Name: 与VirusMapper超分辨率显微镜开源单粒子分析 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 38 s
Description: 了解如何使用VirusMapper开源软件对超分辨率显微镜图像进行单粒子分析，以生成病毒的高精度分子模型。该方法可揭示病毒感染过程中的纳米级结构变化。

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我们感谢 Corina Beerli、Jerzy Samolej、Pedro Matos Pereira、Christopher Bleck 和 Kathrin Scherer 对 VirusMapper 最初开发与验证工作的贡献。我们还要感谢 Artur Yakimovich 对手稿的审阅。本研究由生物技术和生物科学研究中心基金（BB/M022374/1）（R.H.）；伦敦大学学院医学研究理事会分子细胞生物学实验室的核心资助（J.M.）；欧洲研究理事会基金（649101-UbiProPox）（J.M.）；以及医学研究理事会基金（MR/K015826/1）（R.H. 和 J.M.）资助。R.G. 由工程与物理科学研究理事会（EP/M506448/1）资助。

注意：本方案及视频是对原始论文10的补充，原始论文更详细地描述了该软件包。建议读者仔细查阅该论文，以获得有关软件使用的更多指导。整个流程主要包括三个阶段：颗粒提取，即将大图像分割为单个颗粒；种子选择，在此阶段识别数据中的共同结构并进行比对以生成种子，这些种子将用于最后阶段；以及模型生成，在此阶段基于这些种子通过模板匹配对提取的颗粒进行比对，并对部分颗粒进行平均以生成单颗粒分析（SPA）模型。
1. 运行软件包前的准备工作
<ol>
	<li>在盖玻片上或相应的实验条件下制备待研究结构的样品。</li>
	<li>使用超分辨率荧光显微镜对样品进行成像，例如结构光照明显微镜（structured illumination microscopy, SIM）11 或受激发射损耗显微镜（stimulated emission depletion, STED）12。 
	注意：样品制备与成像的具体细节在很大程度上取决于待研究结构的性质，因此应参考相关文献。例如，本实验中所用的痘苗病毒样品的制备与成像具体方法详见代表性结果部分。</li>
	<li>获取多个视野的图像，显示大量独立的结构或颗粒，最好达到数千个。应尽可能选择彼此分离良好的颗粒进行成像，并确保图像中无灰尘或其他非目标荧光结构。</li>
	<li>在 Fiji 中打开所有包含颗粒的图像，可通过将文件拖入 Fiji 工具栏，或选择 &#34;文件">“打开&#34; 来实现。</li>
	<li>选择 &#34;图像">“堆栈">“工具">“拼接&#34;，将图像合并为单个堆栈。如果生成的图像是多维堆栈（Hyperstack），则通过选择 &#34;图像">“多维堆栈"> &#34;多维堆栈转为堆栈&#34; 将其转换为普通堆栈。 
	&#8203;注意：最终堆栈应为通道交错排列。若存在两个通道，则堆栈中的第一层应为第一幅图像的通道1，第二层为对应的通道2，第三层为第二幅图像的通道1，依此类推。</li>
</ol>
2. 提取颗粒
<ol>
	<li>选择要分割的图像并选中 &#34;提取病毒结构&#34;选择提取出的粒子的保存位置并进行查看 &#34;提取病毒结构&#34; 对话图2).</li>
	<li>通过输入初始估计值来设定提取参数 &#34;提取病毒结构&#34; 如下对话框所示。在预览图像分割后微调这些参数。
	<ol>
		<li>将数据集中通道的数量设置为已成像的不同荧光通道的数量（例如， 2).</li>
		<li>通过输入所选通道的编号，设定用于检测该通道中峰并从中提取粒子的参考通道。选择最一致的通道，即大多数粒子呈现相同形态的通道。 
		&#8203;注意：如果可能，该通道中的颗粒将具有中心最大值。</li>
		<li>选择是否应用检测前高斯模糊。将检测前高斯模糊设为 0 表示不应用模糊；若增加该值，则在局部最大值检测前会应用指定半径的高斯模糊滤波器。如果参考通道没有中心最大值，可使用此功能例如， 环形；模糊会诱导出一个环形的外观。 
		&#8203;注意：选定的感兴趣区域（ROIs）不应用高斯模糊处理，因为该功能仅用于在参考通道中定位ROIs。</li>
		<li>设置感兴趣区域（ROI）的半径（以像素为单位，该半径将围绕每个局部最大值设定）。选择的数值应使 ROI 略大于最大的颗粒，例如 图3例如，如果最大颗粒的直径目测约为30像素，则将感兴趣区域（ROI）半径设置为20像素。</li>
		<li>将每帧使用的 ROI 数量设置为一个初始的、相对较小的值，低于 100。</li>
		<li>设置最大ROI重叠度。若颗粒物分离良好，应保持该值较小；若颗粒物成簇聚集，则增大该值以允许ROI之间发生重叠。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>选择 &#34;显示预览&#34;. 
