CUBIC协议可视化在全山皮肤配方单细胞分辨率蛋白表达

该程序的总体目标是在三维中可视化单细胞水平的细胞增殖和蛋白质表达模式，并准确评估皮肤的解剖结构和病理学。这种方法可以帮助回答有关细胞和分子机制如何控制表皮发育和再生以及这些机制在皮肤病期间如何受到干扰的关键问题。该技术的主要优点是，它是一种技术简单的方案，可以以前所未有的准确性在三维环境中可视化全层皮肤活检中的单个细胞。

该方法还有助于研究完整皮肤样本中表皮和真皮之间的相互作用。一般来说，刚接触这种方法的研究人员在准备小的扁平皮肤活检而不损坏毛囊时可能会遇到一些困难。演示该程序的是澳大利亚新南威尔士大学发育和再生皮肤病学部门的博士生 Betty Maclarios。

首先使用修剪器剃掉安乐死小鼠脖子上的毛发，注意不要伤到皮肤。然后用 70% 乙醇和 PBS 净化皮肤。接下来，用镊子提起颈部背侧皮肤，用剪刀去除大约 1.5 x 4 厘米的小鼠背侧皮肤区域。

然后将皮肤真皮面朝下放在一张滤纸上，记下样品的前后方向，并在解剖的皮肤周围修剪纸。为了获得最佳成像效果，皮肤样本需要保持平坦，毛囊方向一致。为了将样本保持在适当的前后位置，我们在矩形活检中将皮肤块固定在滤纸上。

将样品转移至装有新鲜制备的 4% PFA 和 PBS 的 15 mL 试管中。然后，当它们牢固地固定在滤纸上时，将样品转移到新的 15 mL PBS 管中，进行两次 5 分钟的洗涤。为了清除皮肤活检，在第二次洗涤后，使用锋利的剃须刀片将组织切成大约 0.2 x 0.5 厘米的块，同时注意沿样品的前后方向切割样品的较长边。

沿着平行于毛囊方向的活检侧面切割也有助于避免大面积的毛囊损伤。他们将活检细胞浸入 5 mL 新鲜制备的立方一清除溶液中，放入新的 15 mL 试管中，然后将试管放在 37 摄氏度杂交炉中的旋转平台上。组织块透明后，在 4 mL PBS 中洗涤活检 4 次，在 37 摄氏度下洗涤 6 小时，然后在 37 摄氏度下以 20% 重量的蔗糖和 PBS 洗涤 4 小时。

孵育结束时，将每个样品在最佳切割温度化合物中单独 15 mL 试管中在 80 摄氏度下冷冻过夜，以增加组织对抗体渗透的渗透性。第二天早上，用适当的抗体和感兴趣的活性染料对皮肤样品进行染色。然后将标本在 1 mL 新鲜制备的立方 2 级透明溶液中放入 2 mL 试管中，在 37 摄氏度的烘箱中在 37 °C 烘箱中孵育 24 小时，以使组织的折射率均匀。

当组织清晰时，将活检沿单个玻璃盖玻片的较长一侧定位，使毛囊生长的方向平行于盖玻片表面。将一滴立方二溶液滴在纸巾上。将两条 1 mL x 2 cm 的蓝色粘性条放在盖玻片上，然后用第二张盖玻片盖住活检。

接下来，将成像室放在共聚焦显微镜载物台上，并将组织移动到光路中。使用适当的光源和标准落射荧光滤光片，扫描样品以识别感兴趣的荧光染色区域，然后获取感兴趣区域的荧光共聚焦图像。使用这种方法，可以澄清成年野生型小鼠的厚度背皮活检，并用针对基底角质形成细胞标志物角蛋白 14 的抗体染色。

在整个样本中都可以看到 dappy 阳性细胞核，可以欣赏一些解剖学特征，例如真皮。K14 染色在滤泡间表皮的单细胞厚基底层中很明显。勾勒出毛囊的皮脂腺和外根鞘以及次生毛病菌，在毛囊的凸起区域仅检测到低水平的 K14 表达。

为了观察增殖细胞，可以澄清和染色成年野生型小鼠休止期的全层背侧皮肤活检，如图所示，揭示了在基底毛囊间表皮和峡部存在增殖的角质形成细胞，而不是毛囊的凸起区域。为了观察皮脂腺，可以澄清和染色成年野生型小鼠抗原的全层背侧皮肤活检，有助于检测毛囊峡部区域的皮脂腺。为了可视化表皮和转基因动物的形态变化，可以澄清和染色全层背侧皮肤活检，揭示毛囊间表皮增生和异常毛囊，K14 标记的细胞团向近端延伸到真皮中，代表扩大的转基因干细胞群。

观看此视频后，我们应该对如何制备和澄清皮肤样品以及在三维单细胞分辨率下可视化蛋白质表达模式有很好的了解。这种方法执行简单，并且使用相对安全且便宜的试剂。将来，将测试更多抗体与该方法的兼容性，从而扩展该分析以可视化更多蛋白质和某些类型的目标。

可以执行其他成像方法，例如光片显微镜，以在三维空间中可视化较大皮肤样本的皮肤解剖结构和蛋白质表达模式。开发后，这项技术将为皮肤病学领域的研究人员铺平道路，以探索皮肤稳态、转基因小鼠模型和我们的皮肤病模型之一中真皮和表皮之间的细胞和分子相互作用。