成像 C。线虫胚胎使用啶显微镜和开放源码软件

该协议演示了如何利用广泛可用的显微镜和开源软件，使用 Norky DIC 光学或荧光对早期 CL egan 胚胎中的动态事件进行成像。该协议首先描述了如何解剖 CL gans 胚胎并安装它们进行成像。然后审查 DIC 或遮罩光学元件的正确设置，以确保以最高细节获得最佳图像。

还回顾了宽视场落射荧光和照明的校准，以收集与开源软件相结合的良好荧光图像数据。良好的显微镜检查可以观察发育中的胚胎中的细胞动力学。这种方法的视觉说明至关重要，因为正确设置 D iic Optics 很困难，因为术语可能会令人困惑，并且很难以书面形式描述正确的技术。

此外，研究人员在进行荧光成像时应小心减少光照。为了限制光毒性和光漂白 为了准备胚胎进行成像，首先，制作两种安装溶液。一种是熔化的凡士林，另一种是 2% 至 3%aros 的缓冲液。

如果要成像的结构非常脆弱，可以制作更密集的 aros，小心避免沸腾。两种储备液均在微波炉中熔化，然后以 4 至 5 mL 等分试样储存。成像当天，将等分试样的凡士林溶液在 65 至 70 摄氏度的加热块中熔化，并在微波炉中熔化一份等分试样的浮出溶液。

同样，避免沸腾。然后，为了保持这些溶液熔化，将它们存放在加热块中。接下来，用一条实验室胶带覆盖两张载玻片的顶部和底部，并在两张贴有胶带的载玻片之间放置一张干净的载玻片。

现在将几滴熔融的 aros 滴到干净的载玻片上，然后用另一张干净的载玻片覆盖它。Aros 展开成一个薄的方形垫子，准备好蠕虫垫。使用解剖镜和铂丝镐将两只成虫转移到 18 x 18 毫米盖玻片上的 9 至 12 微升缓冲液中。

然后切割。用针或手术刀打开蠕虫，以释放胚胎，agarro 面朝下。将蠕虫垫放在 18 x 18 毫米的盖玻片上，并剃掉任何悬垂的琼脂。

最后，为了密封盖玻片，用油漆刷或牙签沿其周边涂抹熔融的凡士林溶液。细胞现在可以进行成像。将载玻片放在显微镜上时，确保两个偏光片彼此垂直对齐。

确保壁面和棱镜都不在光路之外。如果磁场不暗，请旋转聚光镜下方的偏振器，直到它变暗。使用 10 倍物镜找到胚胎。

在蠕虫体附近寻找年轻胚胎组，以便在成像区域内获得多个胚胎。避免将胚胎放在蠕虫内以获得最佳图像。找到最佳胚胎后，切换到更高倍率的物镜。

现在将滤镜立方体切换到 DIC。接下来，将上物镜华石棱镜插入光路，旋转聚光镜上的蛋挞，选择与物镜匹配的下华石棱镜。安装棱镜后，调整此转塔下方的滑块以匹配镜头的数值孔径。

为了获得最佳的科勒照明，请聚焦聚光镜，直到聚光镜光阑的边缘出现最清晰。最清晰的是浅黑色之间的边界最清晰或最清晰的时候。要获得最佳对比度，请通过旋转滑块上的旋钮来调整苹果壁和棱镜。

现在显微镜几乎可以使用了。现在是时候使用 micromanager 和开源软件在计算机上控制其他成像参数了。首先将 Camera gain（摄像机增益）设置为零。

然后切换到将文件保存为 8 位，而不是 16 位 tiff。TIFF 文件稍后可以通过 Image J.Next 等开源软件进行分析，将光照水平调整到最亮像素略低于饱和度水平的位置。如果一切都正确完成，图像将看起来是 3D 的，光线似乎以一定角度照射进来。

现在图像看起来很棒，选择要成像的胚胎并绘制感兴趣的区域。如果显微镜有聚焦马达，则每次使用它来收集多个焦平面。打开多维采集窗口，并通过调整聚焦旋钮设置 Z 堆栈顶部和底部平面，以找到第一个和最后一个聚焦的焦平面，其中有一些磁轭颗粒。

设置步长。这将定义收集的焦平面数。现在，设置一个足够长的时间间隔来获取所有焦平面。

最大时间点可以设置得非常高，以便软件拍摄图像直到手动停止。将软件设置为仅显示最后采集的图像，以便可以监控过程。现在为图像指定一个文件名并开始获取图像。

图像分析将在下一节的末尾简要回顾。构建 GFP 电影很像制作四个 D 或 Musky DIC，但使用了一个包含荧光碎片软件控制的配置文件。相反，在找到胚胎后，确保上部华石棱镜不在光路中，并将滤光片立方体切换到 F-I-T-C-G-F-P。

如果未自动设定此项 使用软件启动时，请确保将相机增益设为 255。图像文件设置为 16 位 tiff 格式。现在关闭透射光源并单击 Live Imaging。

调整 UV 光源的强度和曝光时间以获得良好的荧光信号信噪比，但是，将曝光保持在最低限度以保护细胞。接下来，设置时间间隔。时间点的数量和焦平面的数量现在如前所述进行图像采集。

要分析电影，请使用开源软件。安装了 micromanager 插件的图像 J 也可以使用 loci 插件将非常大的电影导入到图像 J 中。这是用 DIC 光学元件捕获的野生型胚胎。

后部在右下角，腹侧在左下角。该短片显示了每 15 秒收集一次的一系列单焦平面图像。播放设置为每秒 14 帧。

这个胚胎在第一次胚胎分裂时表达荧光，这里后面是右上角。该影片每 10 秒显示一次焦平面的变化。观看本视频后，您应该对如何使用 DIC Naski 光学元件和落射荧光对活胚胎进行成像以研究动态事件有很好的了解。

我们希望您更好地了解如何设置 DIC Nomar 光学元件以获得最佳图像，并意识到您可以使用落射荧光照明获得高质量的荧光数据，并且并不总是依赖于更先进的显微镜。您还可以应用这些成像技术来检查缺乏特定基因功能的胚胎，以进一步研究细胞分裂或发育过程中您最喜欢的事件的遗传要求。