Name: 在肠神经系统的原位 钙成像 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-29T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 26 s
Description: 学习使用荧光钙指示剂染料对肠神经系统中的神经元和胶质细胞进行活体钙成像技术。该方法通过显微解剖制备肠肌间神经丛整体标本，实时观察细胞活动，有助于深入理解肠道生理功能和病理机制。

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本工作获得了美国药品研究与制造商协会基金会（PhRMA Foundation）（资助对象：B. Gulbransen）、美国国立卫生研究院（女性健康领域跨学科研究职业发展项目）资助 K12 HD065879（B. Gulbransen）以及密歇根州立大学启动资金（B. Gulbransen）的支持。

注意：以下涉及实验动物组织的操作均符合《2013年美国兽医协会动物安乐死指南》，并已事先获得密歇根州立大学动物护理与使用委员会（IACUC）的批准。
1. 组织制备
<ol>
	<li>在含有2.5%异氟烷（isoflurane）的氧气环境中，或将3–5 ml液态异氟烷滴加至麻醉舱底部的吸水材料上，对实验动物进行麻醉；需确保设置物理屏障，防止动物直接接触异氟烷。通过夹捏足垫测试麻醉深度。 
	注意：当小鼠后肢无退避反射时，表明麻醉深度已达到适当水平。此时，通过颈椎脱位法对小鼠实施安乐死。</li>
	<li>将动物置于仰卧位，用70%乙醇清洁腹部皮肤。用镊子夹住腹中线处的皮肤，使用手术剪沿腹白线做一条6 cm的正中切口，以暴露腹腔内消化器官。</li>
	<li>使用钝头镊子在腹腔内定位并暴露回肠。用剪刀剪开回肠/结肠系膜，开始分离肠段。</li>
	<li>当肠道充分展开后，为制备回肠，应在胃的远端和盲肠的近端切断肠道。为制备大肠，应在盲肠的远端和直肠的近端切断结肠。</li>
	<li>迅速取出肠段并置于含有 DMEM/F12 培养基的烧杯中，该培养基添加有 3 μM 盐酸尼卡地平和 1 μM 盐酸东莨菪碱（下文简称“培养基”），并在冰上保存。添加这些抑制剂可通过麻痹肠道平滑肌，从而促进后续的显微解剖和成像。</li>
	<li>切割目标片段（例如，空肠，回肠，远端或近端结肠）基于已确立的解剖学标志。通常采用远端回肠或远端结肠的组织。然而，在所有肠段中分离、加载和成像肌间神经元和胶质细胞时，均使用相同的基本操作步骤。</li>
	<li>取所需肠段的一小部分（4-6 cm），置于盛有预冷培养基的硅胶包被培养皿中。</li>
	<li>用昆虫针固定肠段的近端和远端，并沿肠系膜缘作一纵向直线切口，打开肠管。</li>
	<li>将组织平铺，黏膜面朝上，施加轻度张力固定，使用精细镊子（#5 和 #5/45 最佳）及极细弹簧剪仔细剥离黏膜层。 
	注意：如果操作不当，去除黏膜可能会对肠神经系统（ENS）造成较大损伤。为获得高质量的标本，应避免通过撕扯或刮除的方式突然移除黏膜。最佳操作方法是先将黏膜抬起，再用精细剪刀在其下方进行剪切。</li>
	<li>将组织切成较小的样本（约 0.5 cm）2并将组织固定于盛有新鲜培养基并置于冰上的成像培养皿中（四角固定，环形肌层朝上）。</li>
	<li>用精细镊子小心地分离环形肌，以暴露肌间神经丛。避免过度拉伸。</li>
	<li>将成像培养皿放回冰上，并更换为新鲜培养基。</li>
	<li>每皿准备 2 ml 酶混合液 [Dispase 1 U/ml（4.48 mg/8 ml），Collagenase Type II 150 U/ml（5.45 mg/8 ml），溶于培养基中]。</li>
	<li>从冰上取下培养皿，加入步骤1.13中的酶混合液。</li>
	<li>在室温下用5% CO孵育培养皿15分钟2 95% 空气</li>
	<li>用培养基清洗组织样本3次，并重新固定四角。</li>
</ol>
2. 加载 Fluo-4 染料
