测定急性髓系白血病可测残留病和白血病干细胞的骨髓标本和过程综合协议
2018年3月5日
检测微量或可测量残留疾病 (MRD) 是一种重要的预后标志物, 用于提炼风险评估和预测急性髓细胞白血病 (AML) 复发。这些全面的指导方针和建议采用最佳做法, 以一致和准确地识别和检测 MRD, 有助于作出有效的反洗钱治疗决定。
该方案的总体目标是对急性髓性白血病患者的骨髓样本进行可测量的残留病灶的准确检测，包括白血病干细胞的量化。该方法可以准确评估急性髓性白血病患者骨髓样本中可测量的残留病灶。这种方法的主要优点是，密切关注该方案可产生高度可重复、高质量的结果。
该技术的含义延伸到临床决策，因为它可以用作患者对治疗反应的读数。血液学家 Jeroen Janssen、诊断血液学实验室技术员 Gerrit Sijm 以及 MRD 团队的技术人员 Jennifer Scheick 和 Sander Snel 将演示这些程序。患者处于侧卧位，用笔标记髂后上棘，并用 0.5 至 1% 氯己定乙醇溶液以向外打圈的方式对预期活检区域的皮肤进行消毒。
局部麻醉后，拿起一根 15 号 2.8 英寸的针头，近端在手掌中，食指靠在针头尖端附近的金属轴侧面进行控制。使用轻柔但有力的压力，以快速交替的旋前旋后运动将针头穿过麻醉的皮肤朝向髂棘。当针头与髂后棘接触时，取下针头并将一个空的 10 毫升注射器连接到针头上。
轻轻抽出柱塞，在注射器内产生负压，直到收获多达 10 毫升的骨髓针状物。每次抽吸的骨髓不要超过 10 密耳，以免血液稀释。取出注射器，将 stilette 放回针头上。
然后，将大约 2 毫升骨髓喷射到手表玻璃杯中，确保抽取足够的样品以注射到肝素涂层的 8 毫升试管中，并立即倒置试管。为防止凝血，重要的是在添加骨髓后立即投资含抗凝剂的管子。为了获得最佳形态学评估，请使用塑料刮刀将针状物从手表玻璃杯中的抽吸物转移到载玻片上，然后小心地将另一个载玻片滑到骨髓顶部。
干燥后，用 May-Grunwald Giemsa 对针状体进行染色，以便通过光学显微镜进行分析。将骨髓管放入塑料支架中，然后将支架放入装有环境凝胶包和填妥的申请表的塑料容器中。在通过流式细胞术分析骨髓之前，启动流式细胞仪并打开流式细胞术分析软件，以创建一个具有前向散射与侧向散射点图的新实验。
为了评估细胞的大小和粒度，从健康供体中加载未标记的裂解外周血细胞，然后选择 Acquire Cells 功能。对淋巴细胞进行门控并调整前向和侧向散射电压，以达到门控细胞群的适当平均目标值。然后，获取至少 10， 000 个事件的数据。
要设置目标荧光通道光电倍增管电压，首先根据制造商的说明使用八峰彩虹珠校准颗粒，以低流速获取 10， 000 个事件。在前向与侧向散点图中对单重态珠子进行门控，然后在 FITC-PE 点图中对第 7 个峰进行门控。对每个荧光团的所得微珠群进行门控。
继续采集八峰彩虹珠悬浮液，并根据制造商的说明调整和微调所有荧光通道中的 PMT 电压，以达到目标 MFI 值。使用 Record 收集大约 2， 000 个事件的数据，并检查第 7 个峰珠的 MFI。接下来，加入足够体积的每种实验荧光染料偶联抗体，以对相应荧光管中的珠子进行染色，减去一个对照，并彻底涡旋管。
使用相同的补偿参数创建一个新的空白实验，注意前向散射阈值设置为 5， 000，并且所有荧光染料的补偿值为零。要创建补偿控制，请选择 Create Compensation Control（创建补偿控制）功能并加载未染色的对照管。调整单重态珠群周围的 P1 门，并确认 P1 门仅包含单重态珠。
右键单击 P1 门，然后选择 Apply to All Compensation Controls。然后，记录所有单标记荧光管的数据，确认 P2 门包含每个荧光直方图上的阳性种群。要对细胞进行染色以进行流式细胞术分析，请将骨髓运送到实验室，检查申请表以验证患者研究编号和出生日期，并确定需要染色的内容。
对于 MRD，我们使用由四根试管组成的染色板。在这里，我们展示了由一根管组成的 LSC 面板的染色。细胞计数后，将适当体积的骨髓转移到新的 15 毫升试管中。
加入 10 倍实验细胞体积的裂解缓冲液以裂解红细胞。倒置试管以混合并在室温下孵育细胞 10 分钟。在裂解期结束时，通过离心沉淀细胞。
在室温下将细胞重悬于 15 mL洗涤缓冲液中，并通过离心再次收获细胞沉淀。同时，在 5 ml FACS 管中吸取适量的抗体混合物溶液。此处显示的是干细胞管的面板。
在洗涤缓冲液中重悬沉淀，并将细胞悬液加入含有单克隆抗体混合物溶液的 FACS 管中，在黑暗中孵育 15 分钟。然后，在洗涤缓冲液中洗涤细胞并通过离心沉淀细胞。离心后，将沉淀重悬于 400 μL 新鲜洗涤缓冲液中。
要分析白血病干细胞，将 4 微升空白微珠添加到用干细胞抗体混合物染色的细胞悬液中。然后，使用先前设置的参数读取样品，从实验患者样品中获取至少 4 乘以 10 到第 6 个事件。为了确定在大约 90% 的急性髓性白血病患者中观察到的白血病相关免疫表型，如图所示适当设置爆炸门至关重要。
这里显示了在 CD34 阳性原始细胞上携带不同类型异常的个体患者的数据示例。在这些图表中，可以观察到一名仍处于完全缓解状态的患者和一名在第二周期诱导治疗后获得可测量的残留病阳性结果后复发的患者，这强调了在样本分析之前需要准确的门设置。LSC 的鉴定和定量需要对异常进行额外分析，特别是 CD34 阳性 CD38 阴性原始细胞，如下图所示。
在执行此方案时，为该程序的骨髓采样、运输、实验工作和分析步骤配备专门的后备人员非常重要。该程序还可用于进行细胞遗传学和分子分析，以回答有关特定细胞群与目标分子畸变之间相关性的其他问题，或改进患者的风险组以预测临床结果。该技术发展后，为血液学领域的研究人员探索 AML 患者治疗后的残留病灶铺平了道路。
观看此视频后，您应该对我们如何通过使用流式细胞术准确识别和量化残留病灶，包括收集和运输 AML 患者的骨髓样本。
概述
本文概述了一种用于准确测试急性髓系白血病（AML）患者骨髓样本以检测可测量残留病变（MRD）的协议。该方法强调可重复性和高质量结果，这对AML治疗的临床决策至关重要。
关键研究组成部分
科学领域
- 血液学
- 肿瘤学
- 临床诊断
背景
- MRD是AML中的一个重要预后生物标志物。
- 准确检测MRD可以改进风险评估。
- MRD检测指南可以辅助治疗决策。
- 骨髓采样对评估MRD至关重要。
研究目的
- 提供AML患者MRD检测的可靠协议。
- 量化骨髓样本中的白血病干细胞。
- 基于MRD评估增强临床决策。
所用方法
- 使用15号针进行骨髓穿刺。
- 流式细胞术用于分析细胞群。
- 细胞识别的染色程序。
- 使用特定抗体检测白血病干细胞。
主要结果
- 该协议产生高度可重复的结果。
- 可以实现MRD的准确量化。
- 流式细胞术提供细胞群的详细见解。
- 有效监测患者对治疗的反应。
结论
- 一致的MRD检测对AML管理至关重要。
- 所概述的协议可以改善治疗结果。
- 鼓励对该方法进行进一步验证。
常见问题
Executive Industry Relevance