	注意：选中此项后，将显示与当前帧关联的参考通道的已提取感兴趣区域（ROI）。</li>
	<li>调整ROI半径、ROI数量以及最大ROI重叠度，使尽可能多的颗粒周围具有合适大小的ROI，如 图3.</li>
	<li>选择 &#34;好的&#34; 运行分割。关闭图像和ROI管理器。 
	&#8203;注意：不要更改粒子集文件的名称。这些名称必须采用以下格式 &#34;病毒颗粒 - channelX&#34; 以下各节。</li>
</ol>
3. 选择种子
<ol>
	<li>选择 &#34;生成种子&#34;，选择提取出的粒子所保存的文件夹，然后查看 &#34;生成种子&#34; 对话框和窗口（图4).</li>
	<li>通过输入参数来设定初始种子选择参数 &#34;生成种子&#34; 对话，如下所示。
	<ol>
		<li>设置用于拟合的参考通道，以对齐并居中所有通道。选择一个大多数颗粒外观一致且具有中心极大值的通道作为参考，如果可能的话。</li>
		<li>选择所有需要生成种子的通道对应的复选框。</li>
		<li>选择种子是否应旋转90°。使用此功能可使对齐方式与其他模型保持一致</li>
		<li>选择是否应用预对齐高斯模糊。将各通道的模糊半径设置为 0 可不应用模糊。增加该值可在重新对齐前应用指定半径的高斯模糊滤波。如果颗粒缺乏中心极大值，可使用此功能；模糊可使其呈现出中心极大值。 
		&#8203;注意：种子不会应用模糊效果，因为此功能仅用于实现一致的对齐。</li>
		<li>选择是否通过勾选或取消勾选该选项，对非参考通道的种子进行平移校正以分别居中，但不进行旋转。 &#34;平移校正&#34; 每个通道的盒子。 
		注意：当各通道之间未良好对齐时，请使用此选项；也可用于仅根据参考通道对其他通道进行对齐，而不进行偏移校正。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>选择用作种子的颗粒。浏览颗粒序列，找到一个与待建模结构相似的颗粒，并记录其帧号。</li>
	<li>输入数字到 &#34;使用帧数&#34; 盒中，将出现更多窗口（图5）。输入多个帧编号，以逗号分隔。</li>
	<li>在弹出的窗口中查看种子帧及其生成的平均种子。 
	注意：日志将推荐与平均值相似的种子。</li>
	<li>调整参考通道、高斯模糊半径以及位移校正选项，以优化种子选择过程，使所找到的种子帧数量具有相似的外观。持续添加种子，直至生成的平均种子能够充分反映待建模数据中观察到的结构。</li>
	<li>命名种子及其保存位置，然后选择 &#34;好的&#34; 以保存最终的种子图像，供后续模型生成使用。</li>
</ol>
4. 生成模型
<ol>
	<li>选择 &#34;基于种子生成模型&#34;，选择提取出的粒子所保存的文件夹，并查看 &#34;生成模型&#34; 对话（图6).</li>
	<li>使用复选框加载每个通道的种子。 
	&#8203;注意：种子将保存在一个此前已命名的子文件夹中 &#34;生成种子&#34; 对话框。默认名称为 &#34;分析&#34;. 仔细选择种子 平均值，而非用于参考的帧图像，帧图像也会被保存。</li>
	<li>输入参数以设定初始模型生成的参数 &#34;生成模型&#34; 对话，如下所示。之后可微调这些参数。
	<ol>
		<li>选择是否使用参考通道进行对齐，该选项仅根据参考通道计算平移和旋转，并将结果应用于所有通道。如果使用此选项，请选择用作参考的通道。 
		&#8203;注意：仅在需要将某一通道特别用作参考时选择此选项，例如进行基于参考的结构发现时。否则，将导致模型准确性降低。使用此选项时，各通道应实现良好对齐。</li>
		<li>选择在模板匹配期间是否对图像强度进行平方处理。该选项会突出微小差异，因此在创建具有特别细微特征的模型时使用。</li>
		<li>通过使用种子选择最小相似度 &#34;种子序列的最低相似度&#34; 滑块或通过在框中输入数字。 
		&#8203;注意：仅相似度高于此阈值的颗粒会被使用。通常以60-80%作为起始值较为合适。</li>
		<li>将最大迭代次数设置为1，针对种子优化最小相似性，然后根据需要逐步增加。</li>
		<li>勾选相应的框以选择将要显示的模型生成过程的组成部分。 
		注意： &#34;展示种子&#34; 将显示已加载到对话框顶部方框中的种子。 &#34;展示模型&#34; 将显示所有通过将与种子达到最低相似度的粒子子集进行平均而生成的模型迭代结果。 &#34;显示 MSE&#34; 将显示一幅均方误差（MSE）图像，突出显示模型中变异性最大的区域。 &#34;显示颗粒&#34; 将显示用于构建模型的粒子子集，并根据所显示模型的最高迭代次数进行配准。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>选择 &#34;显示预览&#34; 生成预览模型并查看结果。 
	注意：这是整个过程中计算量最大的步骤。在台式计算机上处理包含数千个粒子的数据集（粒子直径为几十个像素）大约需要10分钟。如果计算时间较长，用户可先尝试使用数据的较小子集进行算法测试，或在步骤2.2.4中使用较小的ROI半径（若可行）。</li>
	<li>查看生成的模型并优化参数，特别是与种子的最小相似性阈值。逐步提高与种子的最小相似性，直至模型中仅包含具有目标形态的真实颗粒。</li>
