蓝原生聚丙烯酰胺凝胶电泳（BN - PAGE）分析，从细胞裂解液多蛋白复合物

以下实验的总体目标是使用蓝色天然聚丙烯酰胺凝胶电泳表征细胞裂解物中的 MultiPro 复合物，与 SDS 页面相比，它允许在天然条件下分离蛋白质并保留蛋白质相互作用。这是通过透析细胞裂解物以去除多余的盐分来实现的，使样品适用于作为第二步的蓝色天然 Page 分离。裂解物应用于第一维蓝色天然页面，该页面在天然条件下根据其大小和形状分离蛋白质复合物。

接下来是第二个维度。执行变性 SDS 页面是为了将复合物细分为它们的各个成分。蛋白质可以通过 silver 或 kumasi 染色或 western 印迹进行可视化。

在下面的演示中，通过银染法检测分离的蛋白质，但是，将使用蛋白质印迹法。大家好，我是来自德国弗莱贝格 Max Plank 免疫生物学研究所分子免疫学系 Wolfgang Sharmel 实验室的 Brita Bloom。大家好，我是 Dina Fiala。

我也来自 Sham Lab。今天，我们将向您展示一种分析细胞裂解物中 MultiPro 复合物的程序。我们在实验室中使用该程序来研究多亚基膜受体的组成。

然而，在本视频中，我们使用 tic 蛋白酶体作为示例。那么让我们开始吧。在此过程开始之前，请按照书面方案中的说明准备所有缓冲液，并将其保持在 4 摄氏度。

收获 1000 万个 HEC 2 9 3 细胞，并在 4 摄氏度下以 350 倍 G 离心 5 分钟沉淀。然后用 1 毫升冰冷的 PBS 洗涤细胞沉淀，并使用离心沉淀洗涤过的细胞。重复此洗涤两次，然后将洗涤后的细胞沉淀重悬于 250 微升冰中。

冷蓝、天然裂解、缓冲，并将悬浮液在冰上孵育 15 分钟。孵育后，将活细胞在 4 摄氏度下以 13， 000 倍 G 离心 15 分钟，以去除不溶性物质。同时，使用加热的意大利面吸管的大直径侧在 1.5 毫升微量离心管的盖子上熔化一个孔。

然后将试管放在冰上冷却至 4 摄氏度。离心完成后，将裂解物转移到试管中，通过透析去除盐分。将 10 道尔顿截止透析膜放在开口管的顶部。

盖上盖子，擦掉任何伸出的多余透析膜。然后小心地密封盖子的侧面，密封后，将管子倒置并倒置放入 50 毫升锥形管中。以尽可能低的速度离心样品 10 秒。

在细胞培养离心机中，用冷蓝色天然透析缓冲液和磁力搅拌制备一个 100 mL 烧杯，每 100 μL 样品至少使用 10 mL 蓝色天然透析缓冲液。然后用镊子从锥形管中取出倒置管。避免将管子正面朝上。

将带胶带的试管倒置在烧杯内，并去除瓶盖下方孔中的任何气泡。使用弯曲的移液器打开磁力搅拌，将样品放置 6 小时或在冷藏室中过夜以透析。偶尔检查样品，确保搅拌不会在透析膜上产生气泡。

孵育后，将透析细胞裂解物转移到新的冷冻微量离心管中，并将其置于冰上直至加载凝胶梯度。凝胶倾注在室温下使用梯度混合器完成。将梯度混合器放在搅拌板上，并将其连接到一根柔性管上。

使用阀门关闭梯度混合器的通道，然后用夹子关闭管道。将磁力搅拌器放入连接到管路的圆柱体中。接下来，将软管拧入蠕动泵中，并将注射器针头连接到其末端。

然后将针头放在凝胶装置顶部的两个玻璃板之间。制备 4% 和 15% 分离凝胶溶液，使组合体积等于分离凝胶处的体积。在前面立即添加 PS 和 TM me。

使用凝胶溶液并将其倒入梯度混合器的相应圆筒中。然后打开并打开阀门。按压左气缸，将连接两个凝胶储液槽的通道内的气泡挤出。

以每分钟 5 毫升的速度打开泵。取下夹具，让凝胶在玻璃板之间缓慢流动。当凝胶暂停时，慢慢抬起针头，确保针头始终高于液体。

让所有液体进入凝胶装置。然后用异丙醇轻轻覆盖液体，并用蒸馏水冲洗设备。让凝胶在室温下聚合至少 30 分钟。

接下来，准备 3.2% 浓缩胶，使用前立即添加 PS 和 TM me。将浓缩胶倒在分离凝胶上，将电泳梳引入玻璃板之间，避免气泡。浓缩胶聚合后，在上样前立即将凝胶冷却至 4 °C。

