甲病毒转导系统:可视化，以免蚊虫感染的工具

α 病毒是蚊子传播的 RNA 病毒，以最小的细胞病理学持续感染易感蚊子细胞。该方案显示了表达荧光报告基因的传染性 α 病毒转导系统用于检测载体感染和病毒传播的效用。首先给雌性蚊子喂食含有目标 α 病毒的血粉，然后确定蚊子感染效率，并仅选择表达标记基因的蚊子。

接下来，从受感染的蚊子身上收集唾液，并通过用收集的唾液感染培养的蚊子细胞来证明传播性。通过 epi 荧光显微镜获得的结果。可视化 GFP 等蛋白质报告，从而跟踪 80 或 QE 种类蚊子的媒介感染和病毒传播。

α 病毒表达系统或 ATS 可用于快速评估基因表达和媒介蚊子，用于虫媒病毒研究，以及在进行更困难的蚊子作（如蚊子转基因）之前。来自 Ken Olson 博士实验室的 Irma Sanchez Vargas 博士、Eric Mossel 博士和 Aaron Phillips 将演示这些程序。为了在 Bhk 21 细胞中产生 TS 病毒，使用在体外转录后表达 GFP 报告基因的 symbis 重组病毒，将基因组 α 病毒转导系统 RNA 电速率到 bhk 21 细胞中。

然后在感染之前抢救和扩增病毒。通过食物剥夺从人工喂食器高效喂血的 Prime 蚊子。喂食前 24 小时去除糖，12 小时脱水。

将商业获得的除颤或柠檬酸盐动物血液与制备的细胞培养物混合，衍生出 TS 病毒悬浮液，用于蚊子的高效中肠感染。配制每毫升 10 比 7 噬菌斑形成单位的病毒滴度，用于血粉，以刺激蚊子肿胀。添加 TP 至终浓度为 0.02 摩尔。

将孔标志肠膜放在水套玻璃喂食器的口上。接下来，用循环的 37 摄氏度水设置喂食器。然后将餐粉移液到腔室中，并将喂食器牢固地放在纸箱上。

喂食蚊子 10 至 30 分钟后，对冷麻醉蚊子进行分类，寻找充血标本，以便在选定的蚊子中复制和传播 TS 病毒。将它们在 28 摄氏度和 75% 相对湿度下孵育 8 到 10 天。为了固定蚊子。

将纸箱置于 4 摄氏度下约 15 分钟。现在，将 5 到 10 只蚊子转移到适合在荧光显微镜上使用的冷却台上。根据荧光的存在与否对蚊子进行检查和分类。

将选定的蚊子放回纸箱中，以便根据需要使用。此时，使用荧光强度作为代理确定感染效率。最后，解剖组织中脏，如中肠、SIV 腺体和脂肪体，并监测荧光。

如果需要，可以更早地解剖这些器官和组织。喂食前 24 小时剥夺蚊子的糖源。准备一根 50 微升的毛细管，该管已加热、拉动并用 3 至 5 微升 Cargill 剪断。

B 型浸油，确保蚊子不会逃脱。去掉他们的腿和翅膀。现在将 probos 插入管中。

仔细监测从长鼻渗出到浸油中的唾液滴。如有必要，在 60 至 90 分钟后，将 1% 毛果芸香碱滴在蚊子胸部以增加流涎，取出蚊子并储存起来以备将来病毒分离。现在要从毛细管中收集溶液，将唾液油混合物排出到含有 500 微升 20%F-B-S-P-B-S 无菌的试管中。

通过 0.2 微米注射器过滤器过滤接种物，然后使用该接种物感染蚊子细胞中的培养细胞。通过 GFP 的表达评估 5 种主要 DS MRE 16 GFP 病毒感染的疗效。随着时间的推移，这些细胞以 0.01 的感染复数

落射荧光显微镜可以在感染后 10 天观察受感染蚊子以及身体不同部位的 GFP 的全身。GFP 的器官选择性表达提示播散性感染。中肠通常在摄入含有病毒的血粉后早期出现明显的病灶感染，该病毒在感染后后期传播到整个后中肠。

这些事件由 GFP 和 DS RED 报告器发出信号。传播试验表明，5 个引物 DS MRE 16 GFP 病毒在整个外源性潜伏期内稳定表达 GFP。在这里的蚊子中，GFP 和蚊子唾液最早在感染后 8 天就被检测到。

观看此视频后，您应该对如何口服 A TS 病毒感染蚊子、如何目视评估蚊子的病毒感染以及如何评估蚊子的病毒传播有很好的了解。