	<li>使用以下方法增加最大迭代次数 &#34;最大迭代次数&#34; 通过滑块或在输入框中键入数值来设置，并允许模型生成过程进行迭代。最大迭代次数建议设为10左右。</li>
	<li>命名模型并选择 &#34;好的&#34; 用于保存包含最终模型生成过程所有迭代的模型演化堆栈。 
	注意：如果与种子的最小相似度设置过高，导致没有任何粒子达到该相似度，则不会更新任何内容。如果插件似乎处于冻结状态，请考虑最小相似度可能设置过高的情况。</li>
</ol>

<ol><li>Henriques, R., Griffiths, C., Rego, E. H., Mhlanga, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PALM+and+STORM%3A+Unlocking+live-cell+super-resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Biopolymers%22%5BJournal%5D)">PALM and STORM: Unlocking live-cell super-resolution.</a> Biopolymers. 95 (5), 322-331 (2011).</li>
<li>Gustafsson, N., Culley, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+live-cell+conventional+fluorophore+nanoscopy+with+ImageJ+through+super-resolution+radial+fluctuations%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Fast live-cell conventional fluorophore nanoscopy with ImageJ through super-resolution radial fluctuations.</a> Nat Commun. 7, 12471(2016).</li>
<li>Cheng, Y., Grigorieff, N., Penczek, P. A., Walz, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Primer+to+Single-Particle+Cryo-Electron+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A Primer to Single-Particle Cryo-Electron Microscopy.</a> Cell. 161 (3), 438-449 (2015).</li>
<li>Szymborska, A., de Marco, A., Daigle, N., Cordes, V. C., Briggs, J. A. G., Ellenberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+pore+scaffold+structure+analyzed+by+super-resolution+microscopy+and+particle+averaging%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Nuclear pore scaffold structure analyzed by super-resolution microscopy and particle averaging.</a> Science. 341 (6146), 655-658 (2013).</li>
<li>Broeken, J., Johnson, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resolution+improvement+by+3D+particle+averaging+in+localization+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Appl+Fluoresc%22%5BJournal%5D)">Resolution improvement by 3D particle averaging in localization microscopy.</a> Methods Appl Fluoresc. 3 (1), 14003(2015).</li>
<li>Burns, S., Avena, J., Unruh, J., Yu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structured+illumination+with+particle+averaging+reveals+novel+roles+for+yeast+centrosome+components+during+duplication%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Structured illumination with particle averaging reveals novel roles for yeast centrosome components during duplication.</a> Elife. , (2015).</li>