注意：处理荧光染料及负载指示剂染料的组织时，应尽量减少光照，以避免光漂白。
<ol>
	<li>配制 4 μM Fluo-4 负载溶液。
	<ol>
		<li>加入1.5 ml培养基和1.2 μl的250 mM丙磺舒储备液至1.5 μl的4 mM Fluo-4储备液中。4 mM Fluo-4储备液的制备方法：将11.4 μl Pluronic F-127（20%溶于DMSO，含0.25% Cremaphor-EL）加入50 μg Fluo-4, AM中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在37 °C避光培养箱中，将样品置于Fluo-4负载溶液中孵育45分钟。</li>
	<li>从培养箱中取出，用培养基洗涤样本3次。</li>
	<li>更换为含有 200 μM probenecid 的培养基，孵育 15 分钟&#160;成像前于37 °C孵育。 
	注意：Probenecid 是一种可抑制神经元中多药耐药转运蛋白的药物。加入该药物可抑制神经元外排染料的能力，从而增强神经元标记效果。钙离子染料的大规模负载2+ 在无丙磺舒存在时，指示染料主要标记胶质细胞。加入丙磺舒后，可实现神经元和胶质细胞反应的可视化。</li>
	<li>配制改良型克雷布斯缓冲液。
	<ol>
		<li>配制改良型克雷布斯缓冲液，使其各成分的终浓度（单位：mM）如下：121 NaCl，5.9 KCl，2.5 CaCl2，1.2 MgCl2, 1.2 NaH2PO4，10 HEPES，21.2 NaHCO₃3，1 份丙酮酸和 8 份葡萄糖（用 NaOH 调节 pH 至 7.4）。加入 3 μM 尼卡地平和 1 μM 东莨菪碱以抑制 Ca 期间的肌肉收缩2+ 成像与整体解剖。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 成像与分析
注意：至少使用配备荧光光源、显微镜、高质量CCD相机及相应采集软件的基本成像系统。根据光源和具体应用的不同，可调整其他组件的配置。使用传统的氙弧灯光源时，必须配备滤光轮和快门；而LED光源及照明系统则无需这些组件。
<ol>
	<li>将记录室置于显微镜下，使用重力灌流系统及多个加热注射器储液器，以每分钟2–3毫升的速度持续灌流37 °C的Krebs缓冲液。确保灌流系统的输入管路以及连接至真空抽吸装置的吸液管路中均无气泡产生。</li>
	<li>在明场照明下将目标神经丛调至清晰对焦。避免组织过度曝光，以免导致光漂白。</li>
	<li>检查神经节内 Fluo-4 的加载情况，选择健康的神经节进行成像。不健康或受损的神经节会表现出自发荧光或点状形态，不应用于成像。</li>
	<li>选定神经节后，将光路转向相机，使用图像采集软件获取实时图像。确保神经节处于焦点位置，并设置图像采集速率和曝光时间。 
	注意：图像采集速率和时长将根据研究人员希望记录的事件而有所不同。对于大多数实验，传统上胶质细胞的图像采集频率为 0.5–1 Hz，而神经元可达 2–10 Hz，因为胶质细胞的 Ca2+ 反应不如Ca迅速2+ 神经元中的瞬时反应</li>
	<li>开始实验，并建立30秒的基础活动水平。</li>
	<li>使用重力流灌注系统，以2-3 ml/min的流速灌注预热的目标药物（如受体激动剂和拮抗剂）。在给予激动剂/拮抗剂后，恢复正常缓冲液灌注，并给予至少10分钟的洗脱/恢复期。 
	注意：药物施加时间将根据具体化合物和实验设计而有所不同。通常情况下，施加激动剂20-30秒足以激活神经元和胶质细胞中的G蛋白偶联受体。然而，配体门控离子通道（如烟碱型乙酰胆碱受体）的施加时间不应超过5-10秒，更长时间会导致配体门控离子通道快速脱敏。拮抗剂则应施加约3-15分钟，以确保受体通路的完全阻断。但上述仅为粗略概括，研究者应在各自的具体实验范式中对所用药物进行优化。</li>
	<li>停止录制并查看实验的时间序列视频。使用合适的图像分析软件仔细选择感兴趣区域（ROI）。</li>
	<li>使用软件将 ROI 的荧光强度与其初始基线荧光值进行归一化并比较。归一化荧光强度的变化与 [Ca2+].
