛋白（GFP）融合蛋白与4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染色来追踪蛋白质亚细胞定位的变化，特别是热应激条件下发生的核转位。蛋白质会对外部和内部信号作出相应反应，其中一种常见机制是改变其亚细胞定位。本文介绍了一种无需使用抗体、放射性标记或共聚焦显微镜即可追踪蛋白质定位的实验方法。在本研究中，使用GFP标记线虫（C. elegans）中的目标蛋白EXL-1，该蛋白属于细胞内氯离子通道蛋白（CLICs）家族，与哺乳动物的CLIC4同源。通过转化和γ射线辐照构建了包含启动子和完整基因序列的稳定整合型翻译融合exl-1::gfp转基因品系，可稳定表达该基因及gfp。近期研究表明，在热应激而非氧化应激条件下，EXL-1::GFP会在细胞核中积累。通过将GFP信号与细胞核结构以及DAPI信号进行共定位，可确认EXL-1在应激状态下的亚细胞定位变化。本方案提供了两种不同的DAPI染色固定方法：乙醇固定和丙酮固定。本文所述的DAPI染色方法快速高效，能够同时保留GFP荧光信号和蛋白质的亚细胞定位变化。该方法仅需配备微分干涉相差（Nomarski）光学系统、FITC滤光片和DAPI滤光片的荧光显微镜，适用于小型实验室、本科生科研、高中生科研以及生物技术课程教学。

氯离子细胞内通道蛋白（CLIC）是一类在不同物种间高度保守的多功能蛋白12。大量研究表明，CLIC蛋白在哺乳动物系统中可调控细胞应激、自噬、凋亡、致癌作用、血管生成以及巨噬细胞的先天免疫反应13,14,15,16,17。C. elegans 中存在两种 CLIC 同源蛋白： exl-1 和 exc-4。我们最近的研究表明，exl-1 参与调控动物的应激反应8。我们将一个翻译融合型 exl-1::gfp 构建体整合到动物基因组中，建立了稳定表达带有 GFP 标签的 <e...

本实验方案演示了如何利用绿色荧光蛋白（GFP）融合蛋白作为标记，并结合4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染色，在热应激条件下追踪蛋白质的核转位过程。DAPI染色步骤快速，且能有效保留GFP及蛋白质亚细胞定位信号。

在本方案中，采用绿色荧光蛋白（GFP）融合蛋白和4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染色来追踪蛋白质……

