可视化线虫角质层结构的亲脂性的重要染料，直接投资收益
January 30th, 2012
我们提出了一个可视化生活角质层的方法 C。线虫使用红色荧光亲脂性染料DII（1,1' - 双十八烷基- 3，3,3'，3' - tetramethylindocarbocyanine高氯酸盐），这是常用的 C。线虫可视化环境接触的神经元。这种优化的协议，alae和环形表皮结构是由DII染色和使用复合显微镜观察。
该程序的总体目标是使用红色荧光亲脂染料染料眼在透明的活海优雅中可视化角质层。这是通过准备用于染色的线虫群来实现的。接下来，将稀释的染料眼添加到种群中，并允许它们进行孵化。
然后从染色溶液中回收动物。Dai 染色角质层的荧光成像显示表面的细节，包括 Ailey 和 Ann 眼的生殖结构和其他外部形态特征。与现有在这种透明生物体中可视化角质层的方法（如直接成像、荧光、转基因表达、抗体染色、电子显微镜和标记的小麦胚芽凝集素）相比，该技术的主要优点是该技术易于执行，相对快速且成本低廉，并且可以在活体动物中产生美丽的表皮结构分辨率。
该方法可以帮助回答许多使用 Sea Elegance 模型系统及其角质层的领域的关键问题，如细胞分泌和角质层组织、表皮细胞发育、异性慢性基因途径、先天免疫、形态学特征的发育和线虫进化。演示该程序的是我实验室的研究生 Robbie Schultz。使用 D Eye 时，请记住它是光敏的。
始终用箔纸包裹 D 眼免受光线照射。还要戴手套和穿实验服，因为 DMF 有毒，而 DAI 是汽车。氰化物戴非常强大。
标准强度的工作稀释度为 M 9 中每毫升 DII 30 微克，单个群体只需要 400 微升的工作稀释度。从一个 60 毫米的板开始，里面装满了未受污染的线虫。用 1.5 毫升 0.5% Triton X 100 从板中清洗动物。
在 M 9 缓冲液中，以圆周运动轻轻旋转液体，以松开所有幼虫和成年动物，然后将洗涤液转移到 1.5 毫升试管中。立即以 2000 RRP M 的速度将动物旋转 30 秒，以收集管底部的动物。在不打扰动物的情况下丢弃尽可能多的上清液。
要小心，不要贪婪。用 1 毫升 M nine 清洗动物。离心并去除上清液。
重复洗涤。再次旋转并去除上清液。接下来以 400 微升每毫升 30 微克的 Dai 在 M 9 中加入试管。
短暂涡旋试管以重悬动物。然后在避光环境中以 20 摄氏度水平摇动试管 3 至 16 小时，以 350 RP M 的压力摇动试管。过去这几个步骤的时机很重要。
首先，在剥离 dai 结合的脂质之前，必须将 Triton X 洗掉。其次，必须在染料眼液中对动物进行足够长的染色，以使角质层均匀染色。稍后，应让动物在食物中恢复足够长的时间，以去除未被束缚的眼睛。
染色结束时，将动物旋转并去除染料溶液。用 1 毫升 M nine 清洗动物。要去除未结合的染料，请旋转动物并去除上清液。
将动物重新悬浮在 400 微升 M 9 缓冲液中，并将它们倒入 NGM 微孔板的无细菌部分。接种 OP 50 大肠杆菌可让动物在黑暗中恢复至少 30 分钟，但不能超过一天，因为染料荧光在恢复期间会减弱。动物应该从染料染色液中爬出来，爬到食物上。
这些动物更容易成像，因为它们来自游离染料眼的背景荧光较少。首先在载玻片上准备一个农业垫，以确保所用农业垫的厚度均匀。两个垫片。
垫片是通过在载玻片上分层两片实验室胶带制成的。垫片可以无限期使用。接下来，在两个间隔载玻片之间纵向布置一个干净的载玻片，移液约 150 微升熔融的琼脂。
到干净的载玻片的中心。用垂直放置在 AER 和两个垫片上的附加载玻片快速覆盖熔融的 AER，以形成琼脂垫。小心地滑下盖玻片，使垫片保持在安装玻片顶部的中心。
现在将 5 微升线虫麻醉剂移液到垫上，在麻醉剂中安装 8 到 12 只动物，并用显微镜盖玻片轻轻盖住。使用装有至少 40 倍物镜和 trissy 滤光片或其他兼容滤光片的复合或共聚焦显微镜观察动物。染料眼的荧光激发最大值为 549 纳米，最大发射波长为 565 纳米。
对于结合晶片成像是该协议中最具挑战性的部分。我们将展示如何安装动物进行成像，但您需要接受有关您将使用的化合物或共聚焦镜的适当培训。我们发现，使用至少放大倍数为 60 倍的物镜最能分辨染色方法照亮的细节。
本节中的每张图像都是使用 63 倍物镜拍摄的，具有海报胚胎海豹的优雅。角质层表面每年由圆周沟隔开，在某些阶段有称为 ailey 的纵向脊。本节中的每张图像都是用 63 倍物镜拍摄的，采用后胚胎 C 优雅。
角质层表面包含由圆周沟隔开的年化部分，在某些阶段是称为 aley 的纵向脊。每个发育阶段都有具有不同成分和图案的角质层结构，aley 和 Aly 荧光染色的脊或沟。取决于表面成分。
在使用这种染料静置方法的所有幼虫和成虫阶段，它们在恢复后长达一天内保持可见。有时会观察到背景荧光斑点，但并非常规。这是表现出中度角质层组织缺陷的成年突变动物的角质层。
Ailey 嵴是不连续的和多余的。Ailey 脊融合并分枝或分叉，一种常见的转基因标记物。显性滚动 6 等位基因导致角质层扭曲，这可以在副翼中看到，并可能导致环状图案不规则。
Dai 还可以对其他外部角质层结构进行染色，包括成年雌雄同体、外阴和成年雄性抬尾，fan dai 还可以突出外部形态的细微缺陷，如分叉的尾巴，染色不足。例如，两个小时的染色会导致斑片状的表皮染色，尽管暴露在环境中的神经元可能会染色 一旦掌握，这项技术可以在四个小时内完成，如果执行得当，不包括成像。看完这个视频，你应该对如何用 die eye 染色 sea elegance 以观察角质层和其他外部形态结构有一个很好的了解。
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概览
本文介绍了一种使用红色荧光亲油染料DiI来可视化活体C. elegans的表皮的方法。优化后的协议允许通过复合显微镜观察翅状和环状表皮结构。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 生物学
- 成像技术
背景
- 在透明生物体中可视化表皮对于研究形态学至关重要。
- 现有方法包括直接成像和抗体染色。
- DiI通常用于可视化C. elegans中的神经元。
- 本研究旨在改善表皮结构的可视化。
研究目的
- 开发一种简单有效的方法来染色活体C. elegans的表皮。
- 提高表皮结构成像的分辨率。
- 提供现有可视化技术的成本效益替代方案。
使用的方法
- 准备一群C. elegans进行染色。
- 线虫在稀释的DiI染料中孵育。
- 从染色溶液中恢复动物。
- 荧光成像以观察染色的表皮细节。
主要结果
- DiI染色有效地突出了翅状和环状结构。
- 荧光成像揭示了详细的表面形态学。
- 该方法快速、易于操作且具有成本效益。
- 结果表明活体动物表皮结构具有高分辨率。
结论
- 该技术比传统方法具有显著优势。
- 它允许在活体C. elegans中详细可视化表皮特征。
- 该方法可广泛应用于各种研究应用。
常见问题
Executive Industry Relevance
Visualizing cuticular structures in live C. elegans enables mechanistic de-risking of epidermal development and cuticle organization pathways. This method supports target validation by providing quantitative phenotypic readouts for genetic and pharmacological perturbations. The approach offers predictive confidence in early discovery by linking cuticle morphology to motility, innate immunity, and nematode evolution models.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses related to cuticle collagen organization and epidermal cell development.
