甲病毒转导系统：蚊媒感染可视化工具

甲病毒是一类通过蚊子传播的RNA病毒，可在易感蚊细胞中持续感染，且细胞病变效应极轻微。本实验方案展示了表达荧光报告基因的感染性甲病毒转导系统的应用，可用于检测媒介感染及病毒传播情况。首先，让雌性蚊子摄食含有目标甲病毒的血液，随后评估蚊子的感染效率，并筛选出表达标记基因的蚊子。

接下来，采集感染蚊虫的唾液，并通过将收集的唾液接种于培养的蚊虫细胞来验证其传播能力。利用落射荧光显微镜获取结果。通过观察类似GFP的报告蛋白的表达，从而追踪媒介感染情况以及病毒在按蚊或伊蚊等蚊种中的传播过程。

甲病毒表达系统（ATSs）可用于快速评估基因表达和传播性病毒的媒介蚊子，不仅适用于虫媒病毒研究，也可在进行更复杂的蚊子操作（如蚊子转基因）之前使用。本次演示这些实验操作的是来自肯·奥尔森（Ken Olson）实验室的埃尔玛·桑切斯-瓦尔加斯（Irma Sanchez Vargas）博士、埃里克·莫斯尔（Eric Mossel）博士以及亚伦·菲利普斯（Aaron Phillips）。为了在BHK-21细胞中产生TS病毒，需使用一种Symbis重组病毒，该病毒在体外转录后可表达GFP报告基因，随后将基因组甲病毒转导系统RNA电穿孔导入BHK-21细胞中。

在感染前拯救并扩增病毒。通过饥饿处理使蚊子为高效的人工饲血做好准备。饲血前24小时移除糖分，12小时前移除水分。

将市售的经去纤维蛋白或枸橼酸盐抗凝处理的动物血液与制备好的细胞培养来源的TS病毒悬液混合，以实现对蚊虫中肠的高效感染。配制每毫升含10的7次方个空斑形成单位的病毒滴度作为血餐，以刺激蚊虫充分吸血。加入TP，使其终浓度为0.02摩尔。

将孔膜肠膜置于水套玻璃喂食器的开口处。接着，将喂食器连接循环的37°C水。然后用移液器将食物加入腔室，并将喂食器稳固地放置在纸箱上。

让蚊子吸血10至30分钟后，将蚊子进行低温麻醉，筛选出吸血饱满的个体，以允许所选蚊子体内TS病毒的复制与扩散。在28°C和75%相对湿度条件下孵育8至10天。为固定蚊子。

将装有纸片的纸盒置于 4 摄氏度环境中约 15 分钟。随后，将 5 至 10 只蚊子转移至适配荧光显微镜使用的冷藏操作台。根据蚊子是否发出荧光进行观察和分类。

将选中的蚊子放回纸箱，根据需要使用。此时，利用荧光强度作为指标，测定感染效率。最后，解剖中肠、唾液腺和脂肪体等组织，并检测荧光情况。

如有需要，可于更早时间解剖这些器官和组织。在喂食前 24 小时，使蚊虫脱离糖源。准备一支 50 微升的毛细管，经加热、拉伸和剪切后，加入三至五微升 Cargill。

使用B型浸油以确保蚊子不会逃逸。去除蚊子的足和翅膀。现在将喙插入管中。

密切观察从蚊子喙部渗入浸油中的唾液滴。如有必要，在60至90分钟后，可在蚊子胸部放置一滴1%匹鲁卡品以促进唾液分泌；随后取出蚊子，并将其保存以备后续病毒分离。现在从毛细管中收集溶液时，将唾液与油的混合物排出至含有500 µL 20% FBS PBS的无菌管中。

将接种物通过0.2微米注射器滤器过滤，然后用此接种物感染培养的蚊源细胞。通过GFP的表达情况评估五端非翻译区DS MRE 16 GFP病毒的感染效果。随着时间推移，这些细胞以0.01的感染复数被病毒感染。

倒置荧光显微镜可对感染后10天的蚊虫整体以及不同身体部位中的GFP进行全视野观察。GFP在特定器官的选择性表达提示存在播散性感染。中肠通常在摄入含病毒血餐后早期出现明显的感染灶，随后感染逐渐扩散至中肠后部。

这些事件由GFP和DS RED报告基因指示。传播实验表明，5'端DS MRE 16 GFP病毒在整个外潜伏期稳定表达GFP。在此蚊子中，感染后第8天即可检测到GFP和蚊子唾液。

观看本视频后，您应能够充分了解如何通过口服方式使蚊子感染 A TS 病毒，如何直观评估蚊子体内的病毒感染情况，以及如何评估病毒从蚊子向外界的传播能力。