Name: 测定急性髓系白血病可测残留病和白血病干细胞的骨髓标本和过程综合协议 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-05T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 57 s
Description: 了解急性髓系白血病骨髓标本中可测残留病和白血病干细胞的检测方案。该方案采用流式细胞术和标准化采样流程，确保结果高度可重复，为临床决策提供可靠依据。

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本研究得到了荷兰癌症协会（ALPE 2013-6371）和Egbers基金会对VONK的支持。我们感谢荷兰急性髓系白血病微小残留病（AML-MRD）工作组的合作以及富有成效的讨论，这些讨论推动了AML-MRD检测的持续改进和标准化。

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</ol>

用于在多个独立研究机构验证干细胞检测管的抗体混合物由BD公司慷慨提供。作者声明本论文无任何利益冲突。

已有大量数据表明，微小残留病（MRD）阳性与较差的生存率相关，因此通过提供可用于临床决策的额外预后信息，MRD评估可能改善患者治疗结局。因此，建立一致且标准化的免疫表型MRD评估方法对于最终优化患者治疗至关重要。在比较不同临床机构之间的临床研究时，该标准化方法同样具有重要意义，并可能最终有助于临床决策，以及作为总生存期的替代临床终点。鉴于准确且一致的MRD检测亟需明确的指导原则，欧洲白血病网（European Leukemia Network, ELN）已采取协同行动，制定最先进的指南。该综合性文件将于2017年底发布，对未来众多研究团队和实验室的工作将起到关键指导作用。
方案中的关键步骤
微小残留病（MRD）分析中一个关键但常被忽视的方面是样本质量对MRD准确检测的影响。在全球性临床试验中，当样本需要被转运至其他机构时，这一问题尤为突出，因为此时需考虑更多的操作因素。为降低患者信息混淆的风险并确保样本及时送达，充分的管理至关重要。在此运输阶段，必须使用正确的表格，和/或在电子医院系统中进行录入，并明确标注所要求的检测项目。记录MRD取样时所处的治疗阶段也至关重要，因为该信息可能与临床决策相关（例如在第二疗程治疗后），因此应予以清晰定义。使用模拟数据（例如每年出生年份均设为1月1日）会增加患者或检测结果混淆的风险。若法律有要求，应采用其他匿名化的方式进行身份识别。
用于免疫表型分析的所有标本应优先在采集后24小时内进行处理。尽管不推荐，骨髓和外周血样本在室温下保存不超过72小时仍可进行处理和分析。此外，所有对标本的操作最好在无菌条件下进行，以便后续细胞可在（本地）生物样本库中冷冻保存：许多临床研究需要在后期进一步开展分子、免疫表型及功能特征等方面的分析，以深入研究白血病细胞。然而，生物样本库保存的具体细节不在本文讨论范围之内。
将微小残留病（MRD）作为诊断工具意味着需要一个经过认证的实验室，不仅用于流式细胞术，还涉及MRD评估的质量控制。这可能需要将样本分发至特定的参考实验室，或由参考团队对包含MRD检测结果的流式数据文件进行（重新）分析。