	<ol>
		<li>采用先前描述方法的一种改进方案 26 使用 ΔF/F = ((F1− F0)/F0)ROI − ((F1− F0)/F0)背景，其中 F1 为任意给定时间点的荧光强度，F0 为基线荧光强度，以提高评估的准确性。该修正有助于降低因肠肌层运动导致的肌间神经丛组织制备中荧光变化所产生的噪声。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本文所述的方法为有效研究肠神经系统（ENS）中的神经元和肠胶质细胞提供了一致的途径。尽管在培养条件下对神经元和肠胶质细胞进行成像已为了解单个细胞的功能提供了大量信息，但在其天然的多细胞环境中研究这些细胞对于理解其生理学和病理生理学至关重要。荧光显微镜技术是评估ENS中细胞间多向相互作用的关键方法。通过将ENS细胞负载特异性荧光标记物，并结合高分辨率显微镜成像，可实现对ENS细胞活动的定量观察。对ENS活体组织样本的成像操作相对快速，并能产生大量深入的功能与空间数据。本实验所用的小鼠肌间神经丛和黏膜下神经丛标本适用于分子和遗传操作手段。在全层标本中进行Ca2+成像，为评估神经元-胶质细胞相互作用提供了有力工具。
在高级实验范式中，可联合使用多种探针以获取细胞内不同事件的信息。如果使用适当的荧光标记物，荧光显微镜能够记录到特定分子对比度增强的图像。选择Fluo-4是因为其具有较大的动态范围。在肠神经系统（ENS）中使用乙酰氧基甲酯（AM）染料时，充分的孵育时间至关重要。染料浓度和负载方法可能需要调整以获得最佳结果。理想的样本应负载足够的染料以观察荧光变化，但又不能过量，以免染料螯合目标离子并干扰细胞内信号传导。应限制样本暴露于荧光光源的时间，以防止细胞光毒性和染料光漂白。
研究人员在进行本实验的多个步骤时必须格外小心，尤其是溶液和组织的制备。在处理和解剖肠神经系统（ENS）组织时需特别谨慎，以维持细胞功能。胃肠道包含多层结构和多种组织类型，这为全层制备样本的解剖和成像质量带来了挑战27。此外，肌间神经丛（MP）的纤维束连接更宽，神经节比黏膜下神经丛（SMP）更大2。与黏膜下神经丛相比，肌间神经丛的神经元密度更高28。缓慢或不精确的解剖操作将对神经丛制备的质量产生不利影响，从而影响实验的整体成功率。因此，使用洁净且无损伤的工具、熟练的操作技巧以及良好的手动灵活性对本实验操作至关重要。
在整体组织制备中，绘制感兴趣区域（ROI）时应谨慎操作，以准确评估目标细胞类型荧光强度变化的动力学特征和变化程度。由于神经节位于可收缩的肌层上，肠道运动引起的运动伪影是在成像过程中需要重点关注的问题 原位 成像。因此，在酶孵育后通过重新固定组织样本，并在缓冲液中添加药理学抑制剂（尼卡地平/东莨菪碱），可有效抑制这些运动干扰，从而实现清晰且可靠的图像采集。除了药理学和机械方法以防止组织移动外，近期研究还展示了应用先进的软件方法及细胞类型反应特征来校正记录中残余的组织运动，进而提高分析的准确性。 29尽管存在这些技术难题，该方法仍能提供生理相关条件，用于评估肠神经系统中神经元和肠胶质细胞的形态学特征和定量特性。

肠神经系统（ENS）由两个含有神经节的神经丛组成，嵌于消化道壁内 1这些肌层内的神经回路，即肌间神经丛（MP）和黏膜下神经丛（SMP），由神经元和肠胶质细胞组成图1) 2肠肌丛（MP）和黏膜下丛（SMP）分别调控胃肠道（GI）功能，如肠蠕动以及上皮细胞的吸收与分泌 3肠胶质细胞位于神经节内神经元附近，但也存在于连接纤维束及肠壁的神经节外区域 3,4肠胶质细胞最初被认为仅为神经元提供营养支持。然而，近期研究表明，神经元与胶质细胞之间的相互作用对肠神经系统（ENS）功能至关重要。 5,6例如，数据显示肠胶质细胞能够“感知”神经元活动 7 并调节神经元回路 6,8保护肠神经元免受氧化应激损伤 9 并能在损伤后生成新的肠神经元 10,11本技术综述中介绍的实验方案提供了一种简单且可靠的方法，用于研究神经元与肠胶质细胞之间复杂相互作用的机制，该方法基于 原位 细胞内 Ca2+ 成像
