CUBIC 协议在全层皮肤样本中以单细胞分辨率可视化蛋白表达

本实验的总体目标是在三维空间中以单细胞水平可视化细胞增殖和蛋白质表达模式，并精确评估皮肤的解剖结构和病理特征。该方法有助于回答一些关键科学问题，例如细胞和分子机制如何调控表皮发育与再生，以及在皮肤疾病过程中这些机制如何发生紊乱。该技术的主要优势在于，它是一种技术上简便的方案，能够以前所未有的精确度在全层皮肤活检样本中实现三维可视化单个细胞。

该方法还有助于研究完整皮肤样本中表皮与真皮之间的相互作用。通常，初次接触该方法的研究人员在制备小型扁平皮肤活检样本时可能会遇到一定困难，难以避免损伤毛囊。本操作的示范者为贝蒂·麦克拉里奥斯（Betty Maclarios），她是澳大利亚新南威尔士大学（UNSW Australia）发育与再生皮肤科的一名博士研究生。

首先使用修毛器剃除已处死小鼠颈部的毛发，注意不要损伤皮肤。然后用70%乙醇和PBS对皮肤进行去污处理。接着用镊子提起背部颈部皮肤，用剪刀剪下约1.5 × 4 cm的背部皮肤区域。

然后将皮肤真皮面朝下展平在一张滤纸上，标记样本的前后方向，并沿解剖好的皮肤边缘修剪滤纸。为获得最佳成像效果，皮肤样本需保持平整，毛囊方向一致。为确保样本保持正确的前后方位，我们将皮肤组织块固定在滤纸上，呈矩形活检片状。

将样本转移至含有新配制的4%PFA和PBS的15 mL离心管中。待样本在滤纸上牢固固定后，将标本转移至新的含有PBS的15 mL离心管中，进行两次，每次五分钟的洗涤。在第二次洗涤后，为清除皮肤活检组织，使用锋利的剃须刀片将组织切成约0.2 cm × 0.5 cm的片段，注意样本的长边应沿样本的前后方向切割。

沿毛囊方向平行于皮肤活检样本的一侧进行切割，有助于避免对毛囊造成严重损伤。随后将活检样本浸入新试管中的 15 mL 管内含 5 mL 新鲜配制的 Cubic One 透明化溶液中，并将试管置于杂交炉内的旋转平台上，37 摄氏度孵育。待组织块变得透明后，用 4 mL 磷酸盐缓冲液（PBS）在 37 摄氏度下进行四次洗涤，每次六小时；随后在 37 摄氏度下用含 20%（重量/体积）蔗糖的 PBS 溶液洗涤四小时。

孵育结束后，将各份样本置于包埋盒中，加入适量的OCT包埋剂，分别放入15 mL离心管中，在–80 °C条件下冷冻过夜，以增强组织对抗体渗透的通透性。次日清晨，用相应的抗体及感兴趣的活体染料对皮肤样本进行染色。随后，将样本置于2 mL离心管中，加入1 mL新配制的CUBIC-2透明化溶液，在37 °C摇床上孵育24小时，以均一化组织的折射率。

将组织置于适当位置后，沿单个玻璃盖玻片的长边放置活检样本，使毛囊生长方向与盖玻片表面平行。在组织上滴加一滴 Cubic Two 溶液。在盖玻片上放置两条规格为 1 mL × 2 cm 的蓝胶条，然后用第二个盖玻片覆盖住活检组织。

接下来，将成像腔置于共聚焦显微镜载物台上，并将组织移入光路中。使用适当的光源和标准的落射荧光滤光片，扫描样品以识别荧光标记的目标区域，然后采集这些目标区域的荧光共聚焦图像。利用该方法，可对成年野生型小鼠的厚背侧皮肤活检组织进行透明化处理，并用针对基底角质形成细胞标志物角蛋白14的抗体进行染色。

Dappy 阳性细胞核在整个样本中可见，有助于观察某些解剖结构特征，例如真皮乳头。K14 染色明显存在于表皮基底层中，该层为单层细胞结构，围绕皮脂腺、毛囊外根鞘以及次级毛囊胚，并在毛囊隆突区域仅检测到低水平的 K14 表达。

为了观察增殖细胞，可对成年野生型小鼠生长期（telogen）背部全层皮肤活检样本进行透明化处理并染色，结果显示在基底层间毛囊表皮和毛囊峡部存在增殖的角质形成细胞，但在毛囊隆突区则无此现象。为了观察皮脂腺，可对成年野生型小鼠退行期（antigen）背部全层皮肤活检样本进行透明化处理并染色，从而便于检测毛囊峡部区域的皮脂腺。为了观察表皮的形态学变化及转基因动物中的改变，可对背部全层皮肤活检样本进行透明化处理并染色，结果显示间毛囊表皮出现增生，毛囊结构异常，伴有K14标记的细胞团块向真皮近端延伸，代表扩增的转基因干细胞群体。

观看本视频后，我们应能充分理解如何制备和透明化皮肤样本，并在三维空间中以单细胞分辨率观察蛋白质表达模式。该方法操作简便，所用试剂相对安全且成本较低。未来将测试更多抗体与本方法的兼容性，从而拓展该分析技术的应用范围，以实现对更多蛋白质及特定类型目标分子的可视化观察。

其他成像方法，例如光片显微镜，可用于三维可视化较大皮肤样本的皮肤解剖结构和蛋白质表达模式。该技术发展成熟后，将为皮肤科学领域的研究人员探索真皮与表皮在皮肤稳态、基因修饰小鼠模型以及我们的一种皮肤疾病模型中的细胞与分子相互作用提供新的途径。