本文介绍了从骨髓穿刺液采集到临床样本中微小残留病（MRD）检测的各个关键步骤——这一过程需要一个由专家组成的团队，每位成员承担特定的任务与责任，并通过频繁沟通以实现有效的表征与分析。由于每个步骤对整个流程都至关重要，因此建议建立完善的后勤保障体系，包括各实验室均应具备标准化操作规程，以及配备经过专门培训的足够后备人员。此外，由于部分操作步骤（尤其是LAIP和LSC异常标志物的识别）具有一定的主观性，团队必须对最终结果进行讨论，并由一组主管人员共同审核并授权最终报告。目前，相关研究正致力于开发计算机软件，以推动（LAIP和LSC）MRD分析的标准化进程。
修饰与故障排除
每个实验室可以使用自己的一组抗体来定义不同的亚群，但为了获得可比较的结果，必须建立标准化的核心标志物组合，这一点在上述 ELN 关于微小残留病（MRD）检测的最新技术指南文件中已有明确说明。无论选择何种标志物，都存在一些可能使结果分析变得困难的问题，需要加以考虑。
该技术的局限性
在诊断时首先评估LAIP和LSC异常标志物的表达情况，并在治疗期间及治疗后持续监测，以准确表征微小残留病（MRD）的表型。尽管超过95%的患者可通过LAIP或LSC（或两者联合）进行评估，但仍有一些患者缺乏明确的LAIP，或不存在CD34+CD38-的LSC，或表现为CD34阴性的原始细胞，或缺少诊断时的样本。对于这些情况，仍值得尽可能使用抗体组合进行MRD检测，抗体数量应根据可获取细胞的数量达到最广泛覆盖，随后选择最可靠（能够最清晰区分白血病细胞）的LAIP。鉴于部分最终复发的患者其免疫表型与诊断时并不完全一致，这是由于急性髓系白血病（AML）具有异质性，因此建议在MRD检测时使用广泛的抗体组合。这些免疫表型变化涉及原始细胞和LSC，已被证实可在治疗过程中发生16，可检测到的疾病可能正是基于这些所谓的新兴细胞群。然而目前尚不明确所有免疫表型亚群是否均会导致疾病复发，因此在临床试验中，基于这些细胞制定个体化MRD治疗方案尚未成为常规做法。需要注意的是，采用单管法可降低因细胞群变化而遗漏LSC的风险，该方法将定义最重要异常特征的标志物集中于一个流式细胞术（PE）通道中14。
相对于现有方法的意义
本方案中所述的方法依赖于定义一个或多个在治疗过程中用于追踪细胞的白血病相关免疫表型（LAIP）。该方法的一个缺点是，最近的研究表明，LAIP可能在治疗过程中发生变化。因此，一些具有不同异常标志物的新出现细胞群体可能会被遗漏。为避免这一问题，最好检测所有异常标志物，而不仅限于诊断时发现的标志物。这种方法将类似于多个实验室所采用的“与正常细胞不同”的策略17。
未来应用
近年来，微小残留病（MRD）在新型临床试验设计中受到更多关注。在个体化治疗选择和靶向药物治疗的时代，将MRD作为结局指标可缩短确立新疗法临床有效性所需的时间，最终加快急需的治疗方案进入临床应用。由于美国食品药品监督管理局（FDA）目前正在评估将MRD作为总生存期替代终点的可行性，因此，实现标准化MRD检测的适当后勤安排与实际操作对今后急性髓系白血病（AML）治疗的成功至关重要18。