Ca2+ 是可兴奋细胞中普遍存在的信号分子，在神经系统突触信号传导事件中发挥着至关重要的作用12。神经元或肠胶质细胞的兴奋会引发胞质内Ca2+浓度升高，其途径包括通过允许Ca2+通透的通道内流，或由细胞内钙库释放Ca2+。利用荧光染料对神经元和胶质细胞中的Ca2+瞬变进行成像，是一种研究肠神经系统（ENS）功能结构与动态的成熟且广泛应用的技术13-17。Ca2+成像已被证明是研究完整胃肠道组织片段的重要工具，可用于阐明兴奋性在ICC起搏细胞网络18以及肠道平滑肌19,20中的传播机制。该技术使研究人员能够探测多种生理参数，并提供有关这些参数空间分布和时间动态的信息。通过使用膜通透性荧光指示剂及优化的染色方案，可实现对细胞高效且微创的染色21。这为在功能保持完整的组织样本中同时监测大量神经元和肠胶质细胞提供了可能14-16,22，也可用于活体（in vivo）研究23。整体组织标本可通过浸染法负载高亲和力的Ca2+指示剂染料（如Fluo-4），该染料在结合Ca2+后荧光强度增强。荧光变化由CCD相机记录，并进行数字化分析6。Ca2+成像技术的发展为实时监测神经元与胶质细胞之间的相互作用、对各种刺激的反应性，以及这些细胞类型在胃肠道生理过程中的参与提供了契机。
原位 Ca2+ 成像技术为肠神经元和胶质细胞的信号传导机制提供了深入见解，相较于细胞培养模型具有多项显著优势 6,24首先， 原位 制备物可维持神经元和胶质细胞的天然基质环境，并基本保留其与靶组织连接的完整性。其次，与体内情况相比，培养的肠胶质细胞的遗传特性及形态结构发生显著改变。 体内 6,24第三，原代细胞培养中许多异质性相互作用会丢失，这限制了对细胞间相互作用的评估。尽管培养的细胞适用于研究基本特性，但其在研究肠胶质细胞与神经元之间复杂相互作用方面的应用受到限制。使用原代培养系统研究神经元-胶质细胞相互作用时存在诸多局限性。 原位 该方法在生理学上更具相关性，因为突触通路保持完整 25与细胞培养方法相比，一种 原位 该方法为系统性理解神经元与肠胶质细胞之间复杂相互作用提供了更优条件。此外，神经节丛在整体组织标本中的平面排列结构非常适用于对细胞内 Ca²⁺ 进行荧光成像2+ 瞬变现象，该技术为评估肠神经系统中的神经元-胶质细胞活动提供了一种简便的方法。

<table><tbody><tr><td>气泡停止注射器加热器&amp;nbsp;</td><td>AutoMate Scientific</td><td>10-4-35-G</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>C3306</td><td></td></tr><tr><td>胶原酶 II 型，粉末</td><td>Gibco</td><td>17101-015</td><td></td></tr><tr><td>分散酶</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>42613-33-2</td><td></td></tr><tr><td>解剖工具</td><td>Roboz&amp;nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5879</td><td></td></tr><tr><td>固定式显微镜</td><td>Olympus&amp;nbsp;</td><td>BX51WI</td><td></td></tr><tr><td>Fluo-4 AM 染料</td><td>Invitrogen</td><td>F-14201</td><td></td></tr><tr><td>葡萄糖</td><td>Sigma</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>昆虫针</td><td>Fine Science Tools</td><td>Minutien Pins</td><td></td></tr><tr><td>iQ 