在体内 G蛋白偶联受体相互作用光谱分辨的双光子显微镜定量

以下实验的总体目标是确定有关蛋白质的 stoia 度量和结构信息。所有表达活生物细胞的韧带复合物，酵母细胞都经过基因工程改造，以表达附着在供体或受体荧光探针上的目标蛋白质。供体探针可以直接由激光激发。

虽然受体只能通过附近激发供体的能量转移来激发，但细胞会暴露在脉冲近红外激光的光下。来自探针的荧光授精通过透射光栅分离成其光谱分量，并投射到电子倍增 CCD 阵列的表面上。因此，从个体获得样品中每个位置的所有韧带的完整荧光光谱。

检测到的荧光的光谱图谱取决于目标蛋白质的特异性相互作用。对数据进行分析，以确定扫描池的每个图像像素，供体探针和受体探针的单独发射。能量传递的效率是在每个图像像素上确定的，然后根据像素的品格效率和直方图进行弯曲。

直方图解释允许在体内测定蛋白质、复合物大小和构型。大家好，我是来自威斯康星大学密尔沃基分校 Riku 研究小组的 Michael Stoneman。我叫 Singh。

我来自密尔沃基威斯康星州的 Rikus 实验室。该技术的主要优点是，通过对细胞进行一次完整扫描，即可获得细胞内数百个所有韧带复合体的完整发射曲线。通常，大多数荧光显微镜方法需要对感兴趣的细胞进行多次扫描，以积累足够的光谱信息，从而确定细胞内各个感兴趣区域的 fret 效率。

然而，扩散生化反应可能会改变这些感兴趣区域的分子组成，从而限制在图像扫描中获得的信息。这种方法可以帮助回答蛋白质研究中的关键问题，蛋白质在活细胞中的相互作用，例如寡聚体的大小有多大的危害？寡聚体在蛋白质生命周期的哪个阶段进行养殖，该蛋白质的寡聚体在细胞功能中的作用是什么？

光谱分辨的双显微相机通过扫描激发光束的聚焦在多个位置穿过感兴趣的样品，在图像池中积累有关 olima 复合物的光谱信息。一对正交扫描镜用于将激光束的焦点沿两个不同的方向平移穿过样品。扫描镜的移动由计算机控制，并与从 CCD 相机提取荧光强度数据同步，从线扫描中可以重建对应于特定波长光的荧光强度空间图。

为了准确重建 X 射线荧光强度空间图并计算与每个图对应的实际波长，必须使用荧光素溶液校准线扫描协议。要开始校准程序，将波长为 800 纳米的激发光谱发送到激发光谱，这是供体标签 GFP 最大激发波长的两倍，二二发送到激发光谱，平移位于激光腔内的棱镜，以使用相机接口的计算机程序修改群速度色散。向 CCD 芯片发送命令，将 CCD 芯片的温度降低到可达到的最低温度。

为了减少暗噪声。将 10 微升荧光素溶液移液到带有盖玻片的显微镜载玻片盖上，使样品的薄层均匀分散在盖玻片和显微镜载玻片之间的区域，将一小滴浸油滴在盖玻片表面。现在固定显微镜，滑到 XY、Z 平移台上，沿光轴方向平移滑台和载物台通过手动调整线性致动器，平移滑台，直到显微镜物镜接触到浸油液滴，将相机切换到数据采集的视频模式，以便进入的光线照射到 CCD 阵列上实时显示在计算机屏幕上。

关闭所有环境室内灯光，以减少在 CCD 阵列处检测到的背景噪声。缓慢调整控制光轴方向平移台的千分尺，将样品带入激光束的焦点。当荧光素样品聚焦时，发射将在 CCD 阵列上显示为一条尖锐的线条。

将像素强度的读数从 CCD 阵列下载到计算机。通过在图像 J 中打开下载的强度值矩阵并在荧光区域中画一条线，测量像素强度作为 CCD 阵列上位置的函数。使用 image day 命令。

分析图剖面以创建说明荧光素样品发射光谱的图。调整镜子的增量参数，该参数控制激光的移动。聚焦在 Y 方向上，使得样品中相邻的 y 位置导致荧光光谱的峰值沿 CCD 阵列上的光谱维度正好移动一个像素。

要监测这一点，请下载样品中两个不同 Y 位置的荧光素光谱强度。然后打开带有图像 J 的强度图像，并找到每个荧光光谱的峰值像素位置。使用图像 J 光标，让 CCD 的快门打开，沿 X 方向扫描样品上的激光焦点。