急性髓系白血病（AML）是一种骨髓恶性肿瘤，其特征是髓系前体细胞的成熟程序存在缺陷，导致异常增殖和积聚，抑制正常造血功能，并最终引发骨髓衰竭。该疾病在形态学、免疫表型、细胞遗传学、分子异常以及基因表达谱方面具有高度异质性，同时在治疗反应和治疗结局上也存在显著差异1,2。目前的治疗策略包括诱导化疗，旨在实现完全缓解（CR），随后进行缓解后治疗；后者主要依据分子、细胞遗传学和免疫表型研究的结果来制定，治疗方案包括多疗程的附加化疗或（自体或异基因）干细胞移植3。尽管强化化疗后的缓解率可高达90%，但成人患者的5年生存率仅为约30%–40%，主要原因在于疾病复发，而复发病例通常对化疗耐药，治疗极为困难。儿童患者的预后较好，但仍有约三分之一会经历复发。因此，对即将发生的复发进行早期检测将填补一项尚未满足的临床需求，并可能指导缓解后的治疗决策4。
治疗后残留病灶可能反映了所有诊断及诊断后耐药机制/因素的总和；因此，对其检测可能具有预后价值，并有助于指导治疗。目前，定义残留病灶（既往称为微小残留病灶，现称为可测量残留病灶，MRD）的灵敏度已远低于形态学标准的5%原始细胞阈值，这正在改变风险分层的格局。目前，检测MRD最常用的两种方法分别为基于流式细胞术的方法和基于分子生物学的方法，后者可通过逆转录定量PCR（RT-qPCR）5进行检测，或虽仍处于早期阶段但也可通过下一代测序（NGS）进行检测。大量针对成人和儿童的研究已表明，多种MRD检测方法在诱导治疗和巩固治疗后均能为急性髓系白血病（AML）提供强有力的预后信息6,7，一种优于形态学完全缓解（CR）的新疾病负荷定义正在逐步确立8。这提示，通过流式细胞术和/或分子生物学技术评估的MRD应成为、并且实际上正在成为AML所有临床试验中的标准指标。
本文讨论了通过流式细胞术对骨髓样本中的微小残留病（MRD）进行准确且可重复的免疫表型表征的详细操作流程，包括流式细胞术前的骨髓取样与样本处理步骤。在诊断和随访阶段获得高质量的骨髓样本，对于在不同临床机构和临床试验中成功实施该检测至关重要。事实上，这些分析前因素对于分子学方法（如PCR和NGS）检测MRD同样具有重要意义。在MRD的免疫表型表征中，通过将异常表达的标志物与正常的髓系及前体细胞标志物联合使用，以识别白血病相关免疫表型（LAIP）9。MRD反映了多种影响治疗反应的因素的综合作用，包括白血病细胞的内在或获得性耐药性、治疗药物的药效动力学与药代动力学、免疫监视功能以及患者依从性。因此，当通过受试者工作特征（ROC）曲线分析确定阈值并据此将MRD分为阳性或阴性时，MRD是一个与临床结局密切相关的强有力诊断后预后指标。在我们的HOVON 42a研究成人急性髓系白血病（AML）队列中，该阈值设定为LAIP阳性细胞占总白细胞的0.1%。采用此标准判断MRD阴性或阳性状态，可识别出一组具有显著更高复发率以及更差无复发生存率和总生存率的患者6。此外，我们还描述了对具有干细胞样特征（CD34+CD38- 白血病干细胞，即LSC）的未成熟耐药白血病细胞的检测，该指标可强有力地预测患者预后10。LAIP与LSC方法共同构成了基于流式细胞术的MRD检测策略。LAIP方法适用于约90%的患者，而LSC方法适用于约80%的患者。综合来看，超过95%的患者可至少接受其中一项参数的评估，或同时接受两项评估。
最后，本出版物提供了通过流式细胞术评估微小残留病（MRD）的详细操作说明。内容包括：1）骨髓采样程序的协调和/或标准化，2）样本运输指南，3）使用多种抗体组合通过流式细胞术（FACS）检测白血病细胞的详细描述，包括采用单管单细胞方法对白血病干细胞（LSC）进行表征，4）为实现标准化检测而进行的FACS仪器设置，5）用于MRD检测的分析程序，以及6）用于LSC检测的分析程序。
我们的目标是展示该操作的所有方面，包括样本制备，因为尽管样本制备对最终结果的质量至关重要，却很少被讨论。骨髓穿刺和骨髓活检是用于评估骨髓中造血细胞的临床操作。这些操作通常与全血细胞计数（CBC）和血涂片检查一并进行。骨髓穿刺的最佳方法对于准确诊断以及微小残留病（MRD）检测的随访至关重要。此外，一次成功的骨髓穿刺应获取足够数量的细胞，以进行LAIP和LSC流式分析（至少1000万个活细胞）。本文描述了骨髓穿刺的操作方法，并提供了相关指南，以确保获得足够的细胞样本（并尽量减少血液稀释的可能性），满足准确诊断及进一步研究的需求。这些分析前的注意事项对于分子学方法（如PCR和NGS）检测MRD同样至关重要。所有用于免疫表型分析的标本应优先在采集后24小时内处理。尽管不推荐，骨髓和外周血样本在室温下保存不超过72小时仍可进行处理和分析。此外，所有样本操作均应在无菌条件下进行，以便后续对无菌细胞进行冷冻保存，用于研究或质量评估等用途。

