整体胚胎神经系统的可视化 果蝇 胚胎

本实验的总体目标是制备 oph 和黑腹果蝇胚胎，以实现对神经系统进行整体封片观察。首先从目标果蝇品系中收集胚胎，完成第一步。实验的第二步是使用漂白剂去除胚胎的外壳。

该实验步骤的第三步是使用庚烷和甲醇去除胚胎的卵膜。实验的最后一步是向胚胎施加抗体。最终，可通过免疫荧光显微镜观察果蝇胚胎神经系统的结构。

该方法有助于回答神经科学领域的一些关键问题，例如突变在神经系统发育过程中可能发挥的作用。通常，初次使用该方法的研究人员可能会遇到困难，因为他们可能不慎将胚胎从试剂管中吸出。开始本实验方案前，需先准备所需的试剂，包括P-E-M-F-A、含5% BSA和0.01%叠氮化钠的PBC缓冲液以及甲醛固定液。

通过二氧化碳麻醉果蝇，然后将至少100只果蝇转移至含有适配器和苹果汁琼脂饲喂板的塑料瓶中，为感兴趣的果蝇品系准备饲养笼。将果蝇饲养笼置于室温黑暗环境中72小时。每8至12小时更换一次苹果汁琼脂饲喂板，以使果蝇适应饲养笼环境，并避免其在实验前滞留卵。

在72小时的适应期后，从最后一次更换苹果汁琼脂培养板开始计时，收集12小时内的胚胎。将苹果汁琼脂培养板从产卵笼中取出，并用生理盐水替换。冲洗苹果汁琼脂培养板。

用细筛收集胚胎。使用干净的画笔将仍粘附在培养皿上的胚胎轻轻刷下。用盐水冲洗筛中的胚胎，以去除多余的酵母，并用刮铲轻轻挑起胚胎，转移至小玻璃瓶中。

加入约一毫升生理盐水。然后盖上小瓶盖，孵育五分钟以清洗胚胎。在收集胚胎之后进行此步骤。

通过混合50%庚烷和50%固定液来配制庚烷固定液。该溶液将分层，上层为庚烷，下层为固定液。五分钟后，使用巴氏吸管从装有胚胎的玻璃小瓶中移除多余的生理盐水。

用去离子水冲洗胚胎，向装有胚胎的玻璃小瓶中加入约一毫升去离子水。让胚胎静置一分钟，然后移除液体并加入50%的次氯酸钠溶液。用手轻轻摇动小瓶数次，随后孵育三分钟，以使胚胎充分被溶液包裹。

处理后的胚胎将沉入离心管底部，而胚胎的卵壳（COR）会漂浮在液面。在孵育三分钟后，移除次氯酸钠溶液和漂浮的卵壳。

完成染色后，用去离子水彻底冲洗胚胎，向装有胚胎的玻璃小瓶中加入约一毫升去离子水。让胚胎静置一分钟，然后移除残留的水；未反应的试剂（CORs）会漂浮在液面，应予以去除。向胚胎中加入庚烷固定液，在温和振荡条件下孵育30分钟以完成固定。

使用巴氏吸管移除固定剂（即下层液体），保留管中的庚烷。然后将甲醇加回至管底以替代固定剂，并盖紧管盖，用手剧烈振荡，以去除卵黄膜。经过此步骤后，去壳的胚胎将沉至管底。

使用巴氏吸管移除小瓶中的甲醇和hets，留下去离子的胚胎。然后用甲醇清洗胚胎五次，每次清洗后均用巴氏吸管吸除甲醇。每次清洗时，将胚胎孵育五分钟。

将胚胎放入由50% PBT溶液和50%甲醇组成的混合液中，孵育5分钟以重新水化。随后将胚胎转移至100% PBT溶液中，继续孵育5分钟以完成再水化过程。接下来，在4°C条件下，用含5% BSA和0.01%叠氮化钠的溶液孵育胚胎1小时，以进行封闭。

接下来，使用含5% BSA和0.01%叠氮化钠的溶液将一抗稀释至适当浓度，用于胚胎染色。此处使用的一抗为针对囊泡性半胱氨酸串蛋白的抗体和抗HRP抗体。抗HRP抗体可识别存在于表面糖蛋白中的神经特异性碳水化合物基团，从而标记所有神经元。

将胚胎在一次抗体溶液中于 4 摄氏度孵育过夜。在 1 小时内用 PBT 洗涤胚胎 10 次。向含有胚胎的玻璃小瓶中加入约 1 毫升 PBT，孵育 6 分钟后去除 PBT。

重复此PBT处理、孵育和去除PBT的步骤共10次。在避光条件下配制二抗溶液，因为其对光敏感，需稀释至适当浓度。我们使用的Alexa荧光二抗稀释比例为1:200。

将胚胎与二抗溶液在4°C条件下孵育两小时。用铝箔包裹装有胚胎和二抗溶液的玻璃小瓶，避免光照。在1小时内用PBT洗涤胚胎10次。

加入抗荧光淬灭封片剂至胚胎中，在4°C条件下孵育过夜以进行封片。使用移液枪吸取胚胎及部分封片剂，将胚胎与封片剂共同滴加至载玻片上。

将盖玻片覆盖在胚胎上，并用指甲油密封盖玻片。在此使用荧光显微镜观察胚胎。胚胎中枢神经系统（CNS）显示为16至17期。

胱氨酸串蛋白显示为红色。HRP标记的神经元显示为绿色。请注意在此代表性图像中，白质交叉区域具有明显的染色特征。

在16至17期显示胚胎外周神经系统。同样，囊性蛋白以红色显示，神经元以绿色显示。注意外周神经元呈现重复的模式。

在进行此操作时，需特别注意胚胎，以免意外将其从小瓶中移出。观看本视频后，您应能充分掌握如何制备用于全胚胎整体观察神经系统的 oph fla 胚胎。