Name: 重叠肽库在蛋白质 Qa-1 表位中的映射 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-20T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 4 s
Description: 了解使用重叠肽库技术鉴定蛋白质Qa-1表位的方法。该技术通过设计15-mer重叠肽库刺激Qa-1限制性CD8 T细胞，为自身免疫病免疫治疗提供新策略，具有操作简便、应用广泛的优势。

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感谢 Penelope Garcia 在技术方面提供的帮助以及对本文手稿的准备工作。本研究得到了洛马林达大学医学院研究创新基金（RIG，编号 681205-2967）和国家多发性硬化症协会试点基金（PP1685）对 XT 的资助。

所有实验均按照德克萨斯大学埃尔帕索分校和洛马林达大学动物护理与使用委员会批准的机构动物护理与使用方案进行。
1. 生成覆盖蛋白质全长的OLP文库
<ol>
	<li>设计一个OLP文库，其中所有肽段均为15个氨基酸长度，相邻肽段之间重叠11个氨基酸。 
	注意：在MOG OLP研究中，通过以下链接从NCBI蛋白质数据库获取MOG前体蛋白[Mus musculus]的序列：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/NP_034944。使用包含信号肽和成熟肽的MOG前体（共247个氨基酸），因为大多数已报道的Qa-1（HLA-E）表位位于信号肽内（例如Qdm1）。从其N端开始，确定15-mer肽段的序列，使相邻两个肽段重叠11个氨基酸（图1）。因此，在247个氨基酸的MOG前体中恰好识别出59个OLP。然而，最后一个OLP的长度可根据蛋白质总长在12至15个氨基酸之间变动。此外，我们选择15-mer文库是因为我们及其他研究者已证明，当15-mer肽段被加入树突状细胞（DCs）或巨噬细胞时，可被有效加工成CD8+ T细胞识别的表位14,15。</li>
	<li>商业途径购买每种单独肽段。每种肽段5 mg足以用于筛选。OLP及截短肽（第6.1步）可使用脱盐肽（纯度约为50–70%）。用于四聚体构建及后续生物学分析的最优肽段（第6.2步）纯度应&#62;90%。在无菌条件下重悬肽段。</li>
	<li>用100% DMSO配制每种肽段的50 mg/mL单独母液。对于每种5 mg的肽段，向每个管中加入100 μL DMSO，混匀后于-20 °C保存。这些母液将用于制备OLP_pool母液，以生成对OLP_pool有反应性的CD8+ T细胞系。此外，这些母液还将用于制备10 mg/mL的单独肽段母液，以检测每种单独肽段刺激OLP_pool反应性CD8+ T细胞系产生Qa-1限制性应答的能力。</li>
	<li>将每种肽段等体积加入新管中，制备OLP_pool母液。该OLP_pool母液含100% DMSO。在MOG OLP研究中，共有59个OLP12，因此OLP_pool中每种肽段的浓度为847.46 μg/mL（50 mg/mL ÷ 59）。</li>
	<li>在V型底96孔板中，用无菌H2O将50 mg/mL母液稀释5倍，制备10 mg/mL的单独肽段母液（该母液含20% DMSO）。建议在96孔板中进行母液配制，因为后续将使用8通道或12通道多通道移液器在96孔板中检测每种单独肽段诱导Qa-1限制性应答的能力。 
	注意：所有肽段（包括OLP和截短肽）均应稀释于V型底96孔板或装有1 mL离心管的96孔样品架中，因为肽库筛选需使用多通道移液器在96孔板中进行。若某肽段难以溶解，可逐滴加入1 N NaOH以助溶解。</li>
</ol>
2. 使用 OLP_pool 负载的 Kb-/- Db-/- 树突状细胞（DCs）对 Kb-/- Db-/- CD8+ T 细胞进行初始激活。
注意：Qa-1 有两个主要等位基因：一个是 Qa-1a，另一个是Qa-1b由于学术研究中常用的动物 例如 C57BL/6 和 Balb/c 小鼠均携带 Qa-1b，本方案描述了Qa-1的定位步骤b 蛋白质中的表位。CD8+ 本方案中使用的T细胞是从K中纯化的b-/-Db-/- 小鼠（C57BL/6背景）中CD8+ T细胞主要受到包括Qa-1在内的非经典MHC-Ib分子的限制。
