CUBIC协议可视化在全山皮肤配方单细胞分辨率蛋白表达
August 4th, 2016
这份报告描述了三次协议，以澄清全层小鼠皮肤活检，并在3D单细胞分辨率的可视化表达方式，增殖细胞，皮脂腺细胞和。这种方法使皮肤的解剖学和病理学的准确评估，并在转基因小鼠品系的表皮异常表型。
该程序的总体目标是在三维中可视化单细胞水平的细胞增殖和蛋白质表达模式，并准确评估皮肤的解剖结构和病理学。这种方法可以帮助回答有关细胞和分子机制如何控制表皮发育和再生以及这些机制在皮肤病期间如何受到干扰的关键问题。该技术的主要优点是，它是一种技术简单的方案，可以以前所未有的准确性在三维环境中可视化全层皮肤活检中的单个细胞。
该方法还有助于研究完整皮肤样本中表皮和真皮之间的相互作用。一般来说，刚接触这种方法的研究人员在准备小的扁平皮肤活检而不损坏毛囊时可能会遇到一些困难。演示该程序的是澳大利亚新南威尔士大学发育和再生皮肤病学部门的博士生 Betty Maclarios。
首先使用修剪器剃掉安乐死小鼠脖子上的毛发，注意不要伤到皮肤。然后用 70% 乙醇和 PBS 净化皮肤。接下来，用镊子提起颈部背侧皮肤，用剪刀去除大约 1.5 x 4 厘米的小鼠背侧皮肤区域。
然后将皮肤真皮面朝下放在一张滤纸上，记下样品的前后方向，并在解剖的皮肤周围修剪纸。为了获得最佳成像效果，皮肤样本需要保持平坦，毛囊方向一致。为了将样本保持在适当的前后位置，我们在矩形活检中将皮肤块固定在滤纸上。
将样品转移至装有新鲜制备的 4% PFA 和 PBS 的 15 mL 试管中。然后，当它们牢固地固定在滤纸上时，将样品转移到新的 15 mL PBS 管中，进行两次 5 分钟的洗涤。为了清除皮肤活检，在第二次洗涤后，使用锋利的剃须刀片将组织切成大约 0.2 x 0.5 厘米的块，同时注意沿样品的前后方向切割样品的较长边。
沿着平行于毛囊方向的活检侧面切割也有助于避免大面积的毛囊损伤。他们将活检细胞浸入 5 mL 新鲜制备的立方一清除溶液中，放入新的 15 mL 试管中，然后将试管放在 37 摄氏度杂交炉中的旋转平台上。组织块透明后，在 4 mL PBS 中洗涤活检 4 次，在 37 摄氏度下洗涤 6 小时，然后在 37 摄氏度下以 20% 重量的蔗糖和 PBS 洗涤 4 小时。
孵育结束时，将每个样品在最佳切割温度化合物中单独 15 mL 试管中在 80 摄氏度下冷冻过夜，以增加组织对抗体渗透的渗透性。第二天早上，用适当的抗体和感兴趣的活性染料对皮肤样品进行染色。然后将标本在 1 mL 新鲜制备的立方 2 级透明溶液中放入 2 mL 试管中，在 37 摄氏度的烘箱中在 37 °C 烘箱中孵育 24 小时，以使组织的折射率均匀。
当组织清晰时，将活检沿单个玻璃盖玻片的较长一侧定位，使毛囊生长的方向平行于盖玻片表面。将一滴立方二溶液滴在纸巾上。将两条 1 mL x 2 cm 的蓝色粘性条放在盖玻片上，然后用第二张盖玻片盖住活检。
接下来，将成像室放在共聚焦显微镜载物台上，并将组织移动到光路中。使用适当的光源和标准落射荧光滤光片，扫描样品以识别感兴趣的荧光染色区域，然后获取感兴趣区域的荧光共聚焦图像。使用这种方法，可以澄清成年野生型小鼠的厚度背皮活检，并用针对基底角质形成细胞标志物角蛋白 14 的抗体染色。
在整个样本中都可以看到 dappy 阳性细胞核，可以欣赏一些解剖学特征，例如真皮。K14 染色在滤泡间表皮的单细胞厚基底层中很明显。勾勒出毛囊的皮脂腺和外根鞘以及次生毛病菌，在毛囊的凸起区域仅检测到低水平的 K14 表达。
为了观察增殖细胞，可以澄清和染色成年野生型小鼠休止期的全层背侧皮肤活检，如图所示，揭示了在基底毛囊间表皮和峡部存在增殖的角质形成细胞，而不是毛囊的凸起区域。为了观察皮脂腺，可以澄清和染色成年野生型小鼠抗原的全层背侧皮肤活检，有助于检测毛囊峡部区域的皮脂腺。为了可视化表皮和转基因动物的形态变化，可以澄清和染色全层背侧皮肤活检，揭示毛囊间表皮增生和异常毛囊，K14 标记的细胞团向近端延伸到真皮中，代表扩大的转基因干细胞群。
观看此视频后，我们应该对如何制备和澄清皮肤样品以及在三维单细胞分辨率下可视化蛋白质表达模式有很好的了解。这种方法执行简单，并且使用相对安全且便宜的试剂。将来，将测试更多抗体与该方法的兼容性，从而扩展该分析以可视化更多蛋白质和某些类型的目标。
可以执行其他成像方法，例如光片显微镜，以在三维空间中可视化较大皮肤样本的皮肤解剖结构和蛋白质表达模式。开发后，这项技术将为皮肤病学领域的研究人员铺平道路，以探索皮肤稳态、转基因小鼠模型和我们的皮肤病模型之一中真皮和表皮之间的细胞和分子相互作用。
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概述
本报告描述了一种CUBIC协议，用于阐明小鼠全层皮肤活检，实现对蛋白质表达模式和增殖细胞在3D中单细胞分辨率的可视化。该方法有助于准确评估皮肤解剖和病理，特别是在基因改造的小鼠系中。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 皮肤病学
- 细胞生物学
背景
- 了解表皮发育的细胞和分子机制。
- 调查皮肤疾病和再生过程。
- 准确皮肤活检分析的重要性。
- 在不损害毛囊的情况下准备皮肤样本的挑战。
研究目的
- 在3D中可视化细胞增殖和蛋白质表达。
- 准确评估皮肤解剖和病理。
- 探索表皮和真皮之间的相互作用。
使用的方法
- 用于组织阐明的CUBIC协议。
- 3D可视化技术。
- 单细胞分辨率分析。
- 来自小鼠模型的全层皮肤活检。
主要结果
- 成功可视化皮肤活检中的单个细胞。
- 增强对蛋白质表达模式的理解。
- 洞察异常表皮表型。
- 促进皮肤疾病研究。
结论
- CUBIC协议是一种简单而有效的皮肤分析方法。
- 它在可视化皮肤细胞相互作用方面提供了前所未有的准确性。
- 这种技术可以推进皮肤病学和再生医学的研究。
常见问题
Executive Industry Relevance
The CUBIC protocol enables high-resolution 3D visualization of protein expression and cellular dynamics in full-thickness skin biopsies, supporting mechanistic de-risking in dermatology target validation. By providing single-cell resolution data on epidermal stem/progenitor populations and their interactions with the dermis, the method enhances predictive confidence in preclinical models of skin regeneration and disease. This capability aids in prioritizing therapeutic hypotheses and reducing biological ambiguity in early discovery pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by visualizing K14-expressing basal epidermal stem/progenitor cell dynamics in intact tissue architecture.
- Scientific Value: Supports functional target validation through spatial mapping of proliferation (Ki67) and sebocyte differentiation (Nile Red) in genetically modified models.