沿扫描线从每个体素发出的光应落入 CCD 阵列，在每次线扫描结束时，入射到 CCD 阵列上，存储从为此线扫描获得的 CCD 阵列的数据，然后清除 CCD 阵列的像素。移动激光的位置。将焦点放在 Y 方向上之前确定的量。

然后沿 X 方向扫描激光束穿过样品。再次，打开 CCD 的快门存储数据。重复此线扫描程序，直到激光照射到比单个生物细胞尺寸大 50% 左右的物理区域。

应使用特定线扫描图像的行号与波长之间的关系来重建图像，以获得不同波长的多个前妻荧光强度面部图。要获取特定波长的前妻荧光提交图像，请在从第一线扫描获得的图像上找到与该波长对应的行号。然后，后续线扫描图像的相邻行对应于荧光发射图像的下一行。

对于该特定波长，堆叠与该波长对应的所有图像行，以获得该波长下样品的 XY 荧光强度空间图。对所有其他可获得的波长重复此过程，以收集有关样品的数据。首先，从培养箱中取出带有转化酵母菌落的板。

至少应该有三种类型的转化细胞。表达目标蛋白的细胞用两种类型的荧光探针标记。仅表达用供体荧光探针标记的蛋白质的细胞和仅表达用受体荧光探针标记的蛋白质的细胞。

将 100 微升 100 毫摩尔氯化钾加入微量离心管中。然后使用微量移液器吸头，从表达用供体和荧光探针（荧光探针除外）标记的蛋白质的细胞板上刮下 3 到 5 个酵母菌落，并接种 100 毫摩尔氯化钾。使用这些细胞，去除 10 微升细胞悬液并将其分配到新鲜的显微镜上。滑。

用盖玻片盖住液滴，并在盖玻片表面滴一滴油。接下来，手动关闭激光束路径中的快门，以阻止激光到达显微镜物镜。将显微镜载玻片固定在 XY、Z 平移载物台上，沿光轴方向平移载玻片载物台，直到显微镜物镜与浸油液滴接触。

现在打开宽视场光照明并转到相机。数据收集的视频模式。由于发射路径中存在透射光栅，样品的宽视场图像将严重模糊。

因此，在透射光栅之前的光路中放置一个具有小全宽半峰的带通滤光片。沿光轴方向缓慢平移平移台，同时在相机屏幕上查看细胞图像，直到细胞聚焦。沿 X 或 Y 方向平移载物台，以便将单个单元带到激光束焦点的位置。

关闭宽场照明源，并从发射路径中删除带路径滤波器。在短时间内解锁激光束，同时查看 CCD 阵列接收到的信号。如果在激光束入射到细胞上期间在 CCD 阵列上检测到荧光信号，则对该细胞进行完整的荧光数据采集扫描。

使用相同的扫描参数至关重要，特别是行数以及前面演示的校准程序中确定的增量原因。对大量表达附着在供体标签和受体标签上的蛋白质的细胞重复细胞定位和荧光数据采集过程。在积累了足够多的荧光图像后，表达两种受体标记的蛋白质的细胞重复整个过程，对于仅表达用供体荧光探针标记的蛋白质的两个细胞和仅表达用受体荧光探针标记的蛋白质的细胞。

最后，重建所有扫描以获得光谱分辨。使用前面这三个图中描述的程序对每组数据进行 XY 荧光强度空间图，是从对表达不育至 α 因子受体的酵母细胞进行的光谱分辨的两个光子显微镜测量计算得出的空间图。通过分析从细胞的每个位置获得的光谱发射曲线，获得供体和受体信号的二维图。

荧光强度根据其值分配伪色，刻度显示为插图。然后使用 KDA 和 KAD 图像使用从刚刚显示的细胞的表观品格效率图中提取的值计算表观品格效率的二维图，并准备了直方图。测得的单元格 EAPP 值用圆圈表示。

红色实线表示使用绿色实线表示的各个钙函数之和的测量数据的最佳拟合。方案文本中描述的直方图分析证实，无菌双 α 因子受体所有韧带复合物在体内呈 RBA 形四聚体的形式。一旦掌握，如果执行得当，这项技术可以在 12 小时内完成。

在进行此实验时，重要的是要保持较低的激发源功率。避免单个脉冲多次激发供体是很重要的。