<ol>
	<li>按照先前所述方法制备骨髓来源的树突状细胞（DCs）12。
	<ol>
		<li>简言之，将骨髓单细胞悬液（1 × 106 个细胞/mL）接种于6孔板中（每孔4 mL），在含10 U/mL IL-4和100 U/mL GM-CSF的RPMI-10培养基（RPMI 1640补充10%胎牛血清、5.5 × 10-5 M 2-巯基乙醇、1 mM丙酮酸钠和0.1 mM非必需氨基酸）中，于37 °C、5% CO2条件下培养。</li>
		<li>两天后，小心移除非贴壁细胞，并加入新鲜培养基和细胞因子。</li>
		<li>再培养两天后，将含新鲜培养基和细胞因子的非贴壁细胞转移至新的6孔板中。</li>
		<li>继续培养两天，并补充含LPS（0.1 µg/mL）的新鲜培养基和细胞因子以激活DCs。</li>
		<li>24小时后，收集DCs用于实验。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用3000 Rads剂量辐照DCs。
	<ol>
		<li>或者，将DCs（5 × 107 个细胞/mL）在PBS中用丝裂霉素C（50 μg/mL）于37 °C处理20分钟。加入RPMI-0（无血清RPMI 1640）至总体积约12 mL，然后在台式离心机中以300 × g离心10分钟。弃去上清液，并重复洗涤两次。这三次洗涤至关重要，因为残留的微量丝裂霉素C可能抑制DC-T细胞共培养过程中CD8+ T细胞的反应。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将DCs重悬于无血清培养基（AIM-V无血清培养基补充5.5 × 10-5 M 2-巯基乙醇、1 mM丙酮酸钠和0.1 mM非必需氨基酸）中，调整细胞浓度至5 × 106 个细胞/mL。</li>
	<li>向DCs中加入含有100% DMSO的OLP_pool储备液，使终浓度为0.5% DMSO（稀释200倍）。在MOG OLP研究中，OLP_pool中每种OLP的浓度为847.46 μg/mL，因此每种OLP在DC培养中的终浓度为4.2 μg/mL（847.46 μg/mL ÷ 200）。然而，只要细胞培养中的DMSO浓度保持在1%以下，该OLP浓度可上调至100 μg/mL。</li>
	<li>将DCs在室温下孵育3小时，每15分钟轻轻振荡一次。</li>
	<li>在此孵育期间，使用商用CD8+ T细胞纯化试剂盒从Kb-/-Db-/-小鼠的脾脏或淋巴结中纯化CD8+ T细胞，并将其重悬于含50 U/mL白细胞介素2（IL-2）和100 U/mL IL-7的无血清培养基中，调整细胞浓度至10 × 106 个细胞/mL。</li>
	<li>现在，将CD8+ T细胞以每孔0.5 mL加入48孔板中（在步骤2.8中加入0.5 mL OLP_pool致敏的DCs后，CD8+ T细胞的终浓度为5 × 106 个细胞/mL）。 
	注意：可按照制造商提供的说明，使用CD8阳性分离试剂盒从小鼠脾脏和淋巴结中纯化CD8+ T细胞。所获得的CD8+ T细胞不含磁珠。</li>
	<li>在室温下离心收集OLP_pool致敏的DCs（300 × g，10分钟），用无血清培养基重悬至2 × 106 个细胞/mL，并以每孔0.5 mL加入含CD8+ T细胞的48孔板中（OLP_pool致敏DCs的终浓度为1 × 106 个细胞/mL，CD8+ T细胞的终浓度为5 × 106 个细胞/mL，IL-2终浓度为25 U/mL，IL-7终浓度为50 U/mL）。将细胞置于37 °C、5% CO2条件下培养。</li>
	<li>第4天，每孔移除并弃去约400 μL培养基，然后加入500 μL含100 U/mL IL-2和100 U/mL IL-7的新鲜无血清培养基。继续在37 °C、5% CO2条件下孵育细胞。</li>
	<li>第7或第8天，用OLP_pool再次刺激已由OLP_pool致敏的CD8+ T细胞。</li>
</ol>
3. 使用经OLP_pool致敏的巨噬细胞再次刺激已致敏的CD8+ T细胞
<ol>