<li>Lelek, M., Di Nunzio, F., Henriques, R., Charneau, P., Arhel, N., Zimmer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Superresolution+imaging+of+HIV+in+infected+cells+with+FlAsH-PALM%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Nat+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Superresolution imaging of HIV in infected cells with FlAsH-PALM.</a> Proc Nat Acad Sci U S A. 109 (22), 8564-8569 (2012).</li>
<li>Laine, R. F., Albecka, A., Svan de Linde,, Rees, E. J., Crump, C. M., Kaminski, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+analysis+of+herpes+simplex+virus+by+optical+super-resolution+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Structural analysis of herpes simplex virus by optical super-resolution imaging.</a> Nat Commun. 6, 5980(2015).</li>
<li>Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Gray, R. D. M., Beerli, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VirusMapper%3A+open-source+nanoscale+mapping+of+viral+architecture+through+super-resolution+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">VirusMapper: open-source nanoscale mapping of viral architecture through super-resolution microscopy.</a> Sci Rep. 6, 29132(2016).</li>
<li>Gustafsson, M. G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surpassing+the+lateral+resolution+limit+by+a+factor+of+two+using+structured+illumination+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+of+Micros%22%5BJournal%5D)">Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy.</a> J of Micros. 198 (2), 82-87 (2000).</li>
<li>Hell, S. W., Wichmann, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breaking+the+diffraction+resolution+limit+by+stimulated+emission%3A+stimulated-emission-depletion+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Opt+Let%22%5BJournal%5D)">Breaking the diffraction resolution limit by stimulated emission: stimulated-emission-depletion fluorescence microscopy.</a> Opt Let. 19 (11), 780(1994).</li>
<li>Chung, C. -S., Chen, C. -H., Ho, M. -Y., Huang, C. -Y., Liao, C. -L., Chang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vaccinia+virus+proteome%3A+identification+of+proteins+in+vaccinia+virus+intracellular+mature+virion+particles%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Vaccinia virus proteome: identification of proteins in vaccinia virus intracellular mature virion particles.</a> J Virol. 80 (5), 2127-2140 (2006).</li>