活细胞成像软件</td><td>Andor</td><td>Andor iQ3</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>M9272</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>S8282</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>S6014</td><td></td></tr><tr><td>Neo sCMOS 相机</td><td>Andor</td><td>Neo 5.5 sCMOS</td><td></td></tr><tr><td>硝苯地平</td><td>Sigma</td><td>N7510</td><td></td></tr><tr><td>灌流室</td><td>定制</td><td></td><td></td></tr><tr><td>蠕动泵</td><td>Harvard Apparatus</td><td>Model 720</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-127&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>P3000MP</td><td></td></tr><tr><td>丙磺舒</td><td>Molecular Probes</td><td>P36400</td><td></td></tr><tr><td>东莨菪碱</td><td>Sigma</td><td>S1013&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Sutter Lambda DG-4</td><td>Sutter</td><td>DG-4</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard&amp;nbsp;</td><td>Dow Corning</td><td>184</td><td></td></tr><tr><td>温度控制器</td><td>Warner Instruments</td><td>TC-344C</td><td></td></tr></tbody></table>

原位 ca2+ 成像技术用于肠神经系统研究

In Situ Ca2+ Imaging of the Enteric Nervous System

肠道的反射行为由肠神经系统（ENS）控制。ENS 是位于肠壁内两个含有神经节的神经丛中、由神经元和胶质细胞组成的整合性网络。肠神经元和肠胶质细胞是肠神经节内仅有的两种细胞类型。肠神经元和胶质细胞的活动负责协调肠道功能。本方案描述了通过荧光指示剂染料成像细胞内钙离子（Ca2+）瞬变，以观察完整 ENS 内神经元和胶质细胞活动的方法。我们的技术讨论重点介绍对啮齿类动物肠管肌间神经丛整体装片进行 Ca2+ 成像的方法。使用高亲和力 Ca2+ 指示剂（如 Fluo-4）对 ENS 整体装片进行批量负载，可实现对单个神经元或胶质细胞中 Ca2+ 反应的测量。这些反应可被重复且可靠地诱发，从而允许使用药理学工具进行定量研究。ENS 细胞中的 Ca2+ 反应通过配备冷却电荷耦合器件（CCD）相机的荧光显微镜进行记录。利用整体装片 Ca2+ 成像获得的荧光测量结果，为表征肠神经元和胶质细胞中 Ca2+ 反应的机制及其潜在功能意义提供了简便的方法。