	<li>四天前对OLP_pool致敏的CD8进行再刺激+ T细胞，制备2%（v/v）聚丙烯酰胺珠溶液：将2 g聚丙烯酰胺珠在20 mL无内毒素的H₂O中洗涤两次2O 或 PBS。通过离心（400 × g）5 分钟沉淀聚丙烯酰胺珠，然后重悬于 100 mL PBS 中。在 15 lb/in² 压力下高压灭菌 20 分钟。室温保存。</li>
	<li>向小鼠腹腔注射每只1 mL的无菌2%聚丙烯酰胺微球溶液，以诱导单核细胞/巨噬细胞向腹腔迁移16.</li>
	<li>四天后，通过 CO 处死动物2 过量用药
	<ol>
		<li>在无菌条件下，于腹部中央切开一个小口，切口大小以刚好能通过一支5 mL移液管为宜。用RPMI-0培养基充满移液管，然后通过切口将其插入腹腔内。</li>
		<li>用移液器冲洗腹腔，将腹腔内的液体尽可能吸出至无菌管中（这些为腹腔巨噬细胞）。重复冲洗步骤4至5次。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用3000 Rads照射腹腔巨噬细胞。
	<ol>
		<li>或者，用丝裂霉素C处理腹腔巨噬细胞（遵循步骤2.2中所述的操作程序）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将腹腔巨噬细胞的浓度调整至 5 x 106 细胞/mL，加入OLP_pool储存液（终浓度DMSO低于1%）和M-CSF（终浓度=100 U/mL）。 
	注意：在本项MOG OLP研究中，我们使用了0.5% DMSO。因此，MOG OLP_pool储备液被稀释了200倍（例如 将1 μL MOG OLP_Pool储备液加入199 μL腹腔巨噬细胞中，使每种OLP的终浓度为4.2 μg/mL。</li>
	<li>加入 200 μL/孔（1 × 106 细胞/孔）接种于48孔组织培养板中，37 °C孵育4小时。</li>
	<li>通过每孔加入 200 μL 预热的 RPMI-0 轻柔洗涤，去除未贴壁细胞和聚丙烯酰胺微珠。</li>
	<li>收集并合并经OLP_pool引物激活的CD8+ 来自步骤 2.10 的 T 细胞。调整 OLP_pool 初次刺激的 CD8+ T细胞浓度调整至1 x 106 细胞/mL，加入含有25 U/mL IL-2和50 U/mL IL-7的无血清培养基中，每孔1 mL加入已用OLP_pool致敏的腹腔巨噬细胞的48孔板中。</li>
	<li>四天后，更换48孔板中的培养基。吸出并弃去48孔培养板中约400 μL的培养液，每孔加入500 μL含100 U/mL IL-2和100 U/mL IL-7的新鲜无血清培养基。将细胞置于37 °C、5% CO₂条件下继续培养。2.</li>
	<li>三到四天后，检测经OLP_pool再刺激的CD8+ 通过酶联免疫斑点法（ELISPOT）检测针对OLP_pool特异性、Qa-1限制性应答的T细胞。此后，重新刺激CD8+ 每7至10天一次T细胞 
	注意：优先使用巨噬细胞对OLP_pool致敏的CD8进行再刺激+ T细胞。我们注意到CD8+ 巨噬细胞再刺激的T细胞比树突状细胞再刺激的生长更好 体外.</li>
</ol>
4. 在OLP_pool再刺激的CD8+ T细胞系中确定OLP_pool特异性、Qa-1限制性应答
注意：OLP_pool特异性的、受Qa-1限制的反应，在经OLP_pool再刺激的CD8+ T细胞系中，通过IFNγ ELISPOT实验检测其在C1R或C1R.Qa-1b细胞存在下受OLP_pool刺激后分泌IFNγ的情况来确定。C1R细胞可从商业途径获得。C1R.Qa-1b细胞可通过使用Qa-1慢病毒载体转导C1R细胞而获得。
<ol>
	<li>在 ELISPOT 板的孔中加入 100 μL/孔用包被缓冲液（PBS）稀释的捕获型抗 IFN-γ 抗体。密封后于 4 °C 过夜孵育。</li>
	<li>第二天，弃去含有捕获型抗 IFN-γ 抗体的包被缓冲液，每孔加入 200 μL 封闭液（无血清培养基），于室温孵育 2 小时。</li>
	<li>用 9,600 Rads 照射 C1R 和 C1R.Qa-1b 细胞。
	<ol>
		<li>或者，按照步骤 2.2 所述使用丝裂霉素 C 处理 C1R 和 C1R.Qa-1b 细胞，但处理时间为 30 分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将 C1R 和 C1R.Qa-1b 细胞用无血清培养基调整至 4 × 106 个细胞/mL。</li>
