Name: 在全安装的胚胎神经系统的可视化果蝇胚胎 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-12-11T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 8 s
Description: 学习使用免疫荧光显微镜技术对黑腹果蝇胚胎进行全胚神经系统可视化。该方法通过胚胎收集、固定和抗体染色步骤，帮助研究人员观察神经元结构并研究发育过程中的基因功能。

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SG 获得纽约州立大学布法罗分校和约翰·R·奥伊谢基金会的资金支持。

1. 试剂的准备
<ol>
	<li>使用 100 mM Pipes、2 mM EGTA 和 1 mM MgSO4 配制 PEMFA 缓冲液。将缓冲液 pH 调至 7.0。PEMFA 缓冲液经滤膜除菌后，于 4°C 保存。</li>
	<li>在 100 ml 1× PBS（磷酸盐缓冲盐水，pH 7.0）中加入 1 ml Triton X-100 配制 PBT。4°C 保存。</li>
	<li>在 1× PBS（pH 7.0）中配制含 0.01% NaAcide 的 5% BSA（牛血清白蛋白）溶液。</li>
	<li>在去离子水中加入 0.7% NaCl 和 0.03% Triton X-100 配制盐溶液。</li>
	<li>将 4 份 PEMFA 缓冲液与 1 份 37% 甲醛混合，配制固定液。</li>
</ol>
2. 胚胎的收集
<ol>
	<li>准备一个笼子用于 果蝇 通过放置目标菌株 &gt;一个含有琼脂喂养板和适配器的塑料瓶中放置100只果蝇。</li>
	<li>将果蝇笼子置于室温避光环境中72小时，每8–12小时更换一次培养板，使果蝇适应笼内环境并避免滞卵。</li>
	<li>实验过程中收集胚胎12小时。将培养皿从容器中取出并更换新的培养皿。取下已移除的培养皿，用生理盐水和干净的画笔将胚胎从培养皿上冲洗下来。</li>
	<li>用细筛收集胚胎，用生理盐水冲洗以去除多余的酵母。 </li>
	<li>用刮勺轻轻挑起胚胎，放入带盖的小玻璃瓶中，加入约1 ml生理盐水。</li>
</ol>
3. 脱除卵膜和卵黄膜并固定
<ol>
	<li>收集胚胎后，通过将50%正庚烷与50%固定液混合配制Heptane-Fix溶液。该溶液将分层，上层为正庚烷，下层为固定液。</li>
	<li>在玻璃小瓶中，将胚胎置于盐溶液中孵育5分钟以进行清洗。使用巴斯德吸管去除多余的盐溶液。</li>
	<li>用去离子水冲洗胚胎。</li>
	<li>将胚胎在50%次氯酸钠溶液中孵育3分钟以去除卵壳。</li>
	<li>用去离子水彻底冲洗胚胎。</li>
	<li>将胚胎置于Heptane-Fix溶液中，在温和振荡条件下孵育30分钟以进行固定。</li>
	<li>使用巴斯德吸管将固定液（下层）替换为甲醇，保留管中的正庚烷。剧烈振荡以去除卵黄膜。去卵黄膜后的胚胎将沉至管底。</li>
	<li>用巴斯德吸管将胚胎转移至新的玻璃小瓶中。用甲醇冲洗胚胎五次，每次孵育5分钟。</li>
</ol>
4. 抗体染色、封片与可视化
<ol>
	<li>将胚胎在50% PBT溶液与50%甲醇的混合液中复水5分钟，随后在100% PBT溶液中复水5分钟。</li>
	<li>在4°C下，用含5% BSA和0.01% NaAcide溶液的封闭液孵育胚胎1小时，以进行封闭。</li>
	<li>胚胎现已准备好进行抗体染色。使用含5% BSA和0.01% NaAcide的溶液将一抗稀释至适当浓度。我们使用针对囊泡突触蛋白——半胱氨酸串蛋白（CSP）的抗体，以及抗-HRP（辣根过氧化物酶）抗体，后者可识别存在于细胞表面糖蛋白中的神经元特异性碳水化合物基团，从而标记所有神经元。</li>
	<li>在4°C下，将胚胎于一抗溶液中孵育过夜。</li>
	<li>次日，在1小时内用PBT溶液洗涤胚胎10次。</li>
	<li>将二抗稀释至适当浓度，制备二抗溶液。我们使用的Alexa荧光标记二抗稀释比例为1:200。</li>
	<li>在4°C下，将胚胎于二抗溶液中孵育2小时。</li>
	<li>在1小时内用PBT溶液洗涤胚胎10次。</li>
	<li>将胚胎在Vectashield封片介质中孵育过夜。</li>
	<li>将胚胎封片于载玻片上，并用指甲油封固盖玻片。使用荧光显微镜观察胚胎。</li>
</ol>
5. 代表性结果
<img src="/files/ftp_upload/2150/2150fig1a.jpg" alt="荧光细胞的共聚焦显微镜图像，比例尺显示用于细胞分析的放大倍数。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Figure 1"> CSP <img src="/files/ftp_upload/2150/2150fig1b.jpg" alt="共聚焦显微镜图像；脊髓结构；荧光染色；细胞可视化。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Figure 1"> HRP-FITC <img src="/files/ftp_upload/2150/2150fig1c.jpg" alt="共聚焦显微镜图像，细胞结构可视化；荧光蛋白标记细胞形态。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Figure 1"> 合并 图 1： 使用抗 CSP（红色）和 HRP（绿色）抗体显示 16–17 发育阶段胚胎中枢神经系统的代表性图像。注意联合部位的明显染色。
<img src="/files/ftp_upload/2150/2150fig2a.jpg" alt="共聚焦显微镜图像；神经纤维；荧光标记；细胞结构可视化。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 2"> CSP <img src="/files/ftp_upload/2150/2150fig2b.jpg" alt="荧光显微镜图像，显示生物组织样本中的神经纤维，比例尺为 20 μm。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 2"> HRP-FITC <img src="/files/ftp_upload/2150/2150fig2c.jpg" alt="共聚焦显微镜图像；神经元结构可视化；荧光标记，放大比例尺。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 2"> 合并图像 图 2： 使用抗 CSP（红色）和 HRP（绿色）抗体标记的第 16–17 发育阶段胚胎周围神经系统（PNS）的代表性图像。注意周围神经元呈现的重复性分布模式。