正确使用该技术可使研究人员准确测量细胞内 Ca2+ [Ca2+]i 全组织标本中肠神经元和胶质细胞的瞬时钙信号。一个激动剂诱导的Ca2+ 小鼠结肠肌间神经丛中胶质细胞的反应如图所示 视频 1以下结果旨在展示我们使用该方法获得的一些代表性结果。首先， 图2 展示了一项测量肠胶质细胞内[Ca2+]i 对豚鼠结肠纵行肌间神经丛（LMMP）组织标本在ATP刺激下[Ca2+]i变化的响应。具体而言，该图展示了上述实验方案的正确分析方法，包括所分析的肌间神经节轮廓及星号标记的肠神经元位置。这些结果还说明了100微摩尔ATP在[Ca2+]i动员中的最佳剂量效应。2+]i 在豚鼠肠肌间神经胶质细胞中。该反应可用于校准肠神经胶质细胞的刺激强度，并标准化对测试刺激的反应。接下来， 图3 阐明了如何正确选择围绕胶质细胞的感兴趣区域（ROIs），图中以黄色圆圈标示。这些结果还展示了基础条件下以及对药理学刺激响应时所需的荧光变化。最后， 图4 展示了选择肠胶质细胞和神经元进行[Ca2+整体装片中的 i 型反应。
<img alt="显示神经节、胶质细胞、神经元以及肌间神经丛和黏膜下神经丛层次的神经通路示意图。" src="/files/ftp_upload/52506/52506fig1highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图1"> 
图1. 肠神经系统（ENS）的结构组成。 肠神经系统包含两个主要的神经节丛：肌间神经丛位于纵行肌层与环形肌层之间，黏膜下神经丛则位于黏膜层与环形肌层之间。肠神经系统仅由神经元和肠胶质细胞构成。神经纤维束连接各个神经节。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52506/52506fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="显示ATP反应的神经元网络荧光显微图像；包含强度变化图。" src="/files/ftp_upload/52506/52506fig2highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 2"> 
图 2. 豚鼠结肠肌间神经丛中的肠胶质细胞在原位对ATP产生反应in situ。（A）在基础条件下，肌间神经节（由虚线标出）中的Fluo-4荧光。箭头指向较粗的神经节间纤维束。（B）用100 μmol/L ATP刺激后，胶质细胞（而非神经元）迅速增加Fluo-4荧光，表明其细胞内钙离子浓度[Ca2+]i升高。请注意，产生反应的细胞体积较小，并围绕着明显更大的神经元（由星号标记的暗区）。（C）肠胶质细胞对ATP的反应呈剂量依赖性，其中1 mmol/L ATP可引发最大反应24。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52506/52506fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="荧光显微镜图像及显示ATP诱导的细胞反应的图表，微孔板读数分析。" src="/files/ftp_upload/52506/52506fig3highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图3"> 
图3. 结肠肌间神经丛中表达S-100-GFP的小鼠细胞对ATP产生反应（原位）。 (A) 小鼠结肠肌间神经节中的S-100-GFP+胶质细胞（绿色，虚线轮廓标示神经节范围）。神经节内围绕胶质细胞的六个感兴趣区域（ROIs）以黄色圆圈显示。箭头指示进入神经节的粗大纤维束。星号标注了两个肠神经元的位置。 (B) 同一神经节在基础状态下Rhod-2荧光信号的图像。 (C) 经100 μmol/L ATP刺激后，胶质细胞[Ca2+]i升高，表现为Rhod-2荧光增强。 (D) 对应于A–C图中各ROI的荧光强度变化轨迹。 (E) D图中6个ROI反应的平均值（均值±标准误）24。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52506/52506fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="随时间变化的神经活动；荧光成像，神经元-胶质细胞相互作用，钙反应图谱。" src="/files/ftp_upload/52506/52506fig4highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 4"> 