	<li>弃去板中的封闭液，每孔加入 50 μL（200,000 个细胞/孔）C1R 和 C1R.Qa-1b 细胞，并混匀。</li>
	<li>每孔加入 50 μL 用无血清培养基稀释 100 倍的 OLP_pool 储存液&#160;，充分混匀。于室温孵育 2–3 小时。</li>
	<li>将经 OLP_pool 再刺激的 CD8+ T 细胞用含 150 U/mL IL-7 的无血清培养基调整至 1–2 × 106 个细胞/mL，每孔加入 50 μL（50,000–100,000 个细胞/孔）。将板离心（58 × g）5 分钟。</li>
	<li>于 37 °C、5% CO2 条件下过夜孵育。</li>
	<li>吸去细胞悬液。每孔用去离子水（DI 水）洗涤 2 次（250 μL/孔），每次洗涤后浸泡 5 分钟。</li>
	<li>用洗涤缓冲液 I（含 0.05% Tween20 的 PBS）洗涤 3 次，每次 250 μL/孔，每次洗涤后浸泡 1 分钟。弃去洗涤缓冲液。</li>
	<li>每孔加入 100 μL 用稀释缓冲液（含 10% 胎牛血清（FBS）的 PBS）稀释的检测抗体。</li>
	<li>于室温孵育 2 小时。</li>
	<li>弃去检测抗体溶液。用 250 μL/孔的洗涤缓冲液 I 洗涤 3 次，每次洗涤后浸泡 1 分钟。</li>
	<li>每孔加入 100 μL 用稀释缓冲液按 1:100 稀释的酶结合物（链霉亲和素-HRP）。</li>
	<li>于室温孵育 1 小时。</li>
	<li>弃去酶结合物溶液。用 250 μL/孔的洗涤缓冲液 I 洗涤 4 次，每次洗涤后浸泡 1 分钟。</li>
	<li>用 250 μL/孔的洗涤缓冲液 II（PBS）洗涤 2 次。</li>
	<li>每孔加入 100 μL 底物溶液（将 1 滴 = 20 μL AEC 显色剂与 1 mL AEC 底物混合）。监测斑点显色 5 至 60 分钟。</li>
	<li>当出现理想结果时，用蒸馏水洗涤孔以终止底物反应。</li>
	<li>于室温下空气干燥 2 小时或过夜，直至完全干燥。移除板下方的塑料托盘有助于加快干燥。将板置于密封塑料袋中避光保存，直至进行分析。</li>
	<li>通过体视显微镜观察或使用 ELISPOT 板读数仪手动计数斑点。代表性结果见 图 2。</li>
</ol>
5. 在OLP_pool特异性的CD8+ T细胞系中，鉴定刺激Qa-1限制性IFN-γ分泌的OLP_pool中单个肽段
<ol>
	<li>使用上述描述的 IFN-γ ELISPOT 检测方法，确定在 OLP_pool 特异性的 CD8+ T 细胞系中能够刺激 OLP_pool 特异性、Qa-1 限制性的 IFN-γ 分泌的单个肽段（ELISPOT 检测中每种单个肽段的终浓度为 10 μg/mL）。代表性结果见图3。 
	注意：OLP 特异性、Qa-1 限制性反应的定义为：其反应强度至少为在 C1R.Qa-1b 细胞存在但无 OLP 时反应强度的三倍。在 MOG OLP 研究中，OLP68、OLP96 和 OLP105 均满足此标准，因此这三个 OLP 均可能含有 Qa-1 表位12（图3）。然而，OLP105 始终产生最强的反应，因此我们对 OLP105 进行了详细分析（图4 和 图5）12。</li>
</ol>
6. 在15肽重叠多肽中鉴定最佳Qa-1表位，该表位可刺激OLP混合物特异性的、受Qa-1限制的CD8+ T细胞系产生表位特异性应答
<ol>
	<li>合成如图4所示的15个氨基酸长度的OLP的C端和N端截短肽。</li>
	<li>通过使用上述IFN-γ ELISPOT实验方法，用各个截短肽以及亲本15-mer OLP分别刺激CD8+ T细胞，并在C1R或C1R.Qa-1b细胞存在的情况下，检测OLP特异性CD8+ T细胞系中IFN-γ的分泌情况。ELISPOT实验中每种单个肽段的终浓度为10 μg/mL。若某肽段满足以下条件，则被定义为最优Qa-1表位：1）在C1R.Qa-1b细胞存在时，其诱导的IFN-γ反应强度与原始15-mer肽段相当或更强，且结果具有一致性；2）肽段长度为8–10个氨基酸（优先为9-mer），符合MHC-I类分子结合的肽段长度特征15,17。参见图5中的代表性结果。</li>
</ol>