<table><tbody><tr><td></td><td>BD 生物科学</td><td>120995496,060996589 和 013729</td><td>FACS Canto II&amp;nbsp;</td></tr><tr><td></td><td>BD 生物科学</td><td>555360</td><td>CD7 FITC</td></tr><tr><td></td><td>DAKO</td><td>F076701</td><td>CD2 FITC</td></tr><tr><td></td><td>Sanquin</td><td>M1613</td><td>CD36 FITC</td></tr><tr><td></td><td>BD 生物科学</td><td>332778</td><td>CD15 FITC</td></tr><tr><td></td><td>BD 生物科学</td><td>335039</td><td>CD45RA FITC</td></tr><tr><td></td><td>BD 生物科学</td><td>345810</td><td>CD56 PE</td></tr><tr><td></td><td>BD 生物科学</td><td>337899</td><td>CD22 PE</td></tr><tr><td></td><td>BD 生物科学</td><td>345785</td><td>CD14 PE</td></tr><tr><td></td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-080-801</td><td>CD133 PE</td></tr><tr><td></td><td>BD 生物科学</td><td>562566</td><td>Clec12a PE</td></tr><tr><td></td><td>BD 生物科学</td><td>565568</td><td>Tim-3 PE</td></tr><tr><td></td><td>BD 生物科学</td><td>332774</td><td>CD7 PE</td></tr><tr><td></td><td>BD 生物科学</td><td>333142</td><td>CD11b PE</td></tr><tr><td></td><td>BD 生物科学</td><td>337899</td><td>CD22 PE</td></tr><tr><td></td><td>BD 生物科学</td><td>345810</td><td>CD56 PE</td></tr><tr><td></td><td>BD 生物科学</td><td>347222</td><td>CD34 PERCP-CY5.5</td></tr><tr><td></td><td>BD 生物科学</td><td>558714</td><td>CD123 PERCP-CY5.5</td></tr><tr><td></td><td>Beckman Coulter</td><td>B49221</td><td>CD117 PE-CY7</td></tr><tr><td></td><td>BD 生物科学</td><td>562854</td><td>CD33 BV421</td></tr><tr><td></td><td>BD 生物科学</td><td>345791</td><td>CD19 APC</td></tr><tr><td></td><td>BD 生物科学</td><td>333143</td><td>CD11b APC</td></tr><tr><td></td><td>BD 生物科学</td><td>345800</td><td>CD33 APC</td></tr><tr><td></td><td>BD 生物科学</td><td>345807</td><td>CD38 APC</td></tr><tr><td></td><td>BD 生物科学</td><td>641411</td><td>HLA-DR APC-H7</td></tr><tr><td></td><td>BD 生物科学</td><td>560532</td><td>CD44 APC-H7</td></tr><tr><td></td><td>BD 生物科学</td><td>562596</td><td>CD13 BV421</td></tr><tr><td></td><td>BD 生物科学</td><td>348811</td><td>CD34 PE-CY7</td></tr><tr><td></td><td>Beckman Coulter</td><td>A96416</td><td>CD45 Krome Orange</td></tr><tr><td></td><td>BD 生物科学</td><td>655873</td><td>CD45 HV500c</td></tr><tr><td></td><td>BD 生物科学</td><td>655051</td><td>CST beads&amp;nbsp;</td></tr><tr><td></td><td>BD 生物科学</td><td>555899</td><td>Pharm 溶血溶液</td></tr><tr><td></td><td>BD 生物科学</td><td>644204</td><td>多色补偿微珠</td></tr><tr><td></td><td>BD 生物科学</td><td>655051</td><td>CST beads</td></tr><tr><td></td><td>BD 生物科学</td><td></td><td>FACSDiva 软件</td></tr><tr><td></td><td>Cytognos</td><td></td><td>Infinicyt&amp;nbsp;</td></tr><tr><td></td><td>Spherotech</td><td>Euroflow RCP-30-5a</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>Türk 溶液</td></tr><tr><td></td><td>Spherotech</td><td>BCP-100-5</td><td>空白校准颗粒微珠</td></tr><tr><td>&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>HSA</td></tr><tr><td>&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>叠氮化物</td></tr><tr><td>&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>ddH2O</td></tr></tbody></table>