取下梳子，慢慢地将其与凝胶平面成一定角度拉出。这允许空气快速进入口袋，从而提高孔的质量，通过蓝色天然页面加载 20 微升铁蛋白标记物和 40 微升透析裂解物到干孔中分离透析细胞裂解物 在 4 摄氏度下，空泳道中填充等体积的透析缓冲液。然后用冷阴极缓冲液覆盖每个孔中的样品。

用冷阴极缓冲液填充内腔，用冷阳极缓冲液填充 ALSA 腔室。在 4 摄氏度下工作并施加 100 伏特电压，直到样品进入分离凝胶。然后将电压增加到 180 伏特，并运行凝胶，直到芯片前端到达凝胶的末端。

运行需要 3 到 4 小时。对于第二维 SDS 页面，准备具有单个大泳道的标准 10% SDS 凝胶。一个泳道用于分子量标准品，一个泳道用于等分试样的透析裂解物对照品，该泳道已与 SDS 样品缓冲液混合并在 95 摄氏度下煮沸 5 分钟，从电泳仪中取出板中的蓝色天然页面凝胶，然后轻轻撬起一个板。

去除浓缩凝胶并切掉含有目标蛋白质的蓝色天然页面凝胶的泳道。将蓝色非变性页面凝胶切片放入 SDS 样品中，缓冲并在孵育后在摇床上在室温下孵育 10 分钟。将凝胶片在微波炉中短暂煮沸，然后再孵育 15 分钟。

在摇床上的 SDS 样品缓冲液中，取下 SDS 凝胶的梳状物，将一些 SDS 缓冲液填充到孔中，将蓝色天然页面凝胶切片加载到 SDS 凝胶的大孔中。避免气泡。您可能需要使用镊子寻求帮助，因为凝胶切片必须正好在浓缩凝胶上。

用 SDS 样品缓冲液覆盖切片，然后加载标记物和裂解物对照。根据标准方案进行电泳和蛋白质转印。要解释结果，重要的是要知道蛋白质在第二维蓝色天然 SDS 页面中的位置提供了蛋白质是否是 MultiPro 复合物的一部分的证据。

由于第一维中的梯度凝胶，单体蛋白将沿双曲线对角线迁移，而在第二维中作为线性凝胶，MultiPro 复合物的亚基将在对角线下方形成一条垂直线。如果某种蛋白质是不同复合物的一部分，则会在水平线上检测到多个点。总之，二维蓝色天然页面 SDS 页面方法可以确定 MultiPro 复杂成分的大小和相对丰度。

在该演示中，通过 western blotting 检测到几个蛋白酶体或亚基。亚基 beta 2 和 MCP 21 可以被检测为垂直排列的单个点，表明它们是相同复合物的一部分。PA 28 与 beta 2 和 CP 21 位于一条垂直线上，因此属于同一复合物的一部分。

当查看水平线时，可以看到 beta 2 和 MCP 21 是三个不同复合物的一部分。PA 28 仅存在于其中一种复合物中。因此，这些 MultiPro 复合物可以鉴定为 20 成功蛋白酶体 20 s 蛋白酶体。

我们刚刚单独使用 P 28 和 20 S 蛋白酶体向您展示了如何使用蓝色天然页面从细胞裂解物中分离和表征天然 MultiPro 复合物。执行此程序时，请务必记住仔细透析样本。为避免与 SDS 接触并始终在 4 度下工作，我们建议比较不同的去污剂进行细胞裂解，以实现电机的完整性、漂亮的复合物和最佳溶解。

就是这样。感谢您的观看，祝您的实验好运。我进来。