<ol><li>Aldrich, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+Tap-dependent+leader+peptide+recognized+by+alloreactive+T+cells+specific+for+a+class+Ib+antigen%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Identification of a Tap-dependent leader peptide recognized by alloreactive T cells specific for a class Ib antigen.</a> Cell. 79 (4), 649-658 (1994).</li>
<li>Vance, R. E., Kraft, J. R., Altman, J. D., Jensen, P. E., Raulet, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+CD94%2FNKG2A+is+a+natural+killer+cell+receptor+for+the+nonclassical+major+histocompatibility+complex+%28MHC%29+class+I+molecule+Qa-1%28b%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Mouse CD94/NKG2A is a natural killer cell receptor for the nonclassical major histocompatibility complex (MHC) class I molecule Qa-1(b).</a> J Exp Med. 188 (10), 1841-1848 (1998).</li>
<li>Oliveira, C. C., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20038604">The nonpolymorphic MHC Qa-1 mediates CD8+ T cell surveillance of antigen-processing defects.</a> J Exp Med. 207 (1), 207-221 (2010).</li>
<li>Nagarajan, N. A., Gonzalez, F., Shastri, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonclassical+MHC+class+Ib-restricted+cytotoxic+T+cells+monitor+antigen+processing+in+the+endoplasmic+reticulum%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Nonclassical MHC class Ib-restricted cytotoxic T cells monitor antigen processing in the endoplasmic reticulum.</a> Nat Immunol. 13 (6), 579-586 (2012).</li>
<li>Hu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+regulatory+CD8+T+cells+in+Qa-1-deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Analysis of regulatory CD8 T cells in Qa-1-deficient mice.</a> Nat Immunol. 5 (5), 516-523 (2004).</li>
<li>Tang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+immunity+by+a+novel+population+of+Qa-1-restricted+CD8alphaalpha%2BTCRalphabeta%2B+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Regulation of immunity by a novel population of Qa-1-restricted CD8alphaalpha+TCRalphabeta+ T cells.</a> J Immunol. 177 (11), 7645-7655 (2006).</li>
<li>Leavenworth, J. W., Tang, X., Kim, H. J., Wang, X., Cantor, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amelioration+of+arthritis+through+mobilization+of+peptide-specific+CD8%2B+regulatory+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Amelioration of arthritis through mobilization of peptide-specific CD8+ regulatory T cells.</a> J Clin Invest. 123 (3), 1382-1389 (2013).</li>
<li>Wu, Y., Zheng, Z., Jiang, Y., Chess, L., Jiang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+specificity+of+T+cell+regulation+that+enables+self-nonself+discrimination+in+the+periphery%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">The specificity of T cell regulation that enables self-nonself discrimination in the periphery.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (2), 534-539 (2009).</li>
<li>Panoutsakopoulou, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suppression+of+autoimmune+disease+after+vaccination+with+autoreactive+T+cells+that+express+Qa-1+peptide+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Suppression of autoimmune disease after vaccination with autoreactive T cells that express Qa-1 peptide complexes.</a> J Clin Invest. 113 (8), 1218-1224 (2004).</li>
<li>Tang, X., Maricic, I., Kumar, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-TCR+antibody+treatment+activates+a+novel+population+of+nonintestinal+CD8+alpha+alpha%2B+TCR+alpha+beta%2B+regulatory+T+cells+and+prevents+experimental+autoimmune+encephalomyelitis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Anti-TCR antibody treatment activates a novel population of nonintestinal CD8 alpha alpha+ TCR alpha beta+ regulatory T cells and prevents experimental autoimmune encephalomyelitis.</a> J Immunol. 178 (10), 6043-6050 (2007).</li>
<li>Holderried, T. A., Lang, P. A., Kim, H. J., Cantor, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+disruption+of+CD8%2B+Treg+activity+enhances+the+immune+response+to+viral+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Genetic disruption of CD8+ Treg activity enhances the immune response to viral infection.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (52), 21089-21094 (2013).</li>
<li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+Non-classical+Myelin+Epitopes+to+Treat+Experimental+Autoimmune+Encephalomyelitis%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Targeting Non-classical Myelin Epitopes to Treat Experimental Autoimmune Encephalomyelitis.</a> Sci Rep. 6, 36064(2016).</li>
<li>Lo, W. F., Dunn, C. D., Ong, H., Metcalf, E. S., Soloski, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+and+host+factors+involved+in+the+major+histocompatibility+complex+class+Ib-restricted+presentation+of+Salmonella+Hsp+60%3A+novel+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Bacterial and host factors involved in the major histocompatibility complex class Ib-restricted presentation of Salmonella Hsp 60: novel pathway.</a> Infect Immun. 72 (5), 2843-2849 (2004).</li>
<li>Xu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+nucleocapsid+protein+of+Rift+Valley+fever+virus+is+a+potent+human+CD8%2B+T+cell+antigen+and+elicits+memory+responses%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The nucleocapsid protein of Rift Valley fever virus is a potent human CD8+ T cell antigen and elicits memory responses.</a> PLoS One. 8 (3), e59210(2013).</li>
<li>Schumacher, T. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptide+selection+by+MHC+class+I+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Peptide selection by MHC class I molecules.</a> Nature. 350 (6320), 703-706 (1991).</li>
<li>Zhang, X., Goncalves, R., Mosser, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+isolation+and+characterization+of+murine+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Immunol%22%5BJournal%5D)">The isolation and characterization of murine macrophages.</a> Curr Protoc Immunol. , Chapter 14, Unit 14, 11 (2008).</li>
<li>Guo, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+length+peptides+bind+to+HLA-Aw68+similarly+at+their+ends+but+bulge+out+in+the+middle%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Different length peptides bind to HLA-Aw68 similarly at their ends but bulge out in the middle.</a> Nature. 360 (6402), 364-366 (1992).</li>
<li>Soloski, M. J., Metcalf, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+involvement+of+class+Ib+molecules+in+the+host+response+to+infection+with+Salmonella+and+its+relevance+to+autoimmunity%5BTitle%5D)+AND+%22Microbes+Infect%22%5BJournal%5D)">The involvement of class Ib molecules in the host response to infection with Salmonella and its relevance to autoimmunity.</a> Microbes Infect. 3 (14-15), 1249-1259 (2001).</li>
<li>Smith, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+cells+use+endocytic+pathway+for+cross-priming+class+Ib+MHC-restricted+CD8alphaalpha%2BTCRalphabeta%2B+T+cells+with+regulatory+properties%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Dendritic cells use endocytic pathway for cross-priming class Ib MHC-restricted CD8alphaalpha+TCRalphabeta+ T cells with regulatory properties.</a> J Immunol. 182 (11), 6959-6968 (2009).</li>
<li>Kalra, A., Mukherjee, P., Chauhan, V. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+fine+specificity+of+the+immune+response+to+a+Plasmodium+falciparum+rhoptry+neck+protein%2C+PfAARP%5BTitle%5D)+AND+%22Malar+J%22%5BJournal%5D)">Characterization of fine specificity of the immune response to a Plasmodium falciparum rhoptry neck protein, PfAARP.</a> Malar J. 15, 457(2016).</li>
<li>Kambayashi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+nonclassical+MHC+class+I+molecule+Qa-1+forms+unstable+peptide+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">The nonclassical MHC class I molecule Qa-1 forms unstable peptide complexes.</a> J Immunol. 172 (3), 1661-1669 (2004).</li>
</ol>

