Name: 在体内 G蛋白偶联受体相互作用光谱分辨的双光子显微镜定量 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-01-19T17:30:00.000+00:00
Duration: 14 min 26 s
Description: 学习使用光谱分辨双光子显微镜技术定量分析活细胞中G蛋白偶联受体的相互作用，通过FRET效率图谱获取蛋白质复合物的化学计量信息。该方法为研究膜受体寡聚化机制提供了高分辨率成像手段。

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本工作由威斯康星大学密尔沃基分校研究增长计划、威斯康星生物医学与健康技术研究所以及布拉德利基金会资助。

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</ol>

无利益冲突声明。

在本演示中，我们展示了如何在活体条件下测定蛋白质寡聚体复合物的大小和结构信息。in vivo。尽管所展示的数据来源于在酵母细胞中表达的特定膜受体（即 Ste2p），但该方法具有广泛的适用性，可应用于在任何类型细胞中表达的任何蛋白质，唯一前提是这些蛋白质需标记有适当的荧光标记物。未来对该实验方案的改进将包括提升仪器性能，以实现更高的扫描速度，从而尝试监测蛋白质寡聚体大小和结构随时间变化的动力学过程。

<table><tbody><tr><td>蛋白胨</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1420</td><td></td></tr><tr><td>酵母提取物</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1422</td><td></td></tr><tr><td>聚乙二醇 4000</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-605</td><td></td></tr><tr><td>不含 (NH&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;SO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; 和氨基酸的酵母氮源基础</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0335-15-9</td><td></td></tr><tr><td>酵母合成培养基缺失补充剂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Y2001</td><td></td></tr><tr><td>D-葡萄糖</td><td>Fisher Scientific</td><td>D16-1</td><td></td></tr><tr><td>琼脂</td><td>Fisher Scientific</td><td>S70210</td><td></td></tr><tr><td>硫酸铵</td><td>Fisher Scientific</td><td>A702-500</td><td></td></tr><tr><td>氯化钾</td><td>Acros Organics</td><td>424090010</td><td></td></tr><tr><td>亮氨酸</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP385</td><td></td></tr><tr><td>组氨酸</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP382</td><td></td></tr><tr><td>平场消色差无限远校正 100 倍油浸物镜 NA=1.43</td><td>Nikon Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>光谱分辨双光子显微镜</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

体内 利用光谱分辨双光子显微镜定量分析g蛋白偶联受体相互作用

In vivo Quantification of G Protein Coupled Receptor Interactions using Spectrally Resolved Two-photon Microscopy

在活细胞中研究蛋白质相互作用是重要的研究领域，因为积累的相关信息不仅有助于工业应用，还能增进基础生物学知识。 Förster（荧光）共振能量转移（FRET）是一种常用技术，用于研究活细胞中的蛋白质-蛋白质相互作用，其原理是处于电子激发态的供体分子与邻近的受体分子之间发生能量转移。目标蛋白质被标记上两种不同类型的荧光探针，并在生物细胞中表达。随后通常使用激光激发这些荧光探针，并收集和分析由荧光探针发射出的荧光光谱特性。有关蛋白质相互作用程度的信息即包含在这些光谱发射数据中。通常需要对细胞进行多次扫描，以积累足够的光谱信息，从而准确定量细胞内各个感兴趣区域的蛋白质相互作用程度。然而，在数据采集过程中，这些区域的分子组成可能发生改变，导致定量得到的表观FRET效率的空间分辨结果只能代表整个细胞的平均值。借助光谱分辨的双光子显微镜，我们仅需对感兴趣样品完成一次完整的激发扫描，即可获得全套光谱分辨的图像。基于这种像素级的光谱数据，可计算出细胞内FRET效率的空间分布图。通过将寡聚复合物中FRET的简单理论应用于实验测得的细胞内FRET效率分布，单次光谱分辨扫描即可揭示所研究寡聚复合物的化学计量比和结构信息。本文描述了制备表达膜受体（ sterile 2 α-因子受体）的生物细胞（酵母 Saccharomyces cerevisiae）的步骤，这些受体被标记上两种不同类型的荧光探针。此外，我们还阐述了使用光谱分辨双光子显微成像系统采集荧光数据时涉及的关键因素。本实验方案可推广应用于研究任何可在活细胞中表达并带有荧光标记的蛋白质。

通过使用光谱分辨的双光子显微成像系统，获得表达膜受体的细胞的福斯特共振能量转移（FRET）效率的像素级图谱，这些膜受体被认为可形成同源寡聚复合物。根据FRET效率图谱，我们能够估算所研究寡聚复合物的化学计量信息。

