在体内 G蛋白偶联受体相互作用光谱分辨的双光子显微镜定量

以下实验的总体目标是确定蛋白质的化学计量比和结构信息。所有韧带复合物中表达活体生物细胞，通过基因工程改造酵母细胞，使其表达与供体或受体荧光探针相连的目标蛋白质。供体探针可被激光直接激发。

虽然受体只能通过附近激发的供体能量转移来激发，但细胞会暴露于脉冲近红外激光的光照下。探针发出的荧光经透射光栅分光后，被投射到电子倍增CCD阵列表面。因此，可获得样品中每个位置单个完整韧带的完整荧光光谱。

检测到的荧光光谱特征取决于目标蛋白之间的特定相互作用。通过分析数据，可确定扫描细胞中每个图像像素的供体和受体探针各自的发射信号。在每个图像像素上计算能量转移效率，然后根据FRET效率和直方图对像素进行分类。

直方图分析可实现对蛋白质、复合物大小及构型的活体测定。大家好，我是来自威斯康星大学密尔沃基分校Riku研究组的Michael Stoneman。我叫Singh。

我来自威斯康星州密尔沃基的Rikus实验室。该技术的主要优势在于，通过对细胞进行一次完整的扫描，即可获得细胞内数百个完整韧带复合物的全部发射谱。通常情况下，大多数荧光显微镜方法需要对目标细胞进行多次扫描，以积累足够的光谱信息，从而确定细胞内不同感兴趣区域的FRET效率。

然而，扩散性生化反应可能会改变这些感兴趣区域的分子组成，从而限制成像扫描所获得的信息。该方法有助于回答蛋白质研究以及活细胞中蛋白质相互作用领域的一些关键问题，例如：何种大小的寡聚体具有危害性？寡聚体在蛋白质生命周期的哪个阶段形成？该蛋白质的寡聚体在细胞功能中发挥什么作用？

光谱分辨双光子显微镜通过在多个位置扫描激发光束的焦点，对样品中感兴趣区域的活体细胞内的色素复合物进行成像，并积累其光谱信息。利用一对正交扫描镜，将激光束的焦点在样品上沿两个不同方向移动。扫描镜的运动由计算机控制，并与CCD相机采集的荧光强度数据同步提取；由此可重建对应特定波长的荧光强度空间分布图。

为了准确重建X射线荧光强度空间图谱并计算对应于每幅图谱的实际波长，必须使用荧光素溶液对线扫描协议进行校准。开始校准程序时，在800纳米波长处进行激发光谱扫描，该波长是供体标记物GFP22的激发波长最大值的两倍。为进行激发光谱扫描，通过与相机连接的计算机程序调节激光腔内棱镜的位置，以调节群速度色散。向CCD芯片发送指令，将其温度降至可达到的最低温度。

为了减少暗噪声，用移液器吸取10 µL荧光素溶液，滴加到显微镜载玻片上，并用盖玻片覆盖，使样品在盖玻片与载玻片之间形成一层均匀的薄层。然后在盖玻片表面滴加一小滴浸油。将载玻片固定到显微镜的XY、Z平移台上，并通过手动调节线性驱动器，沿光轴方向移动载玻片和平移台，直至显微镜物镜接触到浸油液滴。随后将相机切换至视频数据采集模式，使照射到CCD阵列上的入射光能够实时显示在计算机屏幕上。

关闭所有环境光源，以降低CCD阵列检测到的背景噪声。缓慢调节控制光学轴方向平移台的千分尺，使样品进入激光束的焦点位置。当荧光素样品处于焦平面时，发射光将在CCD阵列上呈现为一条清晰的亮线。

将CCD阵列的像素强度读数下载到计算机中。在ImageJ中打开下载的强度值矩阵，并通过在荧光区域绘制一条线，测量CCD阵列上像素强度随位置的变化。使用ImageJ的“Plot Profile”命令。

分析轮廓图以生成荧光素样品发射光谱的曲线图。调节镜面的增量参数，该参数控制激光的移动。在 Y 方向上进行聚焦，使得样品内相邻的 Y 位置导致荧光光谱峰值在 CCD 阵列的光谱维度上恰好移动一个像素。