全面采样与处理骨髓以检测急性髓系白血病中可测量残存病灶及白血病干细胞的实验方案

Comprehensive Protocol to Sample and Process Bone Marrow for Measuring Measurable Residual Disease and Leukemic Stem Cells in Acute Myeloid Leukemia

急性髓系白血病（AML）的疗效评估标准近期已重新确立，其中形态学检查被用于判断患者是否达到完全缓解（CR）。大约一半进入完全缓解的成年患者会在12个月内复发，原因是骨髓中残留的AML细胞重新增殖。对这些残存白血病细胞的定量，即所谓的微小残留病或可测量残留病（MRD），可作为预测复发的强有力生物标志物。此外，多项研究的回顾性分析表明，AML患者骨髓中存在MRD与较差的生存率相关。不仅反映携带白血病相关免疫表型（LAIP）细胞的总体白血病细胞群与临床预后相关，而且白血病干细胞（LSC）这一不成熟且频率较低的亚群也与预后相关，这两类细胞均可通过流式细胞术MRD或类似MRD的方法进行监测。基于疾病特异性或疾病相关特征（异常分子标志物或异常免疫表型）来检测残留白血病（干细胞）的高灵敏度检测方法的出现，已极大改善了AML中MRD的评估。然而，鉴于AML本身具有内在的异质性和复杂性，在可能的情况下，骨髓取样及MRD和LSC分析的方法应尽可能实现标准化。本文中，我们描述了一套详细的方法，涵盖合格的骨髓穿刺抽吸取样、样本运输、样本处理以优化多色流式细胞术检测，以及用于评估MRD和LSC的设门策略，以辅助AML患者的治疗决策。

在90%的急性髓系白血病（AML）患者中，至少可以识别出一种白血病相关免疫表型（LAIP）。为了在诊断时准确计算原始髓系母细胞中LAIP阳性细胞的比例，正确设定母细胞门（blast gate）至关重要，其设置需经验证，如图所示。 图3每例患者在CD34+原始细胞中携带特定类型异常的示例见下图 图5. 在随访期间进行微小残留病（MRD）检测时，需对先前定义的LAIP+细胞设门，并计算其占白细胞（WBC）总数的百分比。因此，该设门的准确性对获得正确的MRD结果至关重要。 图6 显示一位在第二次诱导治疗周期后微小残留病灶（MRD）阳性（≥ 0.1%）但仍处于完全缓解的患者，以及一位在相同情况下出现复发的患者。
目前的方案仅适用于在 CD34+ 细胞中定义干细胞，因为对该细胞群的全面表征表明，CD38- 群体含有最具潜能的干细胞样细胞组分。为了在此组分中进一步区分白血病干细胞（LSC）与正常造血干细胞（HSC），需使用额外的标记物。最常用于区分 LSC 的标记物是 CD45RA 以及一个包含 6 种特异性 LSC 标记物并用 PE 标记的组合通道。根据进一步的临床评估，将 ≥ 0.004% 定义为 LSC 阳性阈值，该水平在诊断时与较差的生存率相关；而在随访时则采用 0.0001% 作为阈值10。
<img alt="细胞形态，用于组织病理学分析的染色细胞显微镜图像，比例尺为10µm。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56386/56386fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图1"> 
图1： 骨髓涂片。 A）健康供者和B）急性髓系白血病患者（FAB 5亚型）。显示为100倍放大下的吉姆萨染色结果。 <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56386/56386fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="生物样本包装示意图；层次包括外包装、冰袋、初级容器。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56386/56386fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图2"> 
图2：生物液体的正确包装材料。 有关生物液体运输规则与法规的更多详情，请参见美国疾病控制与预防中心网站15。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56386/56386fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看本图的放大版本。</a>
<img alt="CD45 PerCP 和 CD34 APC 的流式细胞术结果；细胞群体的散点图分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56386/56386fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 3"> 
图 3：定义原始细胞的设门策略。 A) 设门 CD45dim，B) 设门 CD34+ 原始细胞。
<img alt="流式细胞术散点图 A-E 分析细胞群体、白细胞鉴定及 CD 标记物。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56386/56386fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 4"> 
图 4：淋巴细胞设门。 A）蓝色细胞为FSC/SSC图中显示的白细胞，B）绿色细胞为具有CD45high/SSClow特征的淋巴细胞，C）CD34阴性表达示例，D）CD117阴性表达示例，E）CD13阴性表达示例，F）不同细胞类型的总体群体树状图。 <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56386/56386fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="流式细胞术散点图用于细胞表面标志物分析；显示 CD34、CD33 标志物的示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56386/56386fig5.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Figure 5"> 
图 5：急性髓系白血病（AML）诊断时的白血病相关免疫表型（LAIPs）。 A) 基于跨谱系异常（CD33 表达细胞上出现 CD7）的 LAIP；B) 基于异步分化（CD13 表达细胞上出现 CD11b）的 LAIP；C) 基于相对于正常细胞过表达（CD13 表达细胞上 CD34极强表达）的 LAIP；D) 基于相对于正常细胞低表达（CD33 表达细胞上 HLA-DR低表达）的 LAIP。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56386/56386fig5large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
<img alt="显示原始细胞分析、CD标志物、诊断及随访结果的流式细胞术散点图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56386/56386fig6.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Figure 6"> 
图6：治疗过程中监测的LAIP变化。 A) 诊断时定义的LAIP（CD34+/CD13+/CD33-），以及在持续完全缓解患者随访期间LAIP的消失；B) 诊断时定义的LAIP（CD117+/CD7+/CD33+），以及在复发患者随访期间LAIP的持续存在。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56386/56386fig6large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="显示CD34/CD38细胞群体的流式细胞术图；使用CD45RA FITC进行生物标志物分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56386/56386fig7.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图7"> 
图7：干细胞设门策略。 A) 基于微球对不同CD34+/CD38细胞群进行设门（CD38low位于微球上边界的下方，而CD38very low定义为真正的阴性细胞，代表白血病干细胞（LSC），位于微球中位值的下方）；B) 两名患者在随访期间基于CD45RAneg和CD45RApos表达区分造血干细胞（HSC）与白血病干细胞（LSC）的两个示例。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56386/56386fig7large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
补充文件 1. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56386/Sampling_Form_MRD_1.pdf" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
补充文件 2. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56386/Sampling_Form_MRD_2.pdf" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
补充文件 3。 <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56386/Supplementary_information_revised_Cloos_et_al.zip" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>

