在全安装的胚胎神经系统的可视化果蝇胚胎

该程序的总体目标是准备 oph 和黑腹果蝇胚胎，用于神经系统的全山可视化。这是通过首先从感兴趣的果蝇品系中收集胚胎来实现的。该程序的第二步是用漂白剂去除真皮。

该程序的第三步是应用庚烷和甲醇去除 vilin 膜。该程序的最后一步是将抗体应用于胚胎。最终，可以获得通过免疫荧光显微镜显示果蝇胚胎神经系统结构的结果。

这种方法可以帮助回答神经科学领域的关键问题，例如突变在发育中的神经系统中可以发挥什么作用。一般来说，刚接触这种方法的人会很挣扎，因为他们可能会不小心从小瓶中挤出胚胎。通过准备所需的试剂开始此方案，包括 P-E-M-F-A、缓冲液 PBC 5%BSA 和 0.01% 叠氮化钠盐水溶液和甲醛固定剂。

通过用二氧化碳敲出果蝇，然后将至少 100 只果蝇转移到装有带有苹果汁琼脂饲板的适配器的塑料瓶中，为感兴趣的果蝇菌株准备一个笼子。将苍蝇笼在室温下避光放置 72 小时。每 8 到 12 小时更换一次苹果汁琼脂喂食盘，以便果蝇适应笼子，并且不会在实验中持有鸡蛋。

72 小时的驯化期后，从苹果汁琼脂喂食板的最后一次变化 12 小时收集胚胎。从产卵笼中取出苹果汁琼脂喂食板，并用盐水溶液更换。冲洗苹果汁琼脂饲喂盘。

将胚胎收集在细筛中。使用干净的油漆刷去除任何仍然粘在板上的胚胎。用盐水冲洗筛子中的胚胎，用抹刀去除多余的酵母，轻轻地捡起胚胎并将它们放入一个小玻璃瓶中。

加入约 1 毫升生理盐水。然后盖上小瓶并孵育 5 分钟以清洗胚胎。遵循胚胎收集。

通过混合 50% 庚烷和 50% 固定剂来制备庚烷固定溶液。溶液将在顶部分层，底部是固定剂。五分钟后，使用意大利面移液管从胚胎玻璃瓶中去除多余的盐水。

将大约一毫升的去离子水涂抹在装有胚胎的玻璃瓶中，用去离子水冲洗胚胎。让胚胎静置一分钟，然后用 50% 漂白剂溶液去除水分。用手摇晃小瓶几次，然后孵育 3 分钟，以便对胚胎进行涂层。

被植入的胚胎将沉到小瓶底部。胚胎 COR 会漂浮。孵育 3 分钟后去除漂白剂和 COR。

装饰后，用去离子水彻底冲洗胚胎，将大约 1 毫升的去离子水涂抹在装有胚胎的玻璃瓶中。让胚胎静置一分钟，然后去除水，剩余的 COR 会漂浮，应将其移除。将庚烷固定液添加到胚胎中，轻轻摇动孵育 30 分钟，以便在固定后固定它们。

使用意大利面移液器去除固定剂，即底层，将庚烷留在管中。然后将甲醇加入回管底代替固定剂并盖上管盖，用手剧烈摇晃以去除卵黄膜。在此步骤之后，化后的胚胎将沉到管的底部。

使用意大利面移液器，从小瓶中取出甲醇和 hets，留下去离子胚胎。然后用甲醇冲洗胚胎五次，在每次冲洗之间用意大利面移液管去除甲醇。每次冲洗时，将胚胎孵育 5 分钟。

将胚胎放入 50% PBT 溶液和 50% 甲醇的混合物中 5 分钟，使其再水化。然后将它们转移到 100% PBT 溶液中 5 分钟，继续再水化过程。接下来，通过在 5% BSA 和 0.01% 叠氮化钠溶液中在 4 摄氏度下孵育胚胎 1 小时来封闭胚胎。

接下来，使用 5% BSA 和 0.01% 叠氮化钠溶液将其稀释至适当浓度，制备用于胚胎染色的一抗。这里使用的抗体是针对囊泡半胱氨酸串蛋白和抗 HRP 抗体的。抗 HRP 识别存在于表面糖蛋白中的神经特异性碳水化合物部分，该部分标记所有神经元。

将胚胎在 4 摄氏度下在一抗溶液中孵育过夜。在一个小时内用 PBT 清洗胚胎 10 次。将大约 1 毫升 PBT 涂抹在装有胚胎的玻璃瓶中，让胚胎静置 6 分钟，然后取出 PBT。

重复此应用 PBT、孵育和去除 PBT 的过程 10 次。在黑暗中制备二抗溶液，因为它对光敏感，稀释至适当的浓度。我们使用浓度为 1 到 200 的 Alexa 二抗。

将胚胎在 4 摄氏度下在二抗溶液中孵育 2 小时。将胚胎和二抗溶液的玻璃瓶包裹在铝箔中，以避免光照。在一个小时内用 PBT 清洗胚胎 10 次。

向胚胎中加入载体屏蔽封固剂，并在 4 摄氏度下孵育过夜以封片。使用柔和的移液器吸取胚胎以及一些安装介质。将胚胎和培养基涂在载玻片上。

在胚胎上涂上盖玻片，并用指甲油密封盖玻片。在这里使用荧光显微镜观察胚胎。胚胎 CNS 显示在第 16 至 17 阶段。

胱氨酸串蛋白以红色显示。HRP 神经元显示为绿色。请注意此代表性图像中连合的明显染色。

胚胎 PNS 显示在第 16 至 17 阶段。同样，胱氨酸串蛋白显示为红色，神经元显示为绿色。注意外周神经元的重复模式。

尝试此程序时，重要的是要注意胚胎，以免意外将它们从小瓶中取出。看完这个视频，你应该对如何准备 oph fla 胚胎进行神经系统的全山可视化有一个很好的了解。