<ol><li>Bodmer, R., Barbel, S., Sheperd, S., Jack, J. W., Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transformation+of+sensory+organs+by+mutations+of+the+cut+locus+of+D.+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Transformation of sensory organs by mutations of the cut locus of D. melanogaster.</a> Cell. 51, 293-307 (1987).</li>
<li>Bodmer, R., Carretto, R., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurogenesis+of+the+peripheral+nervous+system+in+Drosophila+embryos%3A+DNA+replication+patterns+and+cell+lineages%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Neurogenesis of the peripheral nervous system in Drosophila embryos: DNA replication patterns and cell lineages.</a> Neuron. 3, 21-32 (1989).</li>
<li>Campos-Ortega, J. A., Hartenstein, V. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCampos-Ortega%2C+JA+%22The+Embryonic+Development+of+Drosophila+melanogaster%22">The Embryonic Development of Drosophila melanogaster</a>. , Springer-Verlag. New York. (1985).</li>
<li>Carroll, S. B., Scott, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+the+fushi+tarazu+protein+during+Drosophila+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Localization of the fushi tarazu protein during Drosophila embryogenesis.</a> Cell. 43, 47-57 (1985).</li>
<li>Dambly-Chaudière, C., Ghysen, A., Jan, Y. N., Jan, L. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscle+connections+between+imaginal+discs+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Muscle connections between imaginal discs in Drosophila.</a> Developmental Biology. 113, 288-294 (1986).</li>
</ol>