- Operational Value: Facilitates biological de-risking by quantifying abnormal epidermal phenotypes and stromal interactions in 3D without sectioning artifacts.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream assay standardization by preserving epidermal-dermal architecture and appendage integrity.
- Operational Value: Enables reproducible quantitative outputs for protein expression and cell proliferation across conditions, supporting assay scalability.
- Strategic Value: Enhances screening readiness by providing a clear, intact tissue platform for reliable compound or genetic perturbation evaluation.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Maintains disease-relevant system integrity by visualizing hyperplasia, abnormal follicle morphology, and stem cell mass expansion in transgenic models.
- Operational Value: Supports translational biomarker alignment through correlative analysis of K14, Ki67, and sebocyte markers with phenotypic outcomes.
- Strategic Value: Informs risk-adjusted advancement decisions by providing mechanistic insights into epidermal-dermal crosstalk during homeostasis and perturbation.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from target hypothesis testing through preclinical validation, enabling iterative assessment of skin-specific biological responses.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by resolving spatial expression patterns of keratinocytes, proliferating cells, and sebocytes in intact skin.
- Screening: Delivers assay readiness and reproducibility through standardized clearing and staining of full-thickness biopsies with consistent follicle orientation.
- Analytics: Generates quantitative 3D readouts on protein expression and cell density that enable cross-condition comparison and target ranking.
- Translational Research: Connects discovery to preclinical continuity by preserving disease-relevant epidermal and dermal structures for longitudinal analysis.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable tissue processing platform applicable across wild-type, mutant, and treatment-induced skin models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in epidermal regeneration pathways.
- Operational Value: Ensures standardization and reproducibility through a simple, solvent-based clearing protocol compatible with conventional confocal microscopy.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by enabling early detection of on-target and off-target epidermal effects in preclinical models.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by providing mechanistic data on stem cell dynamics and sebaceous gland function in disease-relevant contexts.
Implementation Considerations
- Requires expertise in tissue handling and immunofluorescence staining to preserve epidermal appendages during biopsy preparation.
- Depends on access to a hybridization oven, rotating platform, and confocal microscope with standard epifluorescence filters for 3D imaging.
- Necessitates cross-team standardization of biopsy orientation and clearing duration to ensure consistent refractive index matching and imaging quality.
- Involves adaptation considerations when applying the protocol to thicker human skin explants or alternative mammalian models due to lipid and collagen content.
- Involves practical limitations related to the duration of clearing and washing steps, which may extend timelines for high-throughput screening applications.