图 4. 原位成像观察肠神经元与胶质细胞间的通讯。（A）一项钙离子（Ca2+）成像实验的代表性图像（伪彩显示），实验中使用神经元P2X7受体激动剂BzATP（100 μM，30秒）刺激肌间神经丛全层铺片标本。注意，该神经元激动剂引起神经元内Fluo4荧光增强（A’）的时间早于其周围的肠胶质细胞（A”）。（B）应用神经元激动剂BzATP后，胶质细胞（蓝色）和神经元（红色）荧光随时间变化的分析结果。（C）在正常缓冲液（实线）以及含低浓度Ca2+和Mg2+的缓冲液（虚线）中，神经元和胶质细胞对BzATP的反应，后者用于增强神经元P2X7受体活性13。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52506/52506fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
视频 1. 肠胶质细胞中原位激动剂诱导的 Ca2+ 反应。体内 该视频显示了小鼠远端结肠肌间神经丛的一个神经节，其细胞已加载 Ca2+ 指示剂染料 Fluo-4。如图所示，将胶质细胞激动剂 ADP 加入灌流液中。ADP 引发肠胶质细胞内 Ca2+ 浓度升高，表现为 Fluo-4 荧光信号的瞬时增强。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52506/JOVE.mp4" target="_blank">请点击此处观看该视频。</a>

肠神经系统（ENS）是位于肠壁内、控制肠道反射的一组神经元和胶质细胞网络。本方案描述了利用钙离子（Ca2+）成像技术在活体 ENS 标本中记录肠神经元和胶质细胞活性的方法。

原位 Ca2+ 成像技术用于肠神经系统研究

肠道的反射行为由肠神经系统（ENS）控制。ENS 是由分布在肠道壁内两层之间的神经元和胶质细胞构成的一个整合性神经网络……

本实验的总体目标是利用荧光钙离子指示剂染料，对活体肠组织全层标本中的肠神经元和胶质细胞活动进行成像。首先从动物体内切除一段肠组织，并将其置于预热的培养基中。第二步是沿肠系膜缘将肠组织剪开，然后在轻微张力下将其平铺并用针固定，使黏膜面朝上。通过显微解剖制备肠肌间神经丛的全装片，并将其置于成像培养皿中。接着，将全装片在孵育箱中用荧光指示剂染料Fluo-4进行负载。最后，使用配备高分辨率相机的荧光成像显微镜对负载后的样品进行成像，该相机由图像采集与分析软件控制，用于记录基础活动状态。然后加入待研究的药物，并记录神经元和胶质细胞中的钙瞬变。最终在原位进行。通过肠神经系统钙成像，研究神经元和胶质细胞的细胞活动如何参与调控生理状态下的肠道功能，以及在肠道病理生理过程中肠神经系统功能障碍的机制。该技术的应用前景在于，通过一种简单且可靠的方法来研究神经元与肠胶质细胞之间的复杂相互作用，从而促进对功能性肠病和炎症性肠病的生理学及病理生理学的理解。本实验所采用的神经元-胶质细胞双钙成像技术将由我实验室的 David 免费向科学界提供。以下涉及实验动物组织的操作均符合 2013 年美国兽医协会（A VMA）关于动物安乐死的指南，并已事先获得密歇根州立大学动物护理与使用委员会（I-A-C-U-C）的批准。按照批准的程序实施动物安乐死后，将动物置于仰卧位，并用 70% 乙醇清洁腹部皮肤。用镊子在腹中线处夹起腹壁皮肤，然后使用手术剪沿腹中线做一条长约六厘米的正中切口，以暴露腹腔内的消化器官。接着，使用钝头镊子在腹膜内定位并暴露结肠。用剪刀剪断回盲部肠系膜，并开始分离肠道。当肠道充分分离后，于盲肠远端和直肠近端处切断结肠，以制备大肠样本，本视频将对此进行展示。然后迅速取出肠段，放入含有 DMEM/F12 培养基的烧杯中，该培养基中添加了3 µM盐酸尼卡地平和1 µM东莨菪碱，并置于冰上。加入这些抑制剂可使肠道平滑肌麻痹，从而有利于后续的显微解剖和成像。