无利益冲突声明。

这 果蝇 胚胎是研究神经发育过程中细胞和分子变化的有力系统。本方案中，我们展示了如何制备用于免疫组织化学的整装胚胎样本。本方案改编自Carroll和Scott（1985）所述方法。该方案也可适用于检测其他神经元抗体，但需对抗体条件进行优化。此外，通过比较不同突变品系的胚胎，可直观地观察胚胎外周神经系统（PNS）和中枢神经系统（CNS）的发育缺陷。我们已成功应用此方案对携带运动蛋白突变的胚胎中的PNS和CNS进行可视化观察。在高倍镜下，我们还评估了胚胎PNS和CNS内的轴突走行路径。

<table><tbody><tr><td>37% 甲醛</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP531-25</td><td></td></tr><tr><td>CSP</td><td>发育研究杂交瘤库</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HRP-FITC</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>323-095-021</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 568 山羊抗小鼠 IgG</td><td>Invitrogen</td><td>A-11004</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield 封片介质</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1000</td><td></td></tr></tbody></table>

整体胚胎神经系统的可视化 果蝇 胚胎

Visualization of the Embryonic Nervous System in Whole-mount Drosophila Embryos

Drosophila 胚胎是研究神经元发育细胞与分子基础的优良模型系统。本文描述了利用神经元蛋白抗体对 Drosophila 胚胎神经系统进行可视化观察的实验流程。由于胚胎期的外周神经系统和中枢神经系统在单个细胞水平上已有明确的特征描述（Dambly-Chaudière et al., 1986; Bodmer et al., 1987; Bodmer et al., 1989），因此使用针对不同神经元蛋白的抗体可轻松识别这些系统中的任何异常。为确保胚胎处于适合观察的正确发育阶段，需在特定时间点收集正在发育的胚胎。收集后，在固定前需去除胚胎外部的两层结构，即卵壳膜和包裹胚胎的卵黄膜。随后将胚胎与神经元抗体孵育，并使用荧光标记的二抗进行可视化检测。在发育阶段12至17期间对胚胎进行观察，以评估其神经系统发育情况。在第12阶段，中枢神经系统（CNS）的成虫带开始缩短；到第15阶段，联合神经纤维的最终模式已形成；至第17阶段，中枢神经系统收缩完成，外周神经系统（PNS）亦完全发育（Campos-Ortega et al., 1985）。因此，在这些发育阶段中，PNS和CNS的形态变化可被清晰地观察到。