检测微小残留病（MRD）是急性髓系白血病（AML）中用于优化风险评估和预测复发的重要预后生物标志物。这些关于MRD一致且准确识别与检测的最佳实践指南和建议，可有助于制定有效的AML治疗决策。

急性髓系白血病（AML）的疗效标准 recently been re-established, with morphologic examination utilized to determine whether patients ...

本方案的总体目标是对急性髓系白血病患者的骨髓样本进行可测量残留病（MRD）的准确检测，包括白血病干细胞的定量分析。该方法可对急性髓系白血病患者骨髓样本中的可测量残留病提供准确评估。该方法的主要优势在于，严格遵循本方案可获得高度可重复且高质量的结果。该技术的应用意义延伸至临床决策，因为它可作为评估患者对治疗反应的读数。演示该操作流程的人员包括血液科医生耶罗恩·扬森（Jeroen Janssen）、诊断血液学实验室技术员格尔特·赛姆（Gerrit Sijm），以及微小残留病（MRD）团队的技术员詹妮弗·舍克（Jennifer Scheick）和桑德·斯内尔（Sander Snel）。让患者取侧卧位，用笔标记出髂后上棘，然后用含0.5%至1%氯己定的乙醇溶液以由内向外的环形方式对预定活检区域的皮肤进行消毒。局部麻醉后，用手掌握住一支15号、2.8英寸长的针头，将示指抵住针尖附近金属针杆的一侧以控制方向。通过轻柔但稳定的压力，以快速交替的旋前-旋后动作将针头穿过已麻醉的皮肤，朝向髂嵴进针。当针头接触到后髂嵴时，取出针芯，并将一个空的10毫升注射器连接到针头上。轻轻回抽活塞，在注射器内形成负压，直至采集到最多10毫升的骨髓组织碎片。每次抽吸采集的骨髓量不应超过10毫升，以避免血液稀释。取下注射器，并将针芯重新插入穿刺针中。然后，将约两毫升骨髓推出至表面皿中，并确保抽取足够的样本注入一支肝素包被的八毫升试管中，立即轻轻颠倒混匀试管。为防止凝血，骨髓加入后应尽快充分混匀含抗凝剂的试管。为获得最佳形态学评估效果，使用塑料刮刀将表面皿中骨髓穿刺物中的骨髓小粒转移至载玻片上，再小心地将另一张载玻片覆盖在骨髓样本上并轻轻推移。 干燥后，使用 May-Grunwald Giemsa 染色骨针，以便通过光学显微镜进行分析。将骨髓样本管放入塑料支架中，并将支架置于含有常温凝胶包和已填写完毕的申请表的塑料容器内。在通过流式细胞术分析骨髓之前，启动流式细胞仪并打开流式细胞分析软件，创建一个新的实验，设置前向散射光对侧向散射光的散点图。为了评估细胞的大小和颗粒度，加载来自健康供体的未标记裂解外周血细胞，并选择“采集细胞”功能。圈选淋巴细胞，并调整前向散射和侧向散射电压，使门控细胞群体达到适当的平均目标值。然后，至少采集10,000个事件的数据。为了设置目标荧光通道的光电倍增管电压，首先根据制造商的说明使用八峰彩虹校准微球，在低流速下采集10,000个事件。在前向散射与侧向散射点图中圈选单一群微球，随后在FITC-PE点图中圈选第7峰。针对每种荧光染料，圈选相应的微球群体。