实验转移和CTL过继转移免疫小鼠模型

一个实验性肺转移和CTL免疫小鼠模型的肿瘤细胞- T细胞相互作用分析

该程序的总体目标是检查肿瘤特异性 T 细胞过继转移免疫疗法在体内的疗效。首先通过侧尾静脉注射将肿瘤细胞移植到小鼠中以建立肺转移。该程序的第二步是用肿瘤特异性细胞毒性 T 淋巴细胞 CLL 处理荷瘤小鼠。

最后一步是使用印度墨水作为可视化和量化肿瘤结节的手段。最终，通过测量肿瘤大小和量化肿瘤结节的数量，可以获得显示不同治疗的 CIE 的结果。嗨，我叫 Mary Zimmerman，是佐治亚医学院 Kevin Lu 博士实验室的成员。

您好，我叫 Shelene 胡，我是二年级学生，我也在 Dr.Lou 的实验室工作。与传统方法（如生存曲线）相比，该技术的主要优点是该程序既是定性的又是定量的。这些技术的影响可以扩展到癌症治疗，因为它模拟了人类癌症患者的 T 细胞过继免疫疗法。

那么让我们开始吧：在肿瘤细胞注射的前一天，用最多 1 次 10 到 7 次接种 T 75 培养瓶。CMS 4 在 10 毫升含 10% 血清的 RPMI 培养基中对细胞进行检测。为了获得快速生长的肿瘤细胞，请在注射当天在 37 摄氏度下孵育过夜。

去除培养基并用 PBS 冲洗细胞一次，然后用 0.05% 胰蛋白酶 EDTA 在 37 摄氏度下收获肿瘤细胞 5 分钟。用 10 毫升含 10% 血清的 RPMI 培养基终止反应。将细胞转移到锥形管中。

在 val legend RT 离心机中以 1300 RPM 离心细胞 3 分钟。在室温下，去除 snat，将细胞重悬于 10 毫升新鲜的 1 XHB Ss 中洗涤。然后再次旋转并以相同的方式重新悬浮。

计数血液中的肿瘤细胞。细胞仪。在 HBSS 中稀释细胞，以便重悬每次注射所需的细胞。以 100 微升的总体积将 6 至 8 周龄的 B SEA 小鼠放入烧杯中加热，浸入温水中。

要扩张尾静脉，请将鼠标放在工作台上的尾静脉限制器中。使用 micros 注射器将 100 μL 肿瘤细胞注射到尾外侧静脉中。使用脓毒症技术以避免注射后感染。

注射部位施加轻微压力，直到出血停止。将鼠标放回笼子里，让肿瘤生长到所需的阶段。在转移当天，上下移液以重悬制备的纯化细胞毒性 T 淋巴细胞或 CTL。

如文中所述，将所有细胞从一个板转移到 15 mL 锥形管中，不要让体积超过试管的三分之二。将无菌巴斯德移液管插入锥形管中，分层分离淋巴细胞。培养基或 LSM 在细胞下放置，直到总体积接近 14 mL。

小心不要打扰图层。在室温下以 2000 RPM 离心 20 分钟。旋转后不要使用制动器减慢转子速度，将 CTL 转移到新的 15 毫升锥形管中。

添加 HBSS 至约 10 毫升的体积。洗涤。对细胞进行计数，以 1300 RPM 离心 5 分钟，在室温下，将 HBSS 重悬至注射所需的细胞密度。

将每次注射的总体积保持在 100 微升。使用与本视频前面相同的尾部注入技术。要将 CTL 注射到荷瘤小鼠中，将小鼠放回笼子并让 CTL 与肿瘤相互作用。

通常在 CTL 处理后 14 至 21 天处死小鼠进行分析。为了可视化肺转移，将一只牺牲的小鼠仰卧在聚苯乙烯泡沫塑料板上。固定支腿以确保气管通畅。

从中腹部开始用 70% 乙醇喷洒腹侧。用剪刀沿着中线穿过胸腔，向上剪向唾液腺。暴露气管。

使用镊子去除气管周围的组织。将 200 μL 移液器吸头穿入气管下方，用一只手握住吸头。轻轻地将气管向上提起，使其远离身体。

将平台旋转 180 度。使用 50 毫升注射器通过气管将印度墨水注射到肺部。用墨水完全给肺部充气，直到感觉到强烈的阻力。

用剪刀剪断气管。将一对镊子滑到肺部下方，然后将它们从鼠标中取出。在化学通风橱中放入 1 升水烧杯中短暂冲洗肺部。

将肺转移到装有 5 毫升 FTI 溶液的玻璃安装胆汁中。肿瘤组织将在黑肺上出现白色结节。几分钟后，现在可以对肿瘤进行计数并无限期地在 FTI 溶液中开始。这里。

转染乳腺癌小鼠的肺。细胞系 4 T 1 显示指示肿瘤的白点。转染对 K 79 E 免疫的 IRF 8 显性阴性小鼠显示肿瘤细胞的转移潜力增强。

这些图像显示了 CTL 过继转移免疫疗法疗效的组织学分析。注射生理盐水的荷瘤小鼠，6 天后显示多个肿瘤，箭头指示。另一方面，注射肿瘤特异性 T 细胞的小鼠在同一实验中显示出肿瘤的减少。

印度墨水处理提供了一种更简单的方法来衡量 CTL 过继转移的疗效。在这里，荷瘤肺上的白色肿瘤结节清楚地将它们与成功进行 CTL 过继转移的肺区分开来，并且对结节进行计数可以进行组织学无法实现的定量程度。在尝试此程序时，重要的是要记住让小鼠热身，以便更容易、更准确地进行尾静脉注射。

看完这个视频后，你应该对如何通过这个简单的程序来量化肿瘤的大小和数量来评估治疗效果有一个很好的了解。感谢您的观看，祝您的实验好运。