我们描述了制备不同发育阶段的 黑腹果蝇 用于在胚胎发育过程中可视化胚胎神经系统的胚胎样本。

果蝇胚胎是研究神经元发育细胞与分子基础的理想模型系统。本文描述了……

本实验的总体目标是制备 oph 和黑腹果蝇胚胎，以实现对神经系统进行整体封片观察。首先从目标果蝇品系中收集胚胎，完成第一步。实验的第二步是使用漂白剂去除胚胎的外壳。该实验步骤的第三步是使用庚烷和甲醇去除胚胎的卵膜。实验的最后一步是向胚胎施加抗体。最终，可通过免疫荧光显微镜观察果蝇胚胎神经系统的结构。该方法有助于回答神经科学领域的一些关键问题，例如突变在神经系统发育过程中可能发挥的作用。通常，初次使用该方法的研究人员可能会遇到困难，因为他们可能不慎将胚胎从试剂管中吸出。开始本实验方案前，需先准备所需的试剂，包括P-E-M-F-A、含5% BSA和0.01%叠氮化钠的PBC缓冲液以及甲醛固定液。通过二氧化碳麻醉果蝇，然后将至少100只果蝇转移至含有适配器和苹果汁琼脂饲喂板的塑料瓶中，为感兴趣的果蝇品系准备饲养笼。将果蝇饲养笼置于室温黑暗环境中72小时。每8至12小时更换一次苹果汁琼脂饲喂板，以使果蝇适应饲养笼环境，并避免其在实验前滞留卵。在72小时的适应期后，从最后一次更换苹果汁琼脂培养板开始计时，收集12小时内的胚胎。将苹果汁琼脂培养板从产卵笼中取出，并用生理盐水替换。冲洗苹果汁琼脂培养板。用细筛收集胚胎。使用干净的画笔将仍粘附在培养皿上的胚胎轻轻刷下。用盐水冲洗筛中的胚胎，以去除多余的酵母，并用刮铲轻轻挑起胚胎，转移至小玻璃瓶中。加入约一毫升生理盐水。然后盖上小瓶盖，孵育五分钟以清洗胚胎。在收集胚胎之后进行此步骤。通过混合50%庚烷和50%固定液来配制庚烷固定液。该溶液将分层，上层为庚烷，下层为固定液。五分钟后，使用巴氏吸管从装有胚胎的玻璃小瓶中移除多余的生理盐水。用去离子水冲洗胚胎，向装有胚胎的玻璃小瓶中加入约一毫升去离子水。让胚胎静置一分钟，然后移除液体并加入50%的次氯酸钠溶液。用手轻轻摇动小瓶数次，随后孵育三分钟，以使胚胎充分被溶液包裹。处理后的胚胎将沉入离心管底部，而胚胎的卵壳（COR）会漂浮在液面。在孵育三分钟后，移除次氯酸钠溶液和漂浮的卵壳。完成染色后，用去离子水彻底冲洗胚胎，向装有胚胎的玻璃小瓶中加入约一毫升去离子水。让胚胎静置一分钟，然后移除残留的水；未反应的试剂（CORs）会漂浮在液面，应予以去除。向胚胎中加入庚烷固定液，在温和振荡条件下孵育30分钟以完成固定。使用巴氏吸管移除固定剂（即下层液体），保留管中的庚烷。然后将甲醇加回至管底以替代固定剂，并盖紧管盖，用手剧烈振荡，以去除卵黄膜。经过此步骤后，去壳的胚胎将沉至管底。使用巴氏吸管移除小瓶中的甲醇和hets，留下去离子的胚胎。然后用甲醇清洗胚胎五次，每次清洗后均用巴氏吸管吸除甲醇。每次清洗时，将胚胎孵育五分钟。将胚胎放入由50% PBT溶液和50%甲醇组成的混合液中，孵育5分钟以重新水化。随后将胚胎转移至100% PBT溶液中，继续孵育5分钟以完成再水化过程。接下来，在4°C条件下，用含5% BSA和0.01%叠氮化钠的溶液孵育胚胎1小时，以进行封闭。接下来，使用含5% BSA和0.01%叠氮化钠的溶液将一抗稀释至适当浓度，用于胚胎染色。此处使用的一抗为针对囊泡性半胱氨酸串蛋白的抗体和抗HRP抗体。抗HRP抗体可识别存在于表面糖蛋白中的神经特异性碳水化合物基团，从而标记所有神经元。将胚胎在一次抗体溶液中于 4 摄氏度孵育过夜。在 1 小时内用 PBT 洗涤胚胎 10 次。向含有胚胎的玻璃小瓶中加入约 1 毫升 PBT，孵育 6 分钟后去除 PBT。重复此PBT处理、孵育和去除PBT的步骤共10次。在避光条件下配制二抗溶液，因为其对光敏感，需稀释至适当浓度。我们使用的Alexa荧光二抗稀释比例为1:200。将胚胎与二抗溶液在4°C条件下孵育两小时。用铝箔包裹装有胚胎和二抗溶液的玻璃小瓶，避免光照。在1小时内用PBT洗涤胚胎10次。加入抗荧光淬灭封片剂至胚胎中，在4°C条件下孵育过夜以进行封片。使用移液枪吸取胚胎及部分封片剂，将胚胎与封片剂共同滴加至载玻片上。将盖玻片覆盖在胚胎上，并用指甲油密封盖玻片。在此使用荧光显微镜观察胚胎。胚胎中枢神经系统（CNS）显示为16至17期。胱氨酸串蛋白显示为红色。HRP标记的神经元显示为绿色。请注意在此代表性图像中，白质交叉区域具有明显的染色特征。在16至17期显示胚胎外周神经系统。同样，囊性蛋白以红色显示，神经元以绿色显示。注意外周神经元呈现重复的模式。在进行此操作时，需特别注意胚胎，以免意外将其从小瓶中移出。观看本视频后，您应能充分掌握如何制备用于全胚胎整体观察神经系统的 oph fla 胚胎。

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