取所需肠段中长约4至6厘米的小段，置于盛有预冷添加培养基的Sylgard包被培养皿中。然后用昆虫针固定肠段的近端和远端，并沿系膜缘作一直线纵向切口以打开肠管。接着将组织平铺，黏膜面朝上，在轻微张力下用大头针固定，然后用5号精细镊子轻轻提起黏膜层，再用极精细的弹簧剪在其下方仔细分离并去除黏膜层。将组织剪成约0.5厘米见方的小片，每一片放入含有补充培养基的成像皿中，并置于冰上。用大头针将每个标本的四个角固定，使环形肌层朝上。用精细镊子小心地分离并去除环形肌。为暴露肌间神经丛，避免过度拉伸，将成像培养皿放回冰上，并更换每皿中的溶液为新鲜的添加补充物的培养基。接下来，将培养皿从冰上取出，向每个培养皿中加入2毫升酶混合液，在室温下孵育，气体条件为5%二氧化碳和95%空气，孵育15分钟。最后，用培养基清洗组织样本3次，并在低光照条件下操作，以避免光漂白；每份样本加入1.5毫升补充培养基，1.2微升250毫摩尔的Probit储备液，以及1.5微升4毫摩尔Fluro-4储备液，配制成总体积约为1.5毫升的Fluro-4染色液，加入成像用培养皿中，随后在37摄氏度的避光孵育箱中孵育45分钟。从孵育箱中取出培养皿后，用培养基清洗样本3次。然后加入含有 200 微摩尔丙酸的新鲜培养基，以增强神经元标记，并如前所述孵育 15 分钟。孵育期间，根据方案书面部分的说明配制改良 Krebs 缓冲液，并加入 3 微摩尔尼卡地平和 1 微摩尔东莨菪碱，以抑制肌肉收缩。在钙离子（Ca²⁺）成像和整体装片解剖过程中，将记录室置于荧光显微镜下，并使用重力灌流系统配合多个加热注射器储液器进行操作。以37摄氏度的Krebs缓冲液建立每分钟2至3毫升的连续灌注流速。确保在连接至真空捕集装置的输入管路和吸液管路中均防止气泡形成。在明场照明下将目标神经丛调至焦点清晰。避免过度曝光组织，以免导致荧光漂白。检查神经节内 flu oh four 的加载情况，并选择健康的神经节进行成像。不健康或受损的神经节会表现出自发荧光或点状形态，不应用于成像。选定神经节后，将光路转向相机并获取实时图像。使用图像采集软件，确保神经节处于焦点位置，并设置图像采集速率和曝光时间。图像采集的速率和时间取决于研究人员希望记录的事件类型。对于大多数实验，传统上胶质细胞的图像采集频率为0.5至1赫兹，最高可达2至10赫兹。对于神经元，由于胶质细胞的钙瞬变不像神经元的钙瞬变那样迅速，因此在无实验刺激的条件下，开始记录并建立所选神经节30秒的基础生理活动。随后根据所用药物的优化方案，通过重力灌流系统以每分钟2至3毫升的流速施加预热的目标药物，例如受体激动剂和拮抗剂。停止记录并查看实验的时间推移录像。使用合适的图像分析软件仔细选择感兴趣区域（ROI）。最后，使用适当的成像软件将感兴趣区域的荧光强度相对于其初始基线值进行归一化并比较。归一化荧光的变化与钙离子浓度的变化成正比。以下三幅图像表明，豚鼠肠胶质细胞在原位对TP有反应。在基础条件下，可见由虚线标示的较低水平的Fluo-4荧光。箭头所指为在100 µmol/L ATP刺激下，胶质细胞（而非神经元）迅速增加Fluo-4荧光，表明钙离子浓度升高。注意，发生反应的细胞体积较小，围绕着由星号标记的深色区域所示的较大神经元。该直方图显示肠胶质细胞对 TP 的反应呈剂量依赖性，其中一毫摩尔每升可引发最大反应。本视频展示了一个来自小鼠远端结肠的肌间神经丛神经节，该神经节已加载钙离子指示剂染料 Fluo-4。在指定时间点向浴液中加入胶质细胞激动剂 ADP。去极化刺激（DP）可诱导肠胶质细胞内钙离子浓度升高，这可通过Fluo-4荧光信号的瞬时增强观察到。观看本视频后，您应能够充分理解如何利用钙成像技术准确地研究神经元与肠胶质细胞之间的复杂相互作用。在全层组织标本中表征钙反应的机制及其潜在的功能意义，需要进行精确的解剖操作，以获得理想的成像质量。在基于显微镜的技术中使用荧光标记和药理学刺激，可增强在这些细胞的天然多细胞环境中对其进行评估的效果。

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