继续采集八峰彩虹微球悬液，并根据制造商的说明，调整并精细调节所有荧光通道的光电倍增管（PMT）电压，以达到目标的平均荧光强度（MFI）值。使用“记录”功能收集约 2,000 个事件的数据，并检查第 7 峰微球的 MFI 值。随后，向各实验用荧光染料偶联抗体中加入足够体积，用于染色相应荧光管中的微球（除一个对照管外），并充分涡旋混匀各管。创建一个新的空白实验，使用相同的补偿参数，并确保前向散射阈值设置为 5,000，且所有荧光染料的补偿值均为零。为创建补偿对照，选择“创建补偿对照”功能并加载未染色对照管。调整 P1 门以圈选单一群微球细胞群，并确认 P1 门内仅包含单一群微球。右键单击 P1 门，然后选择“应用于所有补偿对照”。接着，记录所有单标记荧光管的数据，确认 P2 门在每张荧光直方图上均包含阳性细胞群。为进行流式细胞术分析而染色细胞时，将骨髓样本运送至实验室，核对申请单以确认患者的研究所编号和出生日期，并确定需要染色的项目。对于微小残留病（MRD）检测，我们使用包含四个试管的染色组合。此处我们演示由一个试管组成的LSC组合的染色过程。细胞计数后，将适量的骨髓样本转移至新的15毫升离心管中。加入裂解缓冲液，体积为实验细胞体积的10倍，以裂解红细胞。倒置离心管混匀，室温孵育10分钟。裂解结束后，通过离心收集细胞沉淀。将细胞在室温下重悬于15毫升洗涤缓冲液中，然后通过离心再次收集细胞沉淀。同时，将适量的抗体混合溶液加入5毫升FACS管中。此处显示的是干细胞管的检测方案。将沉淀重悬于洗涤缓冲液中，并将细胞悬液加入含有单克隆抗体混合溶液的FACS管中，避光孵育15分钟。然后用洗涤缓冲液洗涤细胞，并通过离心收集细胞沉淀。离心后，将沉淀重悬于400 µL新鲜洗涤缓冲液中。为了分析白血病干细胞，向已用干细胞抗体混合物染色的细胞悬液中加入四微升空白微珠。然后，使用先前设定的参数读取样本，从实验患者样本中至少获取四次10的6次方个事件。为了鉴定在约90%的急性髓系白血病患者中观察到的白血病相关免疫表型，必须正确设置原始细胞门，如图所示。此处展示了携带不同类型CD34阳性原始细胞异常的个体患者的检测数据示例。在这些图表中，可以观察到一名持续处于完全缓解状态的患者，以及一名在诱导治疗第二个疗程后出现可测量残留病（MRD）阳性结果并随后复发的患者，这凸显了在样本分析前准确设门的重要性。对白血病干细胞（LSC）的鉴定与定量，需要进一步针对CD34阳性CD38阴性原始细胞上的特异性异常进行额外分析，如图中所示。在执行本方案时，骨髓取样、运输、实验操作及分析步骤均需配备专业人员及后备人员，这一点至关重要。该方法还可用于进行细胞遗传学和分子学分析，以探讨特定细胞群与目标分子异常之间的相关性，或进一步明确患者的危险分层，从而预测其临床预后。该技术建立后，为血液学领域的研究人员探索急性髓系白血病（AML）患者治疗后的微小残留病提供了重要途径。观看本视频后，您应能够充分理解如何利用流式细胞术准确识别和定量残留病灶，包括急性髓系白血病（AML）患者骨髓样本的采集与运输。

