在肠神经系统的原位 钙成像

该程序的总体目标是使用荧光钙指示剂染料对肠道活体全装制剂中肠道神经元和神经胶质细胞的活性进行成像。这是通过首先从动物身上切除一部分肠道并将其放入预热培养基中来实现的。第二步是沿肠系膜边界打开肠道，并在轻微的张力下将其平放，粘膜表面朝上。

通过显微解剖制备肌间神经丛的全支架制剂，并置于成像皿中。接下来，将整个安装制剂在培养箱中加载荧光指示剂 Dye Flu oh four。在最后步骤中，使用配备高分辨率相机的荧光成像显微镜对加载的制剂进行成像，该相机由图像采集和分析软件控制，以记录基线活动。

然后添加正在研究的药物并记录神经元和神经胶质细胞中的钙瞬变。最终在原地。肠道神经系统的钙成像用于研究神经元和神经胶质细胞中的细胞活动如何促进肠道病理生理学中生理肠道功能和肠道神经系统功能障碍的调节。

这项技术的影响延伸到通过使用一种简单而强大的方法来检查神经元和肠胶质细胞之间复杂的相互作用，使用 NC 两个钙成像来证明该程序将对我实验室的科学家免费。以下涉及实验动物组织的程序与 A VMA 2013 年动物安乐死指南一致，并事先获得密歇根州立大学 I-A-C-U-C 的批准。按照批准的程序对动物实施安乐死后，将动物置于仰卧位，并用 70% 乙醇清洁腹部皮肤。用镊子捏住中线处的腹部皮肤，然后用手术剪刀沿线性肘部做一个 6 厘米的内侧切口，露出内部消化器官。

接下来，使用钝钳定位并暴露腹膜内的结肠。用剪刀剪断回肠肠系膜，然后开始解开肠道。一旦肠道的长度被充分解开，就切开盲肠远端和直肠近端的结肠以进行大肠准备，这将在本视频中展示。

然后快速取出肠段，将其放入含有 DM EMF 12 培养基的烧杯中，在冰上补充有 3 微摩尔盐酸尼卡地平和 1 微摩尔盐酸东莨菪碱。这些抑制剂的添加通过麻痹肠道平滑肌来促进显微解剖和随后的成像。取出所需肠段的 4 到 6 厘米小段，并放入装满冷藏补充培养基的 syl guard 涂层培养皿中。

然后用昆虫针固定肠段的近端和远端，并沿肠系膜边界纵向切开肠管。现在，在轻微的张力下将组织固定平放，粘膜面朝上，然后用 5 号细镊子提起粘膜，然后用非常细的弹簧剪刀在下面剪开，小心地解剖掉粘膜层。将组织切成约 0.5 厘米见方的较小制剂，然后将每块放入装满补充培养基的成像皿中，然后置于冰上。

将每个制剂固定在四个角上，圆形肌肉层朝上。用细镊子将圆形肌肉仔细解剖开来。要暴露肌间神经丛，请避免过度拉伸，将成像培养皿放回冰上，并用新鲜的补充培养基替换每个培养皿中的溶液。

接下来，将培养皿从冰中取出，向每个培养皿中加入 2 毫升酶混合物，并在室温下与 5% 二氧化碳和 95% 空气一起孵育 15 分钟。最后，用培养基洗涤组织制剂 3 次，并在光线有限的条件下工作时控制角落，以避免在 1.5 毫升补充培养基和 1.2 微升 250 毫摩尔原液中对 1.5 微升 4 毫摩尔 Fluro 4 原液的 1.5 微升 Eloqua 进行光漂白，在大约 1.5 毫升的流感 oh 4 中将溶液加载到成像皿中，并在 37 摄氏度的黑暗培养箱中孵育 45纪要。从培养箱中取出培养皿后，用培养基清洗制剂 3 次。

然后加入含有 200 微摩尔丙酸的新鲜培养基以增强神经神经元标记，并像以前一样孵育 15 分钟。在孵育过程中，根据方案书面部分的说明制备改良的 Krebs 缓冲液，并加入 3 微摩尔尼卡地平和 1 微摩尔东莨菪碱以抑制肌肉收缩。在钙二加成像和整体解剖过程中，将记录室置于荧光显微镜下，并使用带有多个加热注射器储液器的重力流灌注系统。

建立每分钟 2 至 3 毫升 37 摄氏度克雷布斯缓冲液的连续灌注速率。确保防止在连接到真空阱的输入管路和吸入管路中形成气泡。在明场照明下聚焦所需的神经丛。

避免过度暴露组织，这可能会导致光漂白。检查神经节内的 flu oh four 负荷并选择健康的神经节进行成像。不健康的受损神经节会表现出自发荧光或点状形态，不应用于成像。

选择神经节后，将光路转向相机并获得实时图像。使用图像采集软件，确保神经节聚焦并设置图像采集速率和曝光时间图像采集速率和时间将根据研究人员希望记录的事件而变化。对于大多数实验，传统上，神经胶质细胞以 0.5 到 1 赫兹的频率获取图像，最高为 2 到 10 赫兹。

对于神经元，由于神经胶质钙瞬变不如钙瞬变神经元快，因此在没有实验刺激的情况下 30 秒内开始记录并建立所选神经节的基线生理活动。然后，根据针对您的药物的优化方案，使用重力流灌注系统以每分钟 2 至 3 毫升的速度涂抹预热的目标药物，例如受体激动剂和拮抗剂。停止录制并查看实验的延时视频。

使用适当的图像分析软件仔细选择感兴趣的区域或 ROI。最后，使用适当的成像软件对感兴趣区域的荧光强度进行归一化，并将其与初始基线进行比较 归一化荧光的值变化与钙的变化成正比。以下三张图片表明，豚鼠的肠道胶质细胞对原位 TP 有反应。

在基础条件下，可以看到虚线勾勒出的低水平荧光 4 荧光。箭头指向厚的神经节间纤维束，在用每升 100 微 mo 的 A TP 神经胶质细胞刺激时，但神经元不会迅速增加荧光四荧光，表明钙增加。请注意，响应细胞很小，并且围绕着由星号标记的暗空间表示的更大的神经元。

该直方图显示肠道神经胶质细胞以剂量依赖性方式对 TP 的反应，每升 1 毫摩尔引起最大反应。该视频显示了来自小鼠远端结肠的肌间神经节，其中装有钙二加指示剂染料流感哦四。神经胶质细胞激动剂 a DP 在需要时添加到浴中。

DP 引起肠神经胶质细胞内钙 2 plus 的增加，如 flu oh four 荧光的短暂升高所观察到的那样。观看此视频后，您应该对如何准确检查神经元之间的复杂相互作用以及使用钙成像进行实证作有一个很好的了解。表征整片制备中钙反应的机制和潜在的功能后果需要精确解剖以获得理想的成像质量。

在这种基于显微镜的技术中使用荧光标记和药理学刺激可以改进对这些细胞在其天然多细胞环境中的评估。