<li>Moss, B. Poxviridae: the viruses and their replication. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMoss%2C+B+%22Fields+virology%22">Fields virology</a>. , Ovid. (2010).</li>
<li>Condit, R. C., Moussatche, N., Traktman, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+a+nutshell%3A+structure+and+assembly+of+the+vaccinia+virion%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Virus+Res%22%5BJournal%5D)">In a nutshell: structure and assembly of the vaccinia virion.</a> Adv Virus Res. 66 (6), 31-124 (2006).</li>
<li>Schmidt, F. I., Bleck, C. K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vaccinia+virus+entry+is+followed+by+core+activation+and+proteasome-mediated+release+of+the+immunomodulatory+effector+VH1+from+lateral+bodies%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Vaccinia virus entry is followed by core activation and proteasome-mediated release of the immunomodulatory effector VH1 from lateral bodies.</a> Cell Rep. 4 (3), 464-476 (2013).</li>
<li>Nanoj-virusmapper. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://bitbucket.org/rhenriqueslab/nanoj-virusmapper">https://bitbucket.org/rhenriqueslab/nanoj-virusmapper</a> (2016).</li>
<li>Fortun, D., Guichard, P., Unser, M. <a target="_blank" href="http://ieeexplore.ieee.org/document/7389457/">Reconstruction From Multiple Poses in Fluorescence Imaging: Proof of Concept.</a> IEEE J Sel Topics Signal Process. 10 (1), 61-70 (2016).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

通过该方法，研究人员能够结合单粒子分析（SPA）和超分辨率显微技术的力量，以生成病毒及其他大分子复合物蛋白质结构的高精度、多通道二维模型。然而，一些重要的因素需要加以考虑。
应选择能够代表数据中一致存在的结构的种子。因此，在选择种子之前，必须仔细检查原始数据。这对于防止产生有偏倚的模型至关重要。可以通过检查为包含特定数量粒子所需达到的最低相似性阈值来验证种子的选择。显然，对于某一特定种子，若要包含给定数量的粒子所需设定的阈值越高，则说明该结构在数据中越明显。
当数据存在异质性时，模板匹配的概念尤为有用。所有可见的不同结构都应被识别，并为每种情况创建不同的模型。通过在一个通道中分离异质结构，同时在另一个通道中创建模型，可能揭示出原本并不明显存在的模式。
使用该算法时还需注意，迭代过程会最大化随机不对称性。例如，在对具有两个对称极大值的结构进行建模时，迭代过程中这两个极大值之间的所有微小不对称性将被相互对齐，最终模型因而会呈现最大程度的不对称性。如果这与所建模结构中已知的对称性不符，则应予以考虑。目前，避免这种最大化效应的唯一方法是将迭代次数限制为1次，但未来可能的改进方向是使VirusMapper在模型生成过程中纳入对称轴。VirusMapper的任何新版本都将在引用的网站上提供（参见材料表）。用户还可在此找到常见问题解答，以回应常见疑问。
所描述的软件适用于任何能够以足够分辨率成像的结构，以便可视化用户希望建模的特征。尽管单颗粒分析（SPA）可以提高分辨率，但它显然无法增强原本不可见特征的可见性。因此，本方案并非用于提高数据质量的方法。与任何技术一样，仔细的样品制备和成像策略的优化将提供最清晰的数据和最佳的最终模型。