Accurate quantification of measurable residual disease (MRD) and leukemic stem cells (LSC) in acute myeloid leukemia (AML) bone marrow samples is critical for predictive risk assessment and therapeutic decision-making in discovery and translational pipelines. Standardized, reproducible MRD and LSC measurement enables robust biomarker-driven stratification, supporting risk-adjusted portfolio advancement and reducing late-stage biological uncertainty. Harmonized protocols for bone marrow sampling and flow cytometry analysis strengthen cross-study comparability and enterprise-level data integration.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables functional validation of disease-relevant cell populations through precise MRD and LSC quantification.
- Supports mechanistic de-risking by distinguishing residual leukemic cells post-treatment.
- Facilitates predictive confidence in target engagement and pathway modulation.
Screening & Assay Development
- Provides validated flow cytometry gating strategies for reproducible detection of rare cell populations.
- Standardizes sample processing and staining panels for scalable assay deployment.
- Delivers quantitative outputs essential for downstream compound evaluation and screening readiness.
Translational & Preclinical Research
- Aligns MRD and LSC measurement with translational biomarker strategies for clinical outcome prediction.
- Enables continuity from discovery through preclinical validation by linking cellular phenotypes to molecular aberrancies.
- Supports risk-adjusted advancement decisions based on robust residual disease assessment.
Pipeline & Workflow Integration
This protocol integrates from early discovery through translational research, providing a standardized workflow for MRD and LSC quantification in AML bone marrow samples.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and biological de-risking by enabling detection of residual leukemic and stem cell populations.
- Screening: Ensures assay reproducibility and quantitative readouts through harmonized flow cytometry procedures.
- Analytics: Delivers high-fidelity measurements and gating strategies for comparative analysis across patient samples and studies.
- Translational Research: Connects cellular and molecular data to clinical risk stratification and biomarker alignment.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable, standardized protocol for MRD and LSC assessment across research programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in AML research.
- Operational Value: Promotes standardization, reproducibility, and scalability in sample processing and analysis.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and capital-efficient portfolio management.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of AML therapeutic candidates.
Implementation Considerations
- Requires specialized expertise in bone marrow sampling and multi-color flow cytometry analysis.
- Demands access to calibrated flow cytometers, validated antibody panels, and robust analytical software.
- Necessitates cross-team standardization of sample handling, gating strategies, and data interpretation.
- Adaptation may be needed for different AML subtypes or evolving immunophenotypic markers.
- Sample quality and hemodilution risk must be managed to ensure reliable MRD and LSC quantification.
