观察与端粒的定量和重复序列用荧光原位杂交（FISH）与PNA探针秀丽隐杆线虫

这种荧光原位杂交技术的总体目标是简明扼要地分析秀丽隐杆线虫中的端粒数量和长度。这种方法可以帮助回答有关肿瘤再生、端粒替代性延长和细胞衰老的关键问题。该技术的主要优点是程序简洁，并且可以在不到 24 小时内可视化和量化端粒。

将妊娠成虫与少量无碎屑的液体培养基收集在 15 毫升试管中。现在按如下方式清洗蠕虫 3 次。添加 M9 缓冲液，总体积为 15 mL。

然后将试管以 300 G 离心 3 分钟，并丢弃蠕虫颗粒上方的溶液。然后重复该过程。如果离心后蠕虫漂浮，则减轻离心机上的制动器。

第三次洗涤后，让蠕虫加入 5 毫升 M9。然后加入 6.5 毫升蒸馏水、2 毫升高氯酸盐和 1 毫升 5 摩尔氢氧化钾。让蠕虫在这种漂白溶液中以 50 RPM 的搅拌孵育 3 分钟。然后涡旋蠕虫，将它们剪开并释放它们的卵。

在解剖显微镜下，寻找释放的卵子。如果它们尚未释放，请继续孵育或最多 8 分钟。如果蠕虫大部分溶解并且虫卵游离，则用 M9 填充试管至 15 毫升，并像之前清洗蠕虫一样洗涤虫卵 3 次。

对于洗净的鸡蛋，去除大部分 M9，用 PBST 填充体积至 500 微升，然后加入 500 微升 4% PFA。现在将 40 微升等分试样的 2% PFA 鸡蛋加载到聚赖氨酸包被载玻片的孔中。然后将玻片转移到加湿室中，让它们在室温下孵育 15 分钟。

对于此协议，将铝块放在 80 摄氏度的干冰上。此外，将甲醇和丙酮储存在 20 摄氏度。固定步骤完成后，从载玻片上去除大部分 PFA 溶液，留下约 5 微升。

然后将第二个聚赖氨酸包被的载玻片放在每个样品载玻片上，使两个包被的表面粘在一起，将组织捕获在孔中。如果固定剂过多，请用纸巾擦干净。现在将载玻片放在冷的铝块上至少 15 分钟以冷冻载玻片。

同时，在冰上为载玻片准备甲醇和丙酮浴。一旦载玻片被冻结，扭转一个以冻结样品。丢弃上玻片，将下玻片浸泡在冰冷的甲醇中 5 分钟。

对所有样本执行此作。冷冻裂解允许探针和抗体穿过坚硬的蛋壳。如果鸡蛋成功冷冻裂开，您可以在两张载玻片上看到鸡蛋。

在甲醇中放置至少 5 分钟后，将玻片移至冷丙酮中放置 5 分钟。再过 5 分钟，将样品在 PBST 中浸泡 3 次，每次浸泡 5 分钟。PBST 洗涤后，载玻片可以在 4 摄氏度的 100% 乙醇中储存数天。

要继续，向样品孔中加入 20 微升 RNase 溶液，并在 37 摄氏度的加湿室中孵育一小时。接下来，在 2x SSCT 中洗涤玻片两次，每次洗涤 15 分钟。两次洗涤后，向样品中加入 20 μL 杂交溶液，并在 37 摄氏度下在加湿室中孵育一小时。

同时，为双链 DNA 探针准备探针。将其在 95 摄氏度下变性 5 分钟，然后在冰上短暂冷却。一小时后，吸出杂交溶液并加入探针溶液。

从此步骤开始，保护样品免受光线照射。添加探针后，用玻璃盖玻片盖住样品。然后在 80 摄氏度的加热块上制作一个加湿室。

当加热块稳定回 80 摄氏度时，将样品玻片放入加热的腔室中，然后变性 3 分钟。然后将所有加工过的玻片在 37 摄氏度的加湿室中孵育过夜。过夜孵育后，在室温下用 PBST 洗涤样品 5 分钟。

在制备过程中，在洗涤前 1 小时将杂交溶液加热至 37 摄氏度。然后将玻片装入一罐杂交洗涤液中，并在 37 摄氏度下孵育 30 分钟。要去除杂交溶液，请在室温下用 PBST 洗涤样品 15 分钟。

执行此作 3 次。吸出最后一次 PBST 洗涤液后，向每个样品中加入 20 微升封闭溶液，并在室温下的加湿室中避光孵育 1 小时。然后吸出封闭液，用 1 比 200 的 FITC 偶联抗地高辛抗体溶液替换。

盖上载玻片并在室温下避光孵育 3 小时。抗体染色后，用 PBST 洗涤样品两次，每次在黑暗中洗涤 15 分钟。接下来吸出 PBST 并用 10 微升含有 DAPI 的安装溶液替换它。

盖上玻璃杯并吸干多余的溶液。最后，用指甲油密封盖玻片的边缘，然后继续在荧光显微镜下观察样品。使用 PNA 探针，观察到端粒足够突变存活的动物的端粒。

在性腺中，每个细胞核的端粒数量是可量化的。端粒信号与 TALT1 信号共定位，支持 TALT1 负责没有端粒的存活的观点。使用软件比较端粒信号的强度。

ALT 幸存者中的信号比用于产生端粒缺陷突变体的亲本菌株更强。不要忘记，使用多聚甲醛和甲酰胺可能非常危险，因此在执行此程序时应始终采取预防措施，例如戴手套。