超分辨率成像方式的选择同样重要，通常取决于具体的样本。VirusMapper 已经被验证可与 SIM 和 STED10 良好兼容，也可用于高质量的定位显微镜数据，但在这种情况下需格外注意，稀疏标记可能导致类似于不对称性最大化所产生的问题。
目前，VirusMapper 是唯一可免费获取的用于荧光图像单颗粒分析的算法，也是唯一通用的二维单颗粒分析平均软件。其他采用相同原理的研究4,6,8均使用了为特定研究定制的专用软件。尽管已有通用算法用于三维数据重构的发表5,18，但均未提供相应的软件。
按照本文所述方法使用时，VirusMapper 可用于生成病毒及其他复合物大分子蛋白质结构的精确、准确且稳健的模型。利用这些模型，研究人员能够对所研究结构的平均尺寸进行精确测量，从而有可能得出原本无法获得的生物学结论。
此外，利用该技术的多通道能力，可以对复合物内无限数量的蛋白质和组分进行定位，并发现新的蛋白质组织模式。在不同的生物学相关条件下（例如病毒生命周期的不同阶段）研究纳米尺度结构的变化，有望为生物学提供有价值的见解。

超分辨率（SR）显微技术通过实现对关键分子过程的成像，并结合理解这些过程所必需的分子特异性标记，对细胞生物学产生了重大影响。如今，SR使得光学显微镜能够达到以往仅电子显微镜（EM）可实现的分辨率水平（20–150 nm），同时保留了光学显微镜的主要优势，例如对活细胞进行成像的潜力1,2。此外，纳米尺度下存在的结构保守性使得单颗粒分析（SPA）可应用于SR数据，这一概念在电子显微镜中已被广泛应用3。利用SPA，可以对同一结构的多个高度保守拷贝进行成像并加以平均，从而提高所观察对象的分辨率、精确度或信噪比。当与SR结合使用时，SPA已被证明是高精度绘制核孔复合体4,5、中心体6以及病毒（如HIV7和HSV-18）组分分布的有力工具。
然而，由于缺乏可用的软件，SR 与 SPA 的常规联合应用一直面临挑战。为此，我们开发了 VirusMapper，这是对广受欢迎的图像处理软件 ImageJ/Fiji9 的一个插件。这是首个可免费获取的、适用于荧光图像的通用 SPA 软件包10，旨在为采用 SR 显微镜成像的结构提供快速、用户友好、多通道的朴素平均分析。尽管该软件最初为病毒研究设计，但也可应用于任何可通过成像识别并定位不同分子种类的大分子复合物。
VirusMapper 可用于生成任何已知结构的高精度分子模型，从而计算平均尺寸及其他参数。该算法设计特别适用于分离不同结构群体，能够确定不同的取向或不同的形态状态。此外，在基础结构已知的情况下，可采用多通道成像并利用参考通道，从而实现基于参考的结构发现。软件的下载与安装说明请访问 <a href="https://bitbucket.org/rhenriqueslab/nanoj-virusmapper">https://bitbucket.org/rhenriqueslab/nanoj-virusmapper</a>。示例数据也可在该网站获取，建议用户先在示例数据上练习使用该软件，再尝试应用于自身数据。
本文描述了使用该插件从原始数据生成单粒子分析（SPA）模型的步骤。该软件以包含单标记或多标记结构的原始图像作为输入，根据运行过程中调整的多个参数，输出显示成像结构内标记组分平均分布情况的SPA模型。
本实验方案的目标是根据图1所示流程，生成精确的单粒子平均（SPA）模型，以反映成像结构中各组分的平均定位信息。如图1所示，软件工作流程可有效划分为三个阶段。第一阶段是对大尺寸图像进行分割，从而为每个通道生成粒子堆栈。这些粒子是用于创建模型以及生成模型种子的基本单位。第二阶段是生成种子图像，这些种子图像将在最终阶段用于对整套粒子进行配准。该过程通过选择一个参考通道，并在该通道中手动选取将用于生成种子的粒子来完成。种子在参考通道中选定，但可为所有通道生成。粒子首先通过在该通道中拟合二维高斯函数进行初始重对齐。所有被选中并完成重对齐的粒子将被平均，以生成一个种子。对于数据中需要建模的每一种常见结构，应选择能够清晰且准确代表该结构的粒子作为种子。此阶段的界面也有助于在数据中扫描和识别此类结构。
最后阶段是通过模板匹配生成模型。该过程通过将最初提取的颗粒与上一节生成的种子图像进行互相关配准来实现。选取一部分已配准的颗粒进行平均，若需要，可进一步迭代此过程以降低模型的均方误差。该子集的确定依据是设定与种子图像之间的最小相似性阈值，只有满足该阈值的颗粒才被纳入。当在多个通道中同时创建模型时，使用联合相似性，即各通道相似性的平均值。所得模型及其贡献颗粒可进一步用于后续分析。

<table><tbody><tr><td>Fiji</td><td></td><td></td><td>开源图像分析软件</td></tr><tr><td>NanoJ-VirusMapper</td><td>由 Henriques 实验室开发</td><td></td><td>开源 Fiji 插件（https://bitbucket.org/rhenriqueslab/nanoj-virusmapper）</td></tr><tr><td>VectaShield 抗荧光淬灭封片剂</td><td>Vector Labs</td><td>H-100</td><td></td></tr><tr><td>Elyra PS1</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ZEN BLACK</td><td>Zeiss</td><td></td><td>SIM 图像处理软件</td></tr><tr><td>高性能盖玻片</td><td>Zeiss</td><td>&amp;nbsp;474030-9000-000</td><td></td></tr><tr><td>TetraSpeck 微球</td><td>ThermoFisher</td><td>T7279</td><td></td></tr></tbody></table>