为了监测此过程，下载样品中两个不同 Y 位置的荧光素光谱强度。然后使用 ImageJ 打开强度图像，并找出每条荧光光谱的峰值像素位置。使用 ImageJ 光标，在保持 CCD 快门打开的情况下，将激光焦点沿 X 方向扫描样品。

沿扫描线方向上每个体素发出的光应入射到线扫描结束时的CCD阵列上，存储此次线扫描所获取的CCD阵列数据，然后清除CCD阵列的像素。移动激光的位置。按照先前确定的量在Y方向上进行聚焦。

然后在 X 方向上对样品进行激光束扫描。再次打开 CCD 快门以存储数据。重复此线扫描过程，直至激光照射的物理区域比单个生物细胞的尺寸大约 50%。

应利用特定线扫描图像的行号与波长之间的关系，重建图像以获得不同波长下的多个发射荧光强度面部分布图。要获取特定波长下的发射荧光图像，请在首次线扫描获得的图像中找到对应于该波长的行号，随后线扫描图像中的相邻行即对应于荧光发射图像的下一行。

针对该特定波长，将所有与此波长对应图像行堆叠，以获得样品在该波长下的XY平面荧光强度空间图。对所有其他可获取的波长重复此步骤，以收集样品的数据。首先，从培养箱中取出含有转化酵母菌落的培养板。

应至少存在三种类型的转化细胞：表达同时带有两种荧光探针标记的目标蛋白的细胞；仅表达带有供体荧光探针标记的蛋白的细胞；以及仅表达带有受体荧光探针标记的蛋白的细胞。

向一个微量离心管中加入 100 µL 的 100 mM 氯化钾溶液。然后使用微量移液器吸头，从表达带有供体和受体荧光探针标记蛋白的细胞平板上刮取三到五个酵母菌落，并接种至 100 mM 氯化钾溶液中。取 10 µL 该细胞悬液，滴加到一块新的显微镜载玻片上。

用盖玻片覆盖液滴，并在盖玻片表面滴加一滴浸油。接着，手动关闭激光光路中的快门，以阻止激光照射到显微镜物镜。将显微镜载玻片固定在XY、Z平移台上，并沿光轴方向移动载物台，直至显微镜物镜与浸油液滴接触。

现在打开宽场光源照明并切换到相机的视频采集模式。由于发射光路中存在透射光栅，样品的宽场图像将严重模糊。

因此，在透射光栅前的光路中放置一个半高全宽较小的带通滤光片。在相机屏幕上观察细胞图像的同时，缓慢沿光轴方向移动平移台，直至细胞清晰聚焦。在X或Y方向上移动平移台，使单个细胞位于激光束焦点位置。

关闭宽场照明光源，并从发射光路中移除带通滤光片。短暂解除激光束的阻断，同时观察CCD阵列接收到的信号。若在激光束照射细胞期间于CCD阵列上检测到荧光信号，则对该细胞执行完整的荧光数据采集扫描。

必须使用相同的扫描参数，特别是在线性校准步骤中确定的扫描线数和增量。对大量表达同时带有供体标签和受体标签蛋白的细胞，重复进行细胞定位和荧光数据采集过程。在获得足够数量的同时表达两种标签蛋白的细胞荧光图像后，需针对仅表达带有供体荧光探针标签蛋白的细胞以及仅表达带有受体荧光探针标签蛋白的细胞，重复整个实验流程。

最后，利用先前所述的方法对所有扫描数据进行重建，以获得每组数据的光谱分辨的XY荧光强度空间图。以下三幅图所示即为通过对表达α因子受体的酵母细胞进行光谱分辨双光子显微测量所计算得到的空间图。通过分析从细胞各个位置获得的光谱发射谱，得到了供体和受体信号的二维图谱。

根据荧光强度的数值为其分配伪彩色，该比例尺以插图形式显示。随后利用KDA和KAD图像，结合从上述细胞的表观FRET效率图中提取的数值，计算出表观FRET效率的二维图谱，并绘制了直方图。细胞测得的EAPP值用圆圈表示。

红色实线表示使用由绿色实线代表的单个钙函数之和对实测数据进行的最佳拟合。对直方图的分析（在方案文本中有所描述）证实，无菌的双α因子受体全韧带复合物在体内呈现RBA形状的四聚体形式。一旦掌握，该技术若操作得当，可在12小时内完成。

进行此实验时，重要的是保持激发光源的功率较低。应避免单个脉冲对供体产生多次激发。