重叠肽文库用于绘制蛋白质中Qa-1表位

本实验的总体目标是鉴定蛋白质中的 Qa-1 表位。该方法有助于解答免疫调节和免疫治疗领域中的关键科学问题。该技术的主要优势在于所鉴定的肽段已知可激活受 Qa-1 限制的 CD8 T 细胞，且实验操作简便。

该技术的应用前景涉及免疫介导性疾病的治疗设计，例如多发性硬化症。尽管该方法可为动物体内Qa-1介导的免疫调控提供研究依据，也可应用于人类HLA-E介导的免疫调控研究。实验开始时，设计一个由15个氨基酸组成的肽段文库，其中相邻肽段在11个氨基酸上存在重叠。

在无菌条件下获取并重悬多肽。对于每种多肽，将5毫克多肽与100微升二甲基亚砜混合。取每种多肽储备液各10微升，加入洁净的1毫升冻存管中，配制OLP混合储备液。

然后，将每种肽原液各20微升加入到V型底96孔板中，并用80微升无菌水将每种原液稀释。将剩余的50毫克/毫升肽原液以及稀释后的10毫克/毫升肽原液板均于20摄氏度保存。接着，将10微升OLP混合肽原液加入含有2毫升无血清培养基中辐照过的树突状细胞的15毫升离心管中，从而使DMSO稀释200倍。

将剩余的OLP池库存储在20摄氏度。在室温下将DC细胞与OLP池共同孵育3小时。每15分钟手动轻轻摇动细胞一次。

孵育期间，使用试剂盒从收获的小鼠脾脏或淋巴结中纯化CD8+T细胞。用无血清培养基配制5毫升溶液，其中每毫升含1000万个T细胞、50单位白细胞介素2（interleukin 2）和100单位白细胞介素7（interleukin 7）。纯化的CD8 T细胞应不含磁珠，或保持未接触状态。

将0.5毫升T细胞溶液加入48孔板的10个孔中，每孔一滴。OLP肽段池孵育的DC溶液孵育完成后，向DC中加入10毫升无血清培养基。在室温下以300 × g离心10分钟。

然后，用 5 毫升无血清培养基重悬细胞。将 0.5 毫升细胞悬液加入每个 10 孔板的孔中。在 37 °C、5% CO₂ 的培养箱中培养 4 天。

然后，从每个孔中吸出 400 微升培养基。向每个孔中加入 500 微升新鲜的无血清培养基，其中含有 IL-2 和 IL-7 各 100 单位/毫升。将细胞继续培养 2 至 3 天，然后再次刺激 OLP 池预致敏的细胞。

在重新刺激之前，获取小鼠腹腔巨噬细胞并进行照射。将巨噬细胞浓度调整为每毫升无血清培养基中含五百万个细胞。取10微升OLP混合物原液与2毫升照射处理的腹腔巨噬细胞混合，使终浓度中DMSO体积百分比为0.5%。

向该溶液中补充100单位/毫升的小鼠巨噬细胞集落刺激因子。在48孔板的每个孔中加入200微升OLP-pool巨噬细胞溶液。将该板在37摄氏度下孵育4小时。

然后，用200微升预热的RPMI-0培养基轻轻洗涤每个孔。巨噬细胞溶液中含有大量微珠。在加入OLP混合池致敏的CD8 T细胞之前，应在显微镜下检查培养板，确保所有孔中均无微珠残留。

接下来，收集并合并经OLP池预致敏的、可用于再次刺激的CD8+ T细胞。用不含血清的培养基将T细胞浓度调整为每毫升一百万个细胞，培养基中需含有25单位/毫升的IL-2和50单位/毫升的IL-7。将一毫升上述混合T细胞悬液加入每个含有OLP池脉冲致敏巨噬细胞的孔中。

将细胞在37摄氏度、5%二氧化碳的环境中培养四天。随后，从每个孔中移除约400微升培养基。向每个孔中加入500微升新鲜的无血清培养基，其中分别含有100单位/毫升的IL-2和IL-7。

继续在相同条件下孵育。三至四天后，使用干扰素-γ酶联免疫斑点试验检测再次刺激的细胞是否产生针对OLP池特异性的、Qa-1限制性的应答。在等待结果期间，每三至四天更换一次CD8+ T细胞培养基。

使用稀释后的肽段储备液进行ELISPOT实验，以确定哪些肽段可诱导OLP混合肽池特异性的、由Qa-1限制的干扰素-γ分泌。最后，通过ELISPOT实验检测一系列截短肽段，以鉴定最优的Qa-1表位。干扰素-γ ELISPOT实验显示，当用MOG重叠肽库混合刺激CD8+ T细胞后与C1R细胞共孵育时，斑点形成细胞数量显著增加。

Qa-1b 细胞。这表明T细胞对Qa-1结合肽产生了应答，且MOG_pool中含有一个或多个Qa-1结合表位。随后进行了另一项检测，以筛选该肽段混合物中的各个单独肽段。

三种肽的反应强度至少是存在 C1R 时的 Qa-1b 细胞未加肽情况下的三倍。其中，选择反应最强的肽进行进一步评估。

基于目标15肽构建的截短肽文库被用于鉴定最优的Qa-1表位。理想的表位长度应为8至10个氨基酸，优先选择9个氨基酸的肽段。此外，最优表位应表现出与15肽相似或更强的干扰素-γ反应。

九个甲硫氨酸N端截短的肽最符合这些标准，使其成为最佳的Qa-1表位。该技术建立后，为免疫调节领域的研究人员发现其他组织（如胰腺）中新的Qa-1表位以研究免疫调节铺平了道路。请勿忘记，接触辐射可能具有极高危险性。

研究人员应严格遵守机构政策，并接受适当的培训。