该方法有助于解答秀丽隐杆线虫（C.elegans）研究领域中的关键问题，例如细胞生物学问题。该技术的主要优势在于能够快速高效地同时获得细胞核染色、绿色荧光蛋白（GFP）以及亚细胞定位变化的信号。首先，构建一个包含目的基因翻译融合结构的染色体外阵列。或者，可从秀丽隐杆线虫遗传中心（Caenorhabditis Genetic Center）获取此类品系，该中心是提供 C. elegans 研究公共资源的机构；也可从先前已发表的研究实验室获得。将线虫暴露于γ射线以使染色体外阵列整合到基因组中后，筛选稳定表达的品系，使每条线虫均表达标记蛋白，例如 GFP 或 Roller 蛋白。为消除辐射过程中产生的突变，需将品系至少回交两次。利用获得的转基因品系检测在胁迫条件下蛋白质表达模式的变化。接着，按照文本方案制备NGM线虫平板，划线接种OP50克隆，并在液体LB培养基中过夜培养细菌。用液体OP50培养物接种NGM平板，并在37摄氏度培养箱中过夜培养，以形成供线虫食用的细菌菌苔。使用前将平板在室温下冷却至少30分钟。在进行热应激实验前，将转基因品系在20摄氏度条件下无饥饿培养至少两代。挑选八到十条年轻的成年线虫（带有大量卵）转移到新的线虫培养板上。让它们产卵约三到五小时，然后将所有成虫从培养板上移除。为了同步线虫发育，让卵孵化并继续培养幼虫约48小时，直至发育至第四龄幼虫（L4期）。可通过阴门（一种半月形结构）进行识别。将含有L4幼虫的培养皿置于35摄氏度下孵育2至5小时，对线虫进行热应激处理。在培养箱中放置一支温度计，以准确测量温度。用移液器吸取10微升M9缓冲液，滴加到玻璃载玻片中央。然后挑取热激后的线虫，将其转移至缓冲液滴中。或者，也可使用M9缓冲液将线虫从培养皿上冲洗下来。然后在室温下以1000 × g离心样品1分钟。弃去上清液，将线虫转移至玻片上。在体视显微镜下，用柔软的纸巾吸去多余的液体。然后，在显微镜下向线虫加入 10 微升 95% 乙醇，并继续观察。乙醇干燥后立即重复添加乙醇，共重复两次。此步骤的关键在于乙醇必须在解剖显微镜下从动物样本上完全蒸发。乙醇挥发后，立即进行下一步操作。向线虫中加入10 µL DAPI。立即加盖盖玻片，并用透明指甲油凝胶封片。待指甲油固定约10分钟后，在荧光显微镜下观察动物。如需用丙酮固定样本，先用M9缓冲液冲洗热激后的平板，然后在室温下以1000 × g离心样品1分钟。弃去上清液，用1毫升蒸馏水洗涤沉淀。去除上清液后，加入400微升30%丙酮，将样品孵育15分钟。然后在室温下以1000 × g离心1分钟。弃去上清液后，用500微升蒸馏水洗涤生物样本两次。向沉淀中加入 200 微升 DAPI，或向试管中加入总体积的线虫体积四倍量的 DAPI，样品孵育 15 分钟。离心样品并弃去上清液。然后用 500 微升蒸馏水洗涤沉淀两次，再按照之前的方法进行封片和成像。进行成像时，打开紫外光源和荧光显微镜，然后启动与显微镜连接的计算机。将玻片载入荧光显微镜。使用10倍物镜定位线虫，然后将放大倍数调至400倍，并对样本进行聚焦。接着，打开显微镜配套的软件。单击“采集”，然后单击“相机”，并选择连接到显微镜的相机。在相同的“采集”菜单下，单击“多维采集”。这将打开一个新的多维采集导航窗口。单击多通道按钮，所有可用通道将显示出来。选择蓝色、绿色和 DIC 以观察样本。在多维采集导航窗口中，保持蓝色 DAPI、绿色 GFP 和灰色 DIC 通道开启，右键单击其他通道（如红色 Rhodamine 和白色 Brightfield）以关闭它们。为测量每个通道的曝光时间，用鼠标左键单击蓝色的 DAPI 通道以选中该通道，然后单击“measure”以自动曝光时间采集实时图像。在实时图像窗口的左侧，可根据需要手动调整曝光时间，然后单击“OK”。以类似方式设置 GFP 和 DIC 通道的曝光时间。在多维采集导航窗口中，单击“Start”即可按照设定的曝光时间，依序自动采集三个不同通道下的三幅图像。要保存文件，请在主菜单中点击“文件”，然后选择“另存为”。输入文件名和文件夹路径。请将文件以默认文件格式保存，以保留详细的成像信息，供日后参考。如需以其他格式导出文件，请在“文件”菜单下点击“导出”。设置文件名和文件夹。勾选“创建项目文件夹”以更好地组织数据。从下拉菜单中选择所需的文件类型后，点击“开始”以导出。秀丽隐杆线虫中有两种氯离子细胞内通道蛋白同源物，即 exl-1 和 exc-4。最近一项研究表明，exl-1 调控动物的应激管理。本文中，将一个翻译水平的 exl-1 GFP 构建体整合到动物基因组中，并建立了稳定表达绿色荧光 exl-1 的转基因品系。在热应激条件下，exl-1 GFP 在肠区细胞核中积累，表现为强烈的 GFP 信号与细胞核重叠。为确认 exl-1 的亚细胞定位，对经乙醇和丙酮固定的动物均进行了 DAPI 染色。两种方法均清晰显示了动物体内的细胞核，且 GFP 信号与 DAPI 信号的重叠证实 exl-1 GFP 确实积累于肠区细胞核中。一旦掌握，若操作得当，该技术可在一小时内完成。观看本视频后，您应能充分理解如何快速固定以保存线虫（C.elegans）在胁迫条件下GFP信号及蛋白质的核转位。

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生物学

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学习利用绿色荧光蛋白融合标记和DAPI染色技术，在秀丽隐杆线虫中快速检测蛋白质核转位及亚细胞定位变化的高效方法。该技术可同步观察核染色与蛋白定位动态。

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