多聚体-PAGE：一种用于捕获和解析生物样品中蛋白质复合物的方法

本实验方案的总体目标是使研究人员能够通过聚丙烯酰胺凝胶电泳捕获、分离和分析从组织裂解液中提取的天然蛋白质复合物。该方法有助于蛋白质研究，因为它能够在接近天然的条件下稳定原本不稳定的蛋白质相互作用，从而实现对这些复合物的鉴定和后续分析。该技术的主要优势在于其使用了常见的生物学方法，因此具有广泛的适用性，并可根据不同研究人员的具体研究目标进行调整。

开始此实验步骤时，按照文本方案中的说明准备进行蓝色天然聚丙烯酰胺凝胶电泳。将电极连接至电源，以150伏电压在凝胶中电泳分离蛋白质，直至染料条带进入分离胶约两厘米处。此时，停止电泳并断开电源。

拆卸电泳装置后，分离凝胶盒的玻璃板。移除并丢弃浓缩胶层。仔细在染料前沿底边下方切割凝胶，注意使切口尽可能平滑且笔直。

然后，弃去未使用的凝胶部分。修剪掉凝胶条边缘未使用的部分。将凝胶条小心放入盛有10毫升磷酸盐缓冲液的小容器中，轻轻振荡30分钟，使其充分平衡。

平衡后，弃去 PBS 并更换为另外 10 毫升 PBS。将 500 微升溶于二甲基亚砜中的 25 毫摩尔 DSP 加入 PBS 中，继续以之前的方式混匀 30 分钟。30 分钟后，倒出 DSP 溶液。

加入10毫升含2%十二烷基硫酸钠的0.375摩尔盐酸溶液（pH 8.8），以淬灭未反应的DSP。继续孵育15分钟。在胶条淬灭的同时，根据标准方法配制SDS-PAGE凝胶溶液。

不要加入聚合试剂。淬灭后，将蓝色天然凝胶条恢复至室温，并将其嵌入新的凝胶板中。操作时，小心拿起凝胶，将其放置在干净的凝胶板间隔片上。

将胶条方向调整为其先前方向的翻转状态，使染料前沿的底部最接近新胶盒的顶部。放置胶条时，使其上边缘与盖板上边缘所在位置对齐。确保染料前沿与玻璃板的水平边缘平行。

将切除的胶条一侧紧贴其中一个间隔条的壁，另一侧留出空间用于灌胶，并预留位置以加样蛋白标准品或蛋白ladder。如果胶条底边存在任何参差不齐或不平整的区域，应小心将其切除。胶条位置调整正确后，将覆盖板盖在间隔板上。

轻轻按压以排出任何滞留的气泡。按照制造商的说明继续组装凝胶灌注装置。在放置上层板时，凝胶条有时会发生移位。

可让胶条略微悬垂于上层板边缘，以便用刮勺调整位置，纠正任何偏移。将聚合试剂加入分离胶缓冲液中，用血清移液管将其倒入已准备好的胶板夹心中。加胶至胶板夹心，液面距切下的蓝色天然PAGE胶条底部约两厘米处，以留出空间用于后续的浓缩胶层。

然后，向已倒入的分离胶上层加入 100 微升正丁醇，静置 30 分钟以使分离胶层充分聚合，随后吸去正丁醇。接着，将聚合试剂加入浓缩胶溶液中。使用刻度移液管将浓缩胶溶液倒入胶板夹心中，填充所有剩余的空隙。

倒入浓缩胶时，倾斜胶板，使其填充胶条下方的空间，避免产生气泡。当浓缩胶缓冲液逐渐填满胶条下方的空隙时，将胶板缓慢恢复至水平位置。继续用浓缩胶缓冲液填充切去胶条后旁边的空隙，直至接近溢出为止。

然后，让浓缩胶层聚合30分钟。浓缩胶层聚合完成后，将凝胶板从制胶装置中取出，用蒸馏水冲洗，并根据制造商的说明组装电泳装置。用1× SDS-PAGE电泳缓冲液完全充满内槽。

然后，将外层室加液至制造商指定的刻度。在切下的胶条旁的加样孔中加入蛋白质分子量标准品或合适的蛋白质标准品。将电极连接至电源，以 120 伏电压对样品进行电泳。

当考马斯亮蓝染料跑出凝胶时，停止电泳并断开电源。使用标准的电转移和基于抗体的蛋白质检测方法分析凝胶。此处通过免疫印迹展示多聚体PAGE的验证结果。

通过二硫苏糖醇切割捕获的驱动蛋白复合物，表明高分子量聚集体是由较小组分交联形成的。图中显示，用逐渐增加浓度的SDS或Triton处理脑裂解液后，单体α-突触核蛋白的检测信号增强，而可溶性寡聚体四聚体的检测信号减弱。此处展示了多聚体PAGE用于捕获大鼠脑裂解液中可溶性复合物的代表性结果。

通过免疫印迹检测蛋白质。每种蛋白质的预期单体分子量显示在泳道下方。同样，膜结合复合物的捕获情况也在此展示。

多聚体PAGE有时无法捕获到复合物，如SDHA呼吸复合物二印迹所示。有关此现象可能原因的讨论见文本方案部分。一旦掌握，该技术若操作得当，约需八小时即可完成。

观看本视频后，您应能够充分理解如何对天然蛋白质复合物进行凝胶内交联，随后通过二次SDS-PAGE进行凝胶重铸和分离。请务必注意，丙烯酰胺具有高度危害性，在制备凝胶时应穿戴个人防护装备。按照本方案操作后，分离并稳定的蛋白质复合物可从凝胶中洗脱或切取，并可根据研究人员的需求，通过多种方法进行分析，包括免疫检测或质谱分析。