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Research

科研

JoVE Journal

Cancer Research

癌症研究

测定急性髓系白血病可测残留病和白血病干细胞的骨髓标本和过程综合协议

本视频介绍了从髂嵴抽取骨髓以及制备涂片进行活检的技术。在示例中，我们对一名急性髓系白血病（AML）患者进行骨髓穿刺抽吸，并检查细胞以检测可测量残留病（MRD），后者是一种重要的预后生物标志物。...

骨髓穿刺：一种用于获取骨髓以检查细胞形态学的方法

我们概述了一种通过流式细胞术检测原代急性髓系白血病细胞上白血病干细胞标志物共表达的实验方案。我们展示了如何定量分析三种具有不同程度成熟特征的前体细胞群以及一个假定的白血病干细胞（LSC）群体。我们已在相应的患者来源异种移植模型中证实了这些细胞群的存在。...

通过流式细胞术在初诊及随访时评估原发性急性髓系白血病和患者来源异种移植模型中的白血病干细胞

本文提供了一种详细的实验方案，用于从小鼠模型中分离和表征骨髓增生异常综合征及急性髓系白血病的骨髓微环境细胞群体。该技术可识别疾病进展过程中非造血性骨髓微环境（包括内皮细胞和间充质基质细胞）的变化。...

识别骨髓增生异常综合征和急性髓系白血病中的骨髓微环境细胞群

本文描述了一种基于磷酸化流式细胞术的方法，用于分析移植到小鼠体内并从骨髓穿刺液中获取的人急性髓系白血病细胞中 mTORC1、JAK/STAT5 和 MAPK 信号通路下游的信号传导。利用新一代光谱流式细胞仪，可同时高灵敏度地检测 p-STAT5、p-4EBP1、p-RPS6 和 p-ERK1/2...

急性髓系白血病患者来源异种移植模型的细胞内磷酸流式细胞术

该方案旨在描述一种基于诱导化疗反应动力学的小鼠急性淋巴细胞白血病复发模型。...

急性淋巴细胞白血病诱导化疗后白血病复发的小鼠模型

本方案描述了一种快速处理死后弥散性内生型桥脑胶质瘤样本的方法，用于建立患者来源的细胞培养模型，或直接对肿瘤细胞及微环境细胞进行表征。...

一种快速进行弥漫性内生型桥脑胶质瘤（DIPG）死后细胞培养的方案

本方案描述了使用离心淘析法将原代急性淋巴细胞白血病细胞按不同细胞周期时相进行分离的方法。...

通过离心淘析法分离处于不同细胞周期阶段的原代急性淋巴细胞白血病细胞

本方案描述了一种倒置垂直侵袭实验方法，可用于在三维环境中定量评估细胞的迁移和侵袭能力，同时保持细胞微环境的完整性。该实验适用于稀有和/或敏感细胞。...

向上迁移：一种简单灵活的体外三维侵袭实验方案

利用颅骨共培养与组织形态计量学测量骨重塑并重建肿瘤-骨微环境

我们描述了一种利用多参数流式细胞术检测小鼠健康造血干细胞和祖细胞（HSPCs）以及由MLL-AF9驱动的急性髓系白血病（AML）小鼠模型中白血病细胞线粒体活性氧（ROS）的方法。...

小鼠造血干细胞与祖细胞及MLL-AF9驱动型白血病中线粒体活性氧的流式细胞术分析

了解急性髓系白血病骨髓标本中可测残留病和白血病干细胞的检测方案。该方案采用流式细胞术和标准化采样流程，确保结果高度可重复，为临床决策提供可靠依据。

全面采样与处理骨髓以检测急性髓系白血病中可测量残存病灶及白血病干细胞的实验方案

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