作者声明无利益冲突。

本文中，我们描述了一种用于分析蛋白质中Qa-1表位的实验方案。与此方案相关，此前已有若干其他策略被报道。首先，曾利用同种异体CD8+ T细胞系和克隆来鉴定Qdm1。其次，通过分析Qdm获得的推测性Qa-1结合基序被用于鉴定HSP60p216-224以及TCRBV8.1表位9,18。第三，使用来自某一蛋白质的一系列重叠肽段免疫动物，随后从免疫后的动物中分离CD8+ T细胞，以鉴定TCRBV8.2肽段p42-50，并进一步证实该肽段可与Qa-1结合6,10,19。第四，将具有功能的CD8+ T细胞系与cDNA展示文库联合使用，用于鉴定FL9 Qa-1表位4。
<p clas...

Qa-1 属于小鼠中的一类非经典主要组织相容性复合体 1b（MHC-Ib）分子，其人类同源分子为 HLA-E。已有研究表明，Qa-1 分子具有重要的生物学功能。首先，Qa-1 分子在监测细胞结构与功能完整性方面发挥关键作用。在此过程中，Qa-1 分子进化出多种策略以监控细胞的正常功能。其中一种策略是 Qa-1 分子可与经过加工的信号肽（表位）形成复合物， 即 内质网中由经典MHC-Ia分子加工产生的Qa-1决定簇修饰肽（Qdm）1这些Qa-1/Qdm复合物随后呈现在细胞表面，并与NK细胞上的抑制性NKG2A受体结合，从而抑制NK细胞的杀伤活性。2如果MHC-Ia分子的表达缺失，细胞（例如恶性细胞）将对自然杀伤细胞（NK）的杀伤作用变得敏感。2另一种策略使Qa-1分子能够在缺乏TAP（抗原加工相关转运蛋白）的细胞表面形成新的Qa-1/表位复合物3 和/或ERAAP（内质网氨基肽酶，与抗原加工相关）4 （这两种缺陷在恶性细胞中常同时出现）。表达这些新Qa-1/表位复合物的细胞可被表位特异性的Qa-1限制性CD8+ T细胞。其次，Qa-1分子诱导免疫调节5在此方面，Qa-1/表位复合物已被证明可刺激CD8+ 对防止免疫介导的自身组织损伤具有重要作用的调节性T（Treg）细胞6,7,8,9,10第三，Qa-1限制性CD8+ 调节性T细胞已被证明可限制针对病毒感染的免疫反应11.
因此，特异性扩增表位特异性的Qa-1限制性CD8+ T细胞，是一种有望用于清除异常细胞、增强免疫调节以及控制病毒诱导的免疫反应强度的策略。尽管目前尚未明确扩增表位特异性的Qa-1限制性CD8+ T细胞是否能够增强免疫监视功能并限制病毒诱导的免疫反应，但我们的实验室及其他研究团队已明确证实，使用Qa-1表位进行免疫接种可增强针对致病性自身反应性CD4+ T细胞的Qa-1限制性CD8+ Treg细胞功能，从而在多种动物模型中有效控制由CD4+ T细胞介导的自身免疫性疾病，例如实验性过敏性脑脊髓炎（人类多发性硬化症的动物模型）6,10、胶原诱导性关节炎（人类类风湿性关节炎的动物模型）7以及非肥胖型糖尿病（人类1型糖尿病的动物模型）8。此外，我们还发现，使用组织特异性Qa-1表位进行免疫接种可通过扩增CD8+ Treg细胞，实现对该组织中免疫介导性炎症的特异性控制12。上述临床前研究的成功表明，有必要对Qa-1表位免疫接种在治疗组织特异性免疫介导性疾病中的应用进行全面评估，并进一步探索其在治疗与TAP和ERAAP缺陷相关的其他疾病中的潜在价值。
因此，迫切需要一种能够可靠且快速分析蛋白质中 Qa-1 表位的技术。目前，仅有少数具有重要生物学意义的 Qa-1 表位被报道。这些 Qa-1 表位大多是在研究 CD8+ T 细胞对细菌的应答13、TAP 缺陷细胞3、ERAAP 缺陷细胞4 以及引起实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）的细胞6,9 的过程中偶然发现的。因此，亟需一种高通量技术，用于在特定蛋白质中鉴定具有重要生物学功能的 Qa-1 表位。下文所述为一种重叠肽（OLP）文库策略，该方法利用针对某蛋白质 OLP 肽库（OLP_pool）的 Qa-1 限制性 CD8+ T 细胞系，来定位蛋白质中的功能性 Qa-1 表位。

