在飞睾丸成像中心体

该程序的总体目标是使用基因标记的 Centro Somal 标记物来筛选新的基因突变并揭示新鉴定的 Centro Somal 基因的功能。这可以通过三种不同的成像策略来实现。追踪活睾丸的成像、追踪 B、睾丸的化学固定或追踪 C 免疫染色。

该程序的第一步是分离表达遗传标记的中心体蛋白的果蝇的睾丸，然后可以立即进行成像。第二步是化学固定睾丸，也可以随后进行成像。第三，睾丸可以进行免疫染色，然后成像。

最终，通过荧光显微镜鉴定 centri 蛋白的位置。这种方法可以帮助回答中心区领域中的关键问题，例如中心形成的分子基础、中心伸长和中心分离。首先分离果蝇睾丸，如 JoVE 出版物 2 6 4 1 所述。

分离睾丸后，将标本浸入带正电的玻璃显微镜载玻片上的 6 微升新鲜制备的室温 dappy 染色缓冲液中。等待 10 分钟，然后通过更换染色缓冲液两次轻轻洗去多余的 DPI。含 6 微升 PBS。

小心不要洗掉睾丸。使用一张滤纸将其吸走，将其从玻片上去除。6 μL 体积适用于 18 平方毫米的盖玻片。

现在，使用锋利的手术刀刺穿目标细胞类型附近的睾丸会有所帮助，这最大限度地减少了挤压步骤中对这些细胞的压力。然后小心地将盖玻片放在标本顶部并用指甲油密封。然后用笔在载玻片上标记睾丸的位置并继续成像。

分离睾丸后，将它们浸入带正电的玻璃显微镜载玻片顶部的 6 微升 PBS 液滴中。以线性方式或其他首选方式手动定位睾丸。然后用一张滤纸吸走 PBS，并用 6 微升新鲜制备的固定缓冲液代替。

在固定缓冲液中 5 分钟后，用一张滤纸将其吸走。现在将标本浸入 6 μL 新鲜制备的 DPI 染色缓冲液中 10 分钟。用两个 6 微升体积的 PBS 代替 DPI 以洗去 DPI。

然后小心地将 18 平方毫米的盖玻片放在标本顶部，并用指甲油密封。然后在载玻片上标记睾丸的位置并继续成像。对于此过程，首先准备一些硅化盖玻片。

首先，在通风橱下，在室温下将盖玻片浸入装有硅化溶液的小托盘中一分钟，确保盖玻片完全暴露在外，没有相互堆叠。接下来，将盖玻片在水中清洗 3 次，每次洗涤 1 分钟。然后用 70% 乙醇洗涤 3 次 1 分钟，最后用水洗涤 1 分钟。

然后让硅化盖玻片在通风橱下风干。解剖几个睾丸并用标本类型grave 载玻片后，然后将 5 微升 PBS 添加到硅化盖玻片中，并将睾丸转移到 PBS 液滴中。需要几个盖玻片，每个盖玻片都有一个睾丸以确保成功。

接下来，在解剖显微镜下，如前所述，小心地刺穿每个睾丸。现在，轻轻放置带正电的玻璃显微镜。滑过盖玻片，使 PBS 均匀分散在盖玻片和载玻片之间。

然后从盖玻片和载玻片之间吸走多余的缓冲液，这将增加对睾丸的压力并压扁它们。现在将准备好的玻片放入液氮中。现在可以准备更多玻片并将其添加到水箱中。

在继续使用大镊子之前，从液氮中取出其中一张载玻片，然后快速使用手术刀去除盖玻片。标本应留在载玻片上 同时从标本上取下盖玻片。小心不要将其涂抹在 S 载玻片的表面。

这可以通过使用手术刀快速将盖玻片折断来实现。现在将载玻片在装满甲醇的玻璃 coplan 染色罐中孵育。在零下 20 摄氏度下冷藏 15 分钟。

孵育后，将玻片转移到含有丙酮的罐子中。在丙酮中冷却 20 秒后，在零下 30 摄氏度。在室温下用 PBS 洗涤玻片一分钟。

接下来，将玻片在新鲜制备的 PBST 中孵育 10 分钟，以封闭非特异性位点 在 PBS TB 孵育期间，用水填充水分室的孔 10 分钟后，从 PBST 中取出玻片并干燥样品周围的每张玻片。小心不要干燥试样本身。当每张幻灯片干燥时。

将其放入湿度室中。在添加抗体溶液之前，必须干燥样本周围的载玻片区域。这可确保抗体保持在样本上，从而防止在孵育步骤中干燥。

然后轻轻滴入 100 μL 用新鲜制备的 P-B-S-T-B-R 稀释的一抗到样品上。对于未表征的抗体，请使用 1 比 200 的稀释度。然后将一块 1 厘米见方的多聚糖瓶放在样品顶部，以铺展抗体溶液并防止抗体溶液蒸发。

让标本在室温下孵育 1 小时。一小时后，用镊子轻轻地从载玻片上取下 Paraform。然后在室温下在 PBST 中洗涤玻片 3 次，每次洗涤 5 分钟。

然后，将载玻片转移到水分室中，样品面朝上，轻轻加入 100 微升用 PBST、BR 稀释的二抗到样品上。和以前一样，应用封口，等待一小时，在 PBST 中洗涤 3 次 5 分钟，然后在 PBS 中洗涤 3 次 5 分钟。然后小心地吸干载玻片，不要接触标本。

加入 6 微升封固剂并贴上标准盖玻片。用指甲油密封盖玻片并标记睾丸的位置后，继续进行成像。中心体在精子发生过程中经历多种形态和功能转变。

一个容易观察到的过程是精原细胞中的中心体伸长，LAR 标志物 ANA one GFP 标记该 ole 在精子发生过程中伸长的 0.6 微米长，在接近成熟的精子细胞中达到 2.5 微米的长度。由于果蝇精子的中心油具有独特的长距离，因此成像可用于对中心体伸长做出定量陈述。与野生型形态相比，已经确定了改变中心生长的各种突变。

两个例子总是早期和炮弹突变，它们在减数分裂开始之前阻止精子发生，但不阻断这些突变体中的分伸长成熟精母细胞的分油长到约 2.4 微米，而对照细胞的分油最大长度为 1.8 微米。掌握后，轨道 A 可以在 20 分钟内完成，轨道 B 可以在 30 分钟内完成，轨道 C 可以在 3 到 5 小时内完成，具体取决于样本量。看完这个视频后，你应该对如何在飞行中对中心体进行成像有了很好的了解。