白血病亚群收获：一种从二维共培养体系中空间分离白血病细胞亚群的方法

— 当白血病细胞与间充质基质细胞共培养时，它们会与基质细胞相互作用并形成三个亚群：悬浮于培养基中的游离细胞、贴附于间充质单层细胞表面的相位明亮细胞，以及位于间充质单层细胞下方的相位暗淡细胞。为分离各个亚群，取一个含有间充质基质细胞单层的组织培养板。

将存在于肿瘤特异性培养基中的种子白血病细胞接种到单层细胞上，并将培养板孵育所需的时间。接着，通过移液将自由漂浮的细胞收集到单独的离心管中以获取悬浮状态的肿瘤细胞。然后，向培养板中加入新鲜培养基，并用力吹打，使明亮相的肿瘤细胞从间充质单层表面脱落。

用移液器将这些细胞收集到一个单独的离心管中。向培养板中加入胰蛋白酶，以去除贴壁的间充质细胞。加入胎牛血清（FBS）以终止胰蛋白酶的作用，并分散细胞团块。现在，将相位暗细胞收集到一个离心管中。将含有不同细胞亚群的三个离心管分别离心，并将沉淀重悬于新鲜培养基中，用于后续分析。在接下来的实验方案中，我们将从二维共培养体系中分离悬浮的、相位亮细胞和相位暗的白血病细胞。

— 为收获悬浮的肿瘤亚群，吸出白血病细胞共培养板中的培养基，并用相同的培养基轻柔冲洗培养板一次。随后，将悬浮的白血病细胞亚群转移至15毫升锥形管中。为收获折光性强的肿瘤亚群，向共培养板中加入10毫升新鲜培养基

用力冲洗约五次，以去除贴壁的白血病细胞，同时不破坏贴壁的细胞单层。然后，将相位明亮的亚群转移至其单独的15毫升锥形管中。为了收获相位暗淡的肿瘤亚群，先用1毫升PBS冲洗去除剩余培养基，再加入3毫升胰蛋白酶于37°C条件下消化细胞使其脱落。

五分钟后，轻轻敲击培养板的侧壁以松动贴壁细胞，随后加入一毫升胎牛血清（FBS）以终止酶促反应。然后，用血清冲洗三至五次，以分散任何较大的细胞团块，并将未纯化的相位暗淡亚群转移至新的15毫升锥形管中。当所有亚群收集完毕后，离心细胞并分别将每管沉淀重悬于一毫升预热的培养基中。