使用PNA探针通过荧光原位杂交（FISH）在秀丽隐杆线虫中对端粒和重复序列进行观察与定量

该荧光原位杂交技术的总体目标是简洁地分析秀丽隐杆线虫（C. elegans）中的端粒数量和长度。该方法有助于回答有关肿瘤再生、端粒替代性延长以及细胞衰老的关键问题。该技术的主要优势在于操作步骤简洁，可在不到24小时内实现对端粒的可视化和定量分析。

用15毫升离心管收集带有少量无碎片液体培养基的成熟雌雄同体成虫。随后按以下步骤洗涤线虫三次：加入M9缓冲液至总体积为15毫升。

然后以 300 G 离心 3 分钟，弃去虫体沉淀上方的溶液。随后重复此步骤。若离心后虫体仍漂浮，可调低离心机的刹车力度。

第三次洗涤后，将线虫保留在5毫升M9溶液中。然后加入6.5毫升蒸馏水、2毫升次氯酸盐溶液和1毫升5摩尔的氢氧化钾。将线虫在此漂白液中孵育3分钟，同时以50 RPM的速度振荡。随后涡旋震荡线虫，使其破裂并释放出卵。

在解剖显微镜下观察是否有卵释放。如果卵尚未释放，继续孵育，时间不超过八分钟。如果线虫大部分已溶解且卵已游离，用M9缓冲液将管内体积补至15毫升，并像之前洗涤线虫一样，将卵洗涤三次。

向已清洗并去除大部分M9的卵中加入PBST，使体积补足至500微升，然后加入500微升4%PFA。接着将2%PFA中的卵以每份40微升分装至多聚赖氨酸包被的载玻片孔中。随后将载玻片转移至湿盒中，在室温下孵育15分钟。

进行此方案时，将一个铝块置于干冰中，并保存在负80摄氏度。同时，将甲醇和丙酮保存在负20摄氏度。固定步骤完成后，从载玻片上移除大部分PFA溶液，留下约五微升。

然后将第二张经多聚赖氨酸包被的载玻片覆盖在每张样本载玻片上，使两个包被面相互粘合，将组织固定于孔中。若存在过量固定液，可用纸巾吸除。随后将载玻片置于冰冷的铝块上，冷冻至少15分钟。

同时，将甲醇和丙酮浴置于冰上预冷，用于处理载玻片。待载玻片冷冻后，旋转其中一张载玻片以进行冰裂处理。弃去上层载玻片，将底层载玻片浸入预冷的甲醇中，冰浴5分钟。

对所有样品进行此操作。冷冻裂解可使探针和抗体穿透坚硬的卵壳。如果卵成功地发生了冷冻裂解，可在两张载玻片上均观察到卵。

在甲醇中放置至少五分钟之后，将玻片转移至冷丙酮中处理五分钟。再过五分钟，将样本在PBST中浸泡三次，每次五分钟。PBST洗涤后，可将玻片置于100%乙醇中，于4摄氏度保存数天。

接下来，向样本孔中加入 20 µL RNase 溶液，在湿润的孵育盒中于 37 °C 孵育 1 小时。随后将载玻片在 2× SSCT 中清洗两次，每次清洗 15 分钟。两次清洗后，向样本中加入 20 µL 杂交溶液，并在湿润的孵育盒中于 37 °C 孵育 1 小时。

同时，准备双链DNA探针。在95摄氏度下变性5分钟，然后短暂冰上冷却。一小时后，吸去杂交溶液，加入探针溶液。

从这一步开始，需避免样品暴露于光线下。加入探针后，用玻璃盖玻片覆盖样品。然后在80摄氏度的加热块上构建一个湿化孵育环境。

当热块温度重新稳定至 80 摄氏度后，将样本玻片放入预热的孵育 chamber 中，使其变性三分钟。随后将所有处理过的玻片置于湿润 chamber 中，在 37 摄氏度下孵育过夜。过夜孵育结束后，在室温下用 PBST 洗涤样本五分钟。

准备时，在洗涤前一小时将杂交液预热至 37 摄氏度。然后将载玻片放入装有杂交洗涤液的染色缸中，在 37 摄氏度下孵育 30 分钟。为去除杂交液，用 PBST 在室温下洗涤样本 15 分钟。

重复此操作三次。吸除最后一次 PBST 洗涤液后，向每个样本中加入 20 µL 封闭液，并在避光、室温条件下于湿化 chamber 中孵育一小时。然后吸除封闭液，替换为 1:200 稀释的 FITC 标记抗地高辛抗体溶液。

盖上盖玻片，并在避光条件下于室温孵育三小时。抗体染色后，在避光条件下用PBST洗涤样本两次，每次15分钟。随后吸除PBST，加入10 µL含DAPI的封片液。

盖上盖玻片，并吸去多余的溶液。最后用指甲油封固盖玻片边缘，然后在荧光显微镜下观察样品。使用PNA探针，观察了在端粒充足突变中存活动物的端粒。

在性腺中，每个细胞核内的端粒数量是可量化的。端粒信号与TALT1信号共定位，支持TALT1在无端粒情况下维持存活的作用。使用软件对端粒信号的强度进行了比较。

ALT 存活细胞中的信号强于用于产生端粒缺陷突变体的亲本菌株。请注意，使用多聚甲醛和甲酰胺时可能具有极高危险性，因此在进行本实验操作时，务必采取预防措施，例如佩戴手套。