- Operational Value: Provides a robust, reproducible assay for functional target validation in nematode-based disease models.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by linking cuticle defects to morphological traits and hetero-chronic gene pathways.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Delivers high-resolution fluorescent readouts of annuli, alae, vulva, and tail structures for compound screening.
- Operational Value: Offers a quick, inexpensive, and scalable staining protocol compatible with live-animal imaging workflows.
- Assay Readiness: Generates standardized, quantifiable morphological outputs for downstream hit validation and lead identification.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects cuticle visualization to preclinical models of innate immunity and developmental disorders.
- Mechanistic De-risking: Enables observation of cuticle defects in mutants, supporting biomarker alignment for epidermal integrity.
- Disease-Relevant System: Applicable to studies of nematode evolution and morphological trait development relevant to parasiticide screening.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing to phenotypic screening and preclinical validation, enabling iterative refinement of cuticle-modulating compounds.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification of cuticle organization and epidermal secretion through direct visualization of structural perturbations.
- Screening: Delivers assay-ready, reproducible staining with quantitative imaging outputs for compound effect assessment.
- Analytics: Provides fluorescence-based readouts of cuticle integrity, enabling statistical comparison across genetic or treatment conditions.
- Translational Research: Bridges discovery to preclinical continuity by visualizing cuticle structures linked to motility and immunity phenotypes.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging platform for longitudinal studies of cuticle dynamics across developmental stages and genetic backgrounds.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Enhances target validation confidence by reducing mechanistic ambiguity in cuticle-related pathways.
- Operational Value: Ensures standardization, reproducibility, and scalability across laboratories using a simple, cost-effective protocol.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by enabling early detection of cuticle-mediated toxicity or efficacy signals.
- Portfolio Impact: Facilitates risk-adjusted prioritization of compounds based on cuticle phenotype severity and reversibility.
Implementation Considerations
- Requires expertise in fluorescence microscopy and live-animal handling.
- Needs access to compound or confocal microscopes with appropriate filter sets (excitation 549 nm, emission 565 nm).
- Demands cross-team standardization of staining duration, washing steps, and recovery conditions to minimize variability.
- Involves adaptation considerations for different C. elegans strains and developmental stages due to varying cuticle composition.
- Includes practical limitations such as dye photobleaching during recovery and potential background fluorescence from unbound dye.