体内 利用光谱分辨双光子显微镜定量分析G蛋白偶联受体相互作用

活细胞中蛋白质相互作用的研究是一个重要的科研领域，因为积累的相关信息不仅有助于工业应用……

以下实验的总体目标是确定蛋白质的化学计量比和结构信息。所有韧带复合物中表达活体生物细胞，通过基因工程改造酵母细胞，使其表达与供体或受体荧光探针相连的目标蛋白质。供体探针可被激光直接激发。虽然受体只能通过附近激发的供体能量转移来激发，但细胞会暴露于脉冲近红外激光的光照下。探针发出的荧光经透射光栅分光后，被投射到电子倍增CCD阵列表面。因此，可获得样品中每个位置单个完整韧带的完整荧光光谱。检测到的荧光光谱特征取决于目标蛋白之间的特定相互作用。通过分析数据，可确定扫描细胞中每个图像像素的供体和受体探针各自的发射信号。在每个图像像素上计算能量转移效率，然后根据FRET效率和直方图对像素进行分类。直方图分析可实现对蛋白质、复合物大小及构型的活体测定。大家好，我是来自威斯康星大学密尔沃基分校Riku研究组的Michael Stoneman。我叫Singh。我来自威斯康星州密尔沃基的Rikus实验室。该技术的主要优势在于，通过对细胞进行一次完整的扫描，即可获得细胞内数百个完整韧带复合物的全部发射谱。通常情况下，大多数荧光显微镜方法需要对目标细胞进行多次扫描，以积累足够的光谱信息，从而确定细胞内不同感兴趣区域的FRET效率。然而，扩散性生化反应可能会改变这些感兴趣区域的分子组成，从而限制成像扫描所获得的信息。该方法有助于回答蛋白质研究以及活细胞中蛋白质相互作用领域的一些关键问题，例如：何种大小的寡聚体具有危害性？寡聚体在蛋白质生命周期的哪个阶段形成？该蛋白质的寡聚体在细胞功能中发挥什么作用？光谱分辨双光子显微镜通过在多个位置扫描激发光束的焦点，对样品中感兴趣区域的活体细胞内的色素复合物进行成像，并积累其光谱信息。利用一对正交扫描镜，将激光束的焦点在样品上沿两个不同方向移动。扫描镜的运动由计算机控制，并与CCD相机采集的荧光强度数据同步提取；由此可重建对应特定波长的荧光强度空间分布图。为了准确重建X射线荧光强度空间图谱并计算对应于每幅图谱的实际波长，必须使用荧光素溶液对线扫描协议进行校准。开始校准程序时，在800纳米波长处进行激发光谱扫描，该波长是供体标记物GFP22的激发波长最大值的两倍。为进行激发光谱扫描，通过与相机连接的计算机程序调节激光腔内棱镜的位置，以调节群速度色散。向CCD芯片发送指令，将其温度降至可达到的最低温度。为了减少暗噪声，用移液器吸取10 µL荧光素溶液，滴加到显微镜载玻片上，并用盖玻片覆盖，使样品在盖玻片与载玻片之间形成一层均匀的薄层。然后在盖玻片表面滴加一小滴浸油。将载玻片固定到显微镜的XY、Z平移台上，并通过手动调节线性驱动器，沿光轴方向移动载玻片和平移台，直至显微镜物镜接触到浸油液滴。随后将相机切换至视频数据采集模式，使照射到CCD阵列上的入射光能够实时显示在计算机屏幕上。关闭所有环境光源，以降低CCD阵列检测到的背景噪声。缓慢调节控制光学轴方向

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在体内 G蛋白偶联受体相互作用光谱分辨的双光子显微镜定量

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成像介导趋化性信号事件的G蛋白偶联受体（GPCR）：以盘基网柄菌（Dictyostelium discoideum）为例

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本方案描述了如何利用全内反射荧光显微镜观察和追踪活细胞表面的单个受体，从而分析受体的侧向流动性、受体复合物的大小，以及可视化瞬时的受体-受体相互作用。该方案可拓展应用于其他膜蛋白。...

高分辨率时空分析受体动力学的单分子荧光显微技术

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使用活细胞悬浮荧光计检测法通过FRET传感器测量G蛋白选择性G蛋白偶联受体构象

鸟苷三磷酸（GTP）结合是G蛋白偶联受体（GPCR）激活过程中最早发生的事件之一。本实验方案描述了如何通过检测放射性标记的GTP类似物[35S]鸟苷-5'-O-(3-硫代)三磷酸（[35S]GTPγS）在特定配体作用下的结合情况，来药理学表征特定的GPCR-配体相互作用。...

通过放射性标记GTP结合测量G蛋白偶联受体信号传导

本文介绍了一种在头部固定的活动小鼠中可视化蛋白激酶A活性的方法。通过颅窗将改良的A激酶活性报告基因tAKARα在皮层神经元中表达并实现成像。利用双光子荧光寿命成像显微技术，在强制运动过程中体内可视化PKA活性。...

使用活体双光子荧光寿命成像显微技术在头部固定行为小鼠中可视化蛋白激酶A活性

免疫反应性成纤维细胞在活化后会发生形态学改变，并促进细胞募集的变化。通过结合双光子成像技术与基因工程改造的成纤维细胞特异性蛋白1（FSP1）-cre；tdTomato floxed-stop-floxed (TB/TB)...

活体双色双光子成像技术用于皮肤中遗传标记报告细胞的观察

由于基于 Förster 共振能量转移（FRET）的传感器本身信噪比（SNR）较低，cAMP 信号的测量一直具有挑战性，尤其是在三维空间中。本文介绍了一种高光谱 FRET 成像与分析方法，可实现三维空间内 cAMP...

使用四维（x, y, z 和 &lambda;）高光谱FRET成像与分析技术测量活细胞中三维cAMP分布

活体成像是研究健康与疾病状态下生物学的有力工具。本方案描述了使用标准双光子显微镜对小鼠视网膜进行经瞳孔成像的方法。同时展示了多种活体成像技术，用于对视网膜中多个细胞群体进行荧光标记。...

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