<table><tbody><tr><td>待分析的蛋白质</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>蛋白质序列可从NCBI获取</td></tr><tr><td>二甲基亚砜（DMSO）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat#: D2650 SIGMA</td><td>DMSO应为无菌且经细胞培养测试。</td></tr><tr><td>K&lt;sup&gt;b-/-&lt;/sup&gt;D&lt;sup&gt;b-/-&lt;/sup&gt; 小鼠</td><td>Lauson实验室</td><td>Stock#: 019995</td><td>我们曾使用Taconic H2-K&lt;sup&gt;b&lt;/sup&gt;H2-D&lt;sup&gt;b&lt;/sup&gt; 双重敲除小鼠（货号：4215-F 和 4215-M），但该品系目前已不再提供。</td></tr><tr><td>AIM V无血清培养基</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Cat#: 12055091</td><td></td></tr><tr><td>2-巯基乙醇</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Cat#: 21985023</td><td></td></tr><tr><td>丙酮酸钠</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Cat#: 11360070</td><td></td></tr><tr><td>非必需氨基酸</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Cat#: 11140076</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads CD8阳性分离试剂盒</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Cat#: 11333D</td><td></td></tr><tr><td>Bio-Gel P-100</td><td>Bio-Rad</td><td>Cat#: 150-4171</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（PBS）</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Cat#: 20012027</td><td></td></tr><tr><td>移液管</td><td>Globe Scientific</td><td>Mfg#: 137238</td><td></td></tr><tr><td>小鼠M-CSF</td><td>PeproTech</td><td>Cat#: 315-02</td><td></td></tr><tr><td>48孔组织培养板</td><td>USA Scientific</td><td>Cat#: CC7682-7548</td><td></td></tr><tr><td>Corning Costar TC处理多孔板，96孔，V型底</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat#: Z372129 Sigma</td><td></td></tr><tr><td>1 ml深孔6孔聚丙烯板，无菌</td><td>USA Scientific</td><td>Item#: 1896-1110</td><td></td></tr><tr><td>重组小鼠IL-2</td><td>PeproTech</td><td>Cat#: 212-12</td><td></td></tr><tr><td>重组小鼠IL-7</td><td>PeproTech</td><td>Cat#L: 217-17</td><td></td></tr><tr><td>捕获型抗IFN-&amp;gamma; 抗体</td><td>BD Biosciences</td><td>Cat#: 551881</td><td></td></tr><tr><td>ELISPOT板</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat#: S2EM004M99</td><td></td></tr><tr><td>C1R</td><td>ATCC</td><td>Cat#: ATCC CRL-1993</td><td></td></tr><tr><td>C1R.Qa-1&lt;sup&gt;b&lt;/sup&gt;</td><td></td><td></td><td>定制构建（GenBank登录号：NM_010398.3）</td></tr><tr><td>Qa-1慢病毒载体</td><td>GeneCopoeia</td><td>Product#: Mm02955</td><td></td></tr><tr><td>检测型抗IFN-&amp;gamma; 抗体</td><td>BD Biosciences</td><td>Cat#: 551881</td><td></td></tr><tr><td>Tween20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat#: P9416</td><td></td></tr><tr><td>链霉亲和素-HRP</td><td>BD Biosciences</td><td>Cat#: BD557630</td><td></td></tr><tr><td>AEC底物</td><td>BD Biosciences</td><td>Cat#: 551951</td><td></td></tr><tr><td>免疫斑点分析仪</td><td>ImmunoSpot</td><td></td><td>任何免疫斑点分析仪均可用于此目的。</td></tr></tbody></table>

重叠肽文库用于绘制蛋白质中qa-1表位

Overlapping Peptide Library to Map Qa-1 Epitopes in a Protein

Qa-1（人类中的 HLA-E）属于非经典主要组织相容性复合体 1b（MHC-Ib）分子家族。近期研究表明，Qa-1 分子在监测细胞的结构与功能完整性、诱导免疫调节以及限制对病毒感染的免疫应答中发挥重要作用。此外，通过表位免疫增强 Qa-1 限制性 CD8+ T 细胞功能已在多种自身免疫性疾病动物模型中显示出治疗效果，例如 实验性过敏性脑脊髓炎、胶原诱导性关节炎和非肥胖型糖尿病。因此，迫切需要一种能够高效、快速鉴定蛋白质中功能性 Qa-1 表位的方法。本文描述了一种利用针对重叠肽（OLP）文库的 Qa-1 限制性 CD8+ T 细胞系来确定蛋白质中 Qa-1 表位的实验方案。该 OLP 文库包含覆盖整个蛋白质序列的 15 肽重叠肽，相邻肽段之间重叠 11 个氨基酸。利用本方案，我们近期在髓鞘少突胶质细胞糖蛋白（MOG）中鉴定出一个 9 肽 Qa-1 表位。新鉴定的 MOG Qa-1 表位可诱导表位特异性、Qa-1 限制性的 CD8+ T 细胞，从而增强针对髓鞘的免疫调节作用。因此，该方案有助于未来进一步研究 Qa-1 限制性 CD8+ T 细胞的新靶点及其功能。

