基于CUBIC的蛋白质表达可视化：一种用于全层小鼠皮肤活检样本中蛋白质表达可视化的方法

— 皮肤是一种复杂的器官，由多种细胞群体组成，并排列成多层结构。CUBIC 是一种基于组织透明化的三维成像技术，可通过完整的皮肤活检样本实现对皮肤细胞内蛋白质表达模式的可视化观察。首先取一只已处死的小鼠，去除其背部颈部区域的毛发，然后切除一块皮肤并将其切成小片。

将组织块浸入CUBIC1透明化溶液中并进行孵育。由于皮肤细胞含有导致光散射的发色团和脂质，因而不透明。CUBIC溶液中的化学成分可去除这些分子，从而减少光散射，使组织变得透明。

接下来，使用特异性结合皮肤细胞中表达的靶向胞内蛋白的所需一抗处理组织。随后，使用荧光标记的二抗处理组织，该二抗可结合蛋白-一抗复合物。用一种可标记细胞核的DNA结合染料对组织进行复染。

最后，将样本浸入CUBIC2溶液中。该溶液可进一步减少组织内的光散射，使其更透明，便于成像。在共聚焦显微镜下观察，以可视化三维样本中荧光标记的目标区域。以下方案可用于通过CUBIC法对皮肤全层活检样本中角质形成细胞增殖标志物的表达进行可视化。

— 首先使用修毛器剃除已安乐死小鼠颈部的毛发，注意避免损伤皮肤。然后用 PBS 中的 70% 乙醇对皮肤进行去污处理。接着用镊子提起背部颈部皮肤，并用剪刀剪下约 1.5 × 4 厘米的背部皮肤组织。随后将皮肤展平，真皮面朝下，置于一张滤纸上，注意标记样本的前后方向，并沿分离的皮肤边缘修剪滤纸。

为了获得最佳成像效果，皮肤样本需保持平整，并确保毛囊方向一致。为维持样本正确的前后位置，我们将矩形活检的皮肤组织固定在滤纸上。

— 将样品转移至含有新配制的4% PFA（溶于PBS）的15毫升离心管中。待样品在滤纸上牢固固定后，将标本转移至新的15毫升离心管中，用PBS洗涤两次，每次5分钟。

第二次清洗后，使用锋利的剃须刀片将皮肤活检组织切成约 0.2 × 0.5 厘米的组织块，注意样品的较长边应沿样品的前后方向切割。

— 沿毛囊走向平行地切割活检样本的较长一侧，也有助于避免毛囊受到严重损伤。

— 然后，将活检组织置于新标记的15毫升离心管中，加入5毫升新配制的CUBIC1透明化溶液，完全浸没组织，并将离心管置于37摄氏度的杂交炉内的旋转平台上。待组织块变得透明后，用4毫升磷酸盐缓冲液（PBS）在37摄氏度下进行四次洗涤，每次6小时；随后在37摄氏度下用含20%（质量/体积）蔗糖的PBS溶液洗涤4小时。

孵育结束后，将每个样品在最佳切割温度包埋剂中冷冻，分别置于15毫升离心管中，在-80摄氏度下过夜，以增强组织对抗体渗透的通透性。

第二天早晨，使用相应的抗体和感兴趣的活体染料对皮肤样本进行染色。然后，将样本置于2毫升离心管中，加入1毫升新配制的CUBIC2透明化溶液，在37°C的摇床培养箱中孵育24小时，以均衡组织的折射率。

当组织变得透明后，将活检样本沿单个玻璃盖玻片的长边放置，使毛囊的生长方向与盖玻片表面平行。在组织上滴加一滴 CUBIC2 溶液。在盖玻片上放置两条尺寸为 1 毫米 × 2 厘米的蓝色橡皮泥条。然后，用第二个盖玻片覆盖住活检样本。

接下来，将成像室放置在共聚焦显微镜载物台上，并将组织移入光路中。使用适当的光源和标准的落射荧光滤光片，扫描样品以识别荧光标记的目标区域。然后，采集目标区域的荧光共聚焦图像。