实验性转移与CTL过继性转移免疫治疗小鼠模型

本实验的总体目标是评估肿瘤特异性T细胞过继转移免疫疗法在体内的有效性。首先通过尾静脉注射将肿瘤细胞移植到小鼠体内，以建立肺转移模型；实验的第二步是用肿瘤特异性的细胞毒性T淋巴细胞（CTLs）治疗荷瘤小鼠。

最后一步是使用印度墨水来可视化并量化肿瘤结节。最终可获得结果，通过测量肿瘤大小和统计肿瘤结节数量来展示不同治疗的CIE。大家好，我叫Mary Zimmerman，我是佐治亚医学院Kevin Lu博士实验室的成员。

您好，我叫Shelene Hu，是一名二年级的学生，同时也在Lou博士的实验室工作。与传统方法（如生存曲线）相比，该技术的主要优势在于它兼具定性和定量分析的特点。该技术的应用前景可拓展至癌症治疗领域，因为它模拟了人类癌症患者中T细胞过继性免疫治疗的过程。

因此，我们开始准备。在肿瘤细胞注射前一天，将最多1×10⁷个CMS4-met细胞接种至一个T75培养瓶中，加入10毫升含10%血清的RPMI培养基。为获得快速生长的肿瘤细胞，于37°C培养过夜，次日进行注射。

吸去培养基，用 PBS 洗涤细胞一次，然后在 37 摄氏度下用 0.05% 胰蛋白酶 EDTA 消化 5 分钟以收集肿瘤细胞。加入含 10% 血清的 10 毫升 RPMI 培养基终止反应。将细胞转移至锥形管中。

在室温下，以1300 RPM的转速使用val legend RT离心机离心细胞3分钟。室温下弃去上清液，将细胞重悬于10毫升新鲜的1× HBSS中进行洗涤。然后再次离心，并以相同方式重悬。

使用血细胞计数板对肿瘤细胞进行计数。将细胞用HBSS稀释，使每针所需细胞重悬于溶液中。在总体积为100微升的情况下，将六至八周龄的B SEA小鼠置于烧杯中，浸入温水中进行加温。

为扩张尾静脉，将小鼠置于实验台上的尾静脉固定器中。使用微量注射器向尾侧静脉注射100 µL肿瘤细胞。采用无菌技术操作，以避免注射后发生感染。

在注射部位施加轻微压力，直至出血停止。将小鼠放回笼中，让肿瘤生长至所需阶段。在转移当天，通过移液器反复吹打，重悬已纯化的细胞毒性T淋巴细胞或CTLs。

如文中所述，将一个培养板中的所有细胞转移至一个15毫升的锥形管中，注意液体体积不要超过管容量的三分之二。将一根无菌巴斯德吸管插入锥形管中，在细胞下方缓慢加入淋巴细胞分离液（Lymphocyte Separation Medium 或 LSM），直至总体积接近14毫升。

注意不要扰动各层。在室温下以2000 RPM离心20分钟。离心结束后不得使用刹车减速转子，将CTLs转移至新的15毫升锥形管中。

加入 HBSS 至约 10 毫升体积，用于洗涤。计数细胞后，在室温下以 1300 RPM 离心五分钟，然后用 HBSS 重悬至注射所需的细胞密度。

保持每次注射的总体积为 100 微升。采用本视频前面展示的相同尾静脉注射技术。将 CTLs 注射入荷瘤小鼠后，将小鼠放回笼中，使 CTLs 与肿瘤发生相互作用。

通常在CTL治疗后14至21天处死小鼠以进行分析。为观察肺转移灶，将已处死的小鼠仰卧置于泡沫板上，并固定四肢以确保充分暴露气管。

用70%乙醇从腹部中段开始喷洒腹侧表面。使用剪刀沿中线剪开肋骨，并向上剪至唾液腺。暴露气管。

使用镊子去除气管周围的组织。将一支200微升移液器吸头从气管下方穿过，并用一只手握住吸头。轻轻将气管从身体上提起并移开。

将平台旋转180度。使用50毫升注射器通过气管向肺部注入印度墨水。用墨水完全充盈肺部，直至感到明显阻力。

使用剪刀剪断气管。将一对镊子滑入肺下方，将肺从小鼠体内取出。在化学通风橱中，用一升烧杯中的水短暂冲洗肺组织。

将肺组织转移至含有五毫升 FTI 溶液的玻璃装置中。肿瘤组织将在黑色的肺组织上以白色结节的形式显现。数分钟后，即可在 FTI 溶液中对肿瘤进行计数，并可在此溶液中无限期保存。

转染了乳腺癌细胞系4T1的小鼠肺部出现白色斑点，表明存在肿瘤。转染了对K79E具有IRF8显性负性免疫的小鼠显示出肿瘤细胞转移潜能增强。

这些图像显示了 CTL 过继转移免疫治疗效果的组织学分析。注射生理盐水的荷瘤小鼠在六天后显示出多个肿瘤，由箭头指示；而注射肿瘤特异性 T 细胞的小鼠在同一实验中则显示出肿瘤减少。

印度墨水处理为评估CTL过继转移的疗效提供了一种更简便的方法。在此方法中，荷瘤肺组织上清晰可见的白色肿瘤结节可与成功接受CTL过继转移后的肺组织明确区分，通过计数结节数量可实现组织学方法无法达到的定量分析。在进行该操作时，需注意预先对小鼠进行保温，以利于更顺利、更准确地实施尾静脉注射。

观看本视频后，您应能充分理解如何通过这一简单的程序来定量评估肿瘤大小和数量，从而判断治疗效果。感谢观看，祝您的实验顺利成功。