设计覆盖蛋白质全长的OLP文库
从蛋白质的N端开始，每条肽段包含15个氨基酸（15-mer）。因此，第一条肽段覆盖第1至第15位氨基酸。第二条肽段的N端与第一条肽段的C端重叠11个氨基酸，因此其覆盖第5至第19位氨基酸。按照此方式设计肽段，直至覆盖蛋白质C端（图1）。我们选择15-mer文库，是因为我们及其他研究者已证实，当15-mer肽段被添加至树突状细胞（DCs）或巨噬细胞时，可被有效加工成CD8+ T细胞识别的表位14,15。OLP文库中肽段的数量取决于蛋白质的长度。此外，最后一个OLP的长度可根据蛋白质长度在12至15个氨基酸之间变动。例如，髓鞘少突胶质细胞糖蛋白（MOG）全长为247个氨基酸，其OLP文库包含59条OLP<sup class="xref...

Qa-1（人类中的 HLA-E）属于非经典主要组织相容性复合体 1b 分子家族。研究表明，使用 Qa-1 结合表位进行免疫可增强组织特异性免疫调节，并改善多种自身免疫性疾病。本文介绍一种重叠肽库策略，用于鉴定蛋白质中的 Qa-1 表位。

重叠肽文库用于绘制蛋白质中Qa-1表位

Qa-1（人类中的 HLA-E）属于非经典主要组织相容性复合体 1b（MHC-Ib）分子家族。近期研究表明，Qa-1 分子……

本实验的总体目标是鉴定蛋白质中的 Qa-1 表位。该方法有助于解答免疫调节和免疫治疗领域中的关键科学问题。该技术的主要优势在于所鉴定的肽段已知可激活受 Qa-1 限制的 CD8 T 细胞，且实验操作简便。该技术的应用前景涉及免疫介导性疾病的治疗设计，例如多发性硬化症。尽管该方法可为动物体内Qa-1介导的免疫调控提供研究依据，也可应用于人类HLA-E介导的免疫调控研究。实验开始时，设计一个由15个氨基酸组成的肽段文库，其中相邻肽段在11个氨基酸上存在重叠。在无菌条件下获取并重悬多肽。对于每种多肽，将5毫克多肽与100微升二甲基亚砜混合。取每种多肽储备液各10微升，加入洁净的1毫升冻存管中，配制OLP混合储备液。然后，将每种肽原液各20微升加入到V型底96孔板中，并用80微升无菌水将每种原液稀释。将剩余的50毫克/毫升肽原液以及稀释后的10毫克/毫升肽原液板均于20摄氏度保存。接着，将10微升OLP混合肽原液加入含有2毫升无血清培养基中辐照过的树突状细胞的15毫升离心管中，从而使DMSO稀释200倍。将剩余的OLP池库存储在20摄氏度。在室温下将DC细胞与OLP池共同孵育3小时。每15分钟手动轻轻摇动细胞一次。孵育期间，使用试剂盒从收获的小鼠脾脏或淋巴结中纯化CD8+T细胞。用无血清培养基配制5毫升溶液，其中每毫升含1000万个T细胞、50单位白细胞介素2（interleukin 2）和100单位白细胞介素7（interleukin 7）。纯化的CD8 T细胞应不含磁珠，或保持未接触状态。将0.5毫升T细胞溶液加入48孔板的10个孔中，每孔一滴。OLP肽段池孵育的DC溶液孵育完成后，向DC中加入10毫升无血清培养基。在室温下以300 × g离心10分钟。然后，用 5 毫升无血清培养基重悬细胞。将 0.5 毫升细胞悬液加入每个 10 孔板的孔中。在 37 °C、5% CO₂ 的培养箱中培养 4 天。然后，从每个孔中吸出 400 微升培养基。向每个孔中加入 500 微升新鲜的无血清培养基，其中含有 IL-2 和 IL-7 各 100 单位/毫升。将细胞继续培养 2 至 3 天，然后再次刺激 OLP 池预致敏的细胞。在重新刺激之前，获取小鼠腹腔巨噬细胞并进行照射。将巨噬细胞浓度调整为每毫升无血清培养基中含五百万个细胞。取10微升OLP混合物原液与2毫升照射处理的腹腔巨噬细胞混合，使终浓度中DMSO体积百分比为0.5%。向该溶液中补充100单位/毫升的小鼠巨噬细胞集落刺激因子。在48孔板的每个孔中加入200微升OLP-pool巨噬细胞溶液。将该板在37摄氏度下孵育4小时。然后，用200微升预热的RPMI-0培养基轻轻洗涤每个孔。巨噬细胞溶液中含有大量微珠。在加入OLP混合池致敏的CD8 T细胞之前，应在显微镜下检查培养板，确保所有孔中均无微珠残留。接下来，收集并合并经O

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