多聚-PAGE:生物样品中的用于拍摄方法和解决蛋白复合体
May 5th, 2017
一种用于稳定和使用胺反应性蛋白交联剂偶联到一种新颖的二维聚丙烯酰胺凝胶电泳分离未修饰的组织裂解物天然蛋白质复合物的方法（PAGE）系统被呈现。
该方案的总体目标是使研究人员能够使用聚丙烯酰胺凝胶电泳捕获、分离和分析从组织裂解物中提取的天然蛋白质复合物。这种方法可以帮助研究人员研究蛋白质，因为它能够在接近天然的条件下稳定原本不稳定的蛋白质结合，从而允许对其进行鉴定和后续分析。该技术的主要优点是它使用常见的生物方法，因此适用范围广，可以根据研究人员个人的目标进行定制。
要开始此过程，请按照文本方案中的说明准备蓝色天然聚丙烯酰胺凝胶电泳。将电极连接到电源，并以 150 伏电压对凝胶中的蛋白质进行电泳，直到染料条带进入分离层约 2 厘米。此时，请停止并断开电源。
拆卸电泳仪后，分离凝胶盒的玻璃板。移除并丢弃堆叠层。小心地将凝胶切割到染料正面的底部边缘下方，注意使切割尽可能光滑和笔直。
然后，丢弃未使用的凝胶。修剪掉凝胶条边缘任何未使用的部分。小心地将试纸条放入小容器中的 10 毫升磷酸盐缓冲盐水中，然后按记法轻轻混合 30 分钟以达到平衡。
平衡后，丢弃 PBS 并用另外 10 毫升替换。将 500 微升溶于二甲基亚砜的 25 毫摩尔 DSP 移液到 PBS 中，然后像以前一样继续混合 30 分钟。30 分钟后，倒出 DSP 溶液。
在 10 毫升 0.375 摩尔 HSCL 浓度 （pH 值为 8.8） 中，含有 2% 十二烷基硫酸钠，用于淬灭未反应的 DSP。继续书写 15 分钟。当凝胶条淬灭时，根据标准方法制备 SDS-PAGE 凝胶溶液。
请勿添加聚合试剂。淬灭后，将蓝色天然凝胶联排层返回室温，并将联排管浇铸到新的凝胶盒中。为此，请小心地拾取凝胶并将其放在干净的凝胶盒间隔板上。
调整条带的方向，使其从之前的方向翻转，并且染料前沿的底部最靠近新色盒的顶部。放置条带，使其顶部边缘与盖板的顶部边缘所在的位置齐平。确保染料正面与玻璃板的水平边缘平行。
将切除的试纸条的一侧推向其中一个间隔壁，在另一侧留出空间，以便注入凝胶和加载蛋白质标准品或分子量标准品。如果凝胶条的底部边缘包含任何锯齿状或不均匀的区域，请小心地将其切掉。凝胶条正确定位后，将盖板放在垫片板上。
轻轻按压以推出任何滞留的气泡。根据制造商的说明继续组装凝胶倾倒装置。放置顶板时，凝胶条有时会移动。
让条带稍微悬在顶板的边缘会有所帮助，这样就可以用刮刀进行调整以纠正任何偏移。将聚合试剂添加到分离凝胶缓冲液中，并使用血清移液管将其倒入准备好的凝胶盒中。将凝胶盒填充至切除的蓝色非变性 PAGE 凝胶条下方约 2 厘米处，为堆积层留出空间。
然后，在倒入的凝胶顶部加入 100 μL 丁醇，并等待 30 分钟使分离层聚合，然后再倒出丁醇。接下来，将聚合试剂添加到浓缩胶溶液中。使用血清移液管，倒入堆积层以填充凝胶盒中所有剩余的空白空间。
倒入浓缩层时倾斜凝胶盒，使其充满凝胶条下方的空间，并且不会捕获气泡。当浓缩凝胶缓冲液填充凝胶条下方的空白空间时，逐渐将凝胶盒放回水平位置。继续用浓缩凝胶缓冲液填充切除的凝胶条旁边的空白空间，直到它几乎溢出。
然后，让堆积层聚合 30 分钟。堆积层聚合后，从浇注装置中取出凝胶盒，用蒸馏水冲洗，然后根据制造商的说明组装电泳装置。用 1x SDS-PAGE 运行缓冲液完全填充内腔。
然后，将外腔填充至制造商指示的水平。用分子量标准或适当的蛋白质标准品加载切除的凝胶条旁边的空间。将电极连接到电源，并以 120 伏电压对样品进行电泳。
当考马斯染料从凝胶上流出时，停止运行并断开电源。使用电印迹和基于抗体的蛋白质检测的标准方法分析凝胶。此处通过免疫印迹法显示了多聚体-PAGE 的验证。
捕获的驱动蛋白复合物被二phyo-3-itol 裂解，表明高分子量聚集体是通过交联较小的取代基形成的。如图所示，用浓度递增的 SDS 或 Triton 处理的脑裂解物增加了对单体 α-突触核蛋白的检测，同时降低了可溶性寡聚体四聚体的检测。这里显示了用于捕获大鼠脑裂解物中可溶性复合物的多聚体-PAGE 的代表性结果。
通过免疫印迹检测蛋白质。每种蛋白质的预期单体重量显示在泳道下方。同样，膜结合复合物的捕获也如图所示。
Multimer-PAGE 有时无法捕获复合物，如 SDHA 呼吸复合物双印迹所示。对此可能的解释的讨论可以在 text protocol 中找到。一旦掌握，如果执行得当，这项技术可以在大约八个小时内完成。
观看本视频后，您应该对如何对天然蛋白质复合物进行凝胶内交联，然后通过二级 SDS-PAGE 进行凝胶重铸和分离有一个很好的了解。不要忘记，使用丙烯酰胺可能非常危险，因此在灌注凝胶时应佩戴个人防护装备。按照此程序，分离的稳定复合物可以从凝胶中洗脱或切割，并且可以根据研究人员的需要通过多种方法进行分析，包括免疫检测或质谱分析。
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概述
本协议介绍了一种使用新型二维聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）系统从组织裂解液中稳定和分离天然蛋白质复合物的方法。它允许在近天然条件下分析蛋白质关联。
关键研究组成部分
科学领域
- 生物化学
- 蛋白质组学
- 电泳
背景
- 理解蛋白质复合物对许多生物学研究至关重要。
- 天然蛋白质关联可能不稳定且难以分析。
- 常见的生物学方法促进了这种技术的应用。
- 该方法允许针对蛋白质分析采用定制方法。
研究目的
- 捕获并分析组织裂解液中的天然蛋白质复合物。
- 稳定蛋白质关联以便于更好地识别。
- 为研究人员提供一种广泛适用的方法。
使用的方法
- 蓝色天然聚丙烯酰胺凝胶电泳的准备。
- 在150伏特下对蛋白质进行电泳。
- 监测凝胶中染料带的进展。
- 使用胺反应性蛋白交联剂。
主要结果
- 成功稳定天然蛋白质复合物。
- 在组织裂解液中有效分离蛋白质。
- 在近天然条件下识别蛋白质关联。
结论
- 该方法增强了蛋白质复合物的分析。
- 它适用于各种研究目标。
- 使用常见方法提高了研究人员的可访问性。
常见问题
Executive Industry Relevance
Multimer-PAGE enables biopharma R&D teams to stabilize and resolve native protein complexes from tissue lysates under near-native conditions, supporting target validation and mechanistic de-risking in early discovery. By preserving labile protein associations that are often lost in conventional purification, the method improves predictive confidence in pathway analysis and complex-based drug target identification. This approach enhances translational continuity from discovery through preclinical evaluation by providing reproducible, quantitative readouts of complex formation.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by capturing native protein interactions without perturbing non-covalent bindings.
- Operational Value: Uses accessible blue-native and SDS-PAGE techniques familiar to most molecular biology teams, reducing specialized training needs.
- Predictive Value: Supports functional target validation by stabilizing complexes for downstream identification via immunoblot or mass spectrometry.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates resolved complex profiles that can serve as quantitative biomarkers for assay standardization across screening campaigns.
- Operational Value: Relies on inexpensive, widely available reagents and equipment, enabling scalable implementation in core facilities.
- Assay Readiness: Produces SDS-PAGE-separated complexes compatible with downstream detection methods like immunodetection, supporting high-content screening integration.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Bridges discovery and preclinical workflows by preserving complex integrity for validation in disease-relevant systems.
- Mechanistic De-risking: Allows assessment of complex formation under varying conditions (e.g., detergent or SDS exposure), informing target robustness.
- Risk-Adjusted Advancement: Enables go/no-go decisions based on complex stability and abundance, reducing late-stage attrition due to mechanistic uncertainty.
Pipeline & Workflow Integration
Multimer-PAGE fits within the discovery continuum from target identification through lead optimization, providing a mechanistic bridge to preclinical validation by enabling analysis of native protein complexes in tissue-derived samples.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by capturing endogenous complexes from unmodified tissue lysates.
- Screening: Enables assay development through reproducible complex separation and detection, facilitating compound effect evaluation on target engagement.
- Analytics: Delivers quantitative separation of protein complexes via secondary SDS-PAGE, allowing comparison of conditions or treatments.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by maintaining complex stability for validation in disease models, supporting biomarker alignment.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable platform capability rather than a single-use assay, adaptable across multiple targets and disease areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in protein interaction networks.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization through standardized gel-based workflows and familiar electrophoresis techniques.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early de-risking of targets, minimizing investment in poorly validated mechanisms.
- Portfolio Impact: Informs risk-adjusted prioritization by providing direct evidence of complex formation and stability in native contexts.
Implementation Considerations
- Requires expertise in native PAGE and SDS-PAGE techniques, including gel casting and electrophoretic separation.
- Depends on access to electrophoresis apparatus, power supplies, and standard reagents such as DSP crosslinker and SDS.
- Necessitates cross-team standardization for consistent complex capture and detection across discovery and preclinical groups.
- Involves adaptation considerations for different tissue types and complex sizes, as separation efficiency may vary with molecular weight.
- Limited by challenges in resolving extremely large complexes and potential variability in crosslinking efficiency, as noted in source material.