开源单颗粒分析软件virusmapper用于超分辨率显微镜研究

Open-source Single-particle Analysis for Super-resolution Microscopy with VirusMapper

超分辨率荧光显微镜目前正彻底改变细胞生物学研究。其突破约300 nm分辨率极限的能力，使得对纳米尺度生物复合物和生物过程的常规成像成为可能。分辨率的提升也意味着电子显微镜中常用的方法（如单颗粒分析）可直接应用于超分辨率荧光显微镜。通过将这种分析方法与超分辨率光学成像相结合，可以利用荧光显微镜对分子的特异性标记能力，生成亚稳态结构内分子组分的结构图谱。为此，我们开发了一种新型算法——VirusMapper，并将其封装为易于使用、高性能、高通量的ImageJ插件。本文对该软件进行了深入介绍，展示了其揭示生物分子复合物中新结构特征的能力。文中详细说明了如何准备兼容的数据，并提供了使用该算法对超分辨率图像进行单颗粒分析的逐步操作流程。

在此，我们以模式痘病毒——痘苗病毒为例来演示该软件的应用。痘苗病毒是结构最复杂的哺乳动物病毒之一，其呈砖形的病毒粒子大小约为 350 × 270 × 250 nm3，内部包裹约 80 种不同的蛋白质13,14。通过电子显微镜可分辨出三种亚结构：包含双链 DNA 基因组的中央核心；位于核心两侧的两个蛋白质结构，称为侧体；以及包裹在外层的单层蛋白脂质双分子层包膜15。由于其体积较大、结构复杂，且易于进行重组荧光蛋白标记，痘苗病毒是展示 VirusMapper 工作流程的理想体系。
使用此处所述软件，可对多种蛋白质在痘苗病毒粒子上的分布进行建模。对目标蛋白进行标记和成像，可能同时结合另一种已知分布的蛋白作为参考，然后按照所述方法使用该软件生成该蛋白在病毒颗粒上定位的平均模型。在本示例中，建模了两种蛋白：内层核心蛋白L4和主要侧体组分F17。
使用一种F17标记GFP、L4标记mCherry的重组痘苗病毒16。将纯化的病毒稀释于1 mM Tris（pH 9）中，并通过在室温下孵育30分钟将其结合到经洗涤的高性能盖玻片上。随后用含4%多聚甲醛的PBS固定样品20分钟。盖玻片立即用抗荧光淬灭封片剂封固于载玻片上。采用商用SIM显微镜进行SIM成像。选择包含数百个病毒的视野，使用561 nm（32 µm光栅周期）和488 nm（32 µm光栅周期）激光，结合5个相位移动和3个光栅旋转采集图像。使用sCMOS相机采集图像，并通过显微镜配套软件进行处理。根据使用相同成像参数采集的多色荧光微珠样品滑片对各通道进行对齐。SIM重构及通道对齐后，将图像在Fiji中打开并合并为单个图像序列。
使用 L4 通道作为参考，从图像中提取病毒颗粒，未应用任何高斯模糊，因为这些颗粒具有中心最大值。本实验中约提取了 15,000 个颗粒。
由于痘苗病毒的几何结构，其侧体根据病毒的取向呈现出明显不同的外观。我们观察到两种取向，分别可区分出一个或两个侧体，将其称为正面取向和矢状取向。
在“生成种子”阶段，通过浏览粒子列表，分别选择前额向和矢状向的种子（图4和图5）；选择那些明显属于某一取向的粒子。以L4通道作为参考通道，对种子进行相互对齐。同样，无需进行高斯模糊处理。每种取向各选取5个粒子，并对其进行平均以生成种子。
基于这些种子为每种取向生成了模型。未使用参考通道或平方强度值。最初将最大迭代次数设置为1，最小相似性设定为在每种情况下包含约1,000个颗粒，从而使得每种取向的模型外观保持一致。随后增加最大迭代次数，以允许模型收敛。因此，针对两个通道中的两种取向生成了模型（图7）.
<img alt="图1" src="/files/ftp_upload/55471/55471fig1.jpg" /> 
图1： VirusMapper 工作流程。 该插件分为三个主要阶段。首先从大尺寸图像中提取病毒颗粒，然后从数据中半手动选择模板图像或种子，最后参照这些种子从数据中生成最终的单颗粒分析（SPA）模型。 <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55471/55471fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="图 2" src="/files/ftp_upload/55471/55471fig2.jpg" /> 
图 2： “提取病毒结构”对话框。 选择“提取病毒结构”时，将弹出此对话框。应使用初始估计值填写参数，以实现最佳分割效果。随后可选择“显示预览”，以便预览感兴趣区域（ROI），并对参数进行精细调整。 <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55471/55471fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="图3" src="/files/ftp_upload/55471/55471fig3.jpg" /> 
图3： 设置提取参数。 在预览将要提取的感兴趣区域（ROI）后，调整ROI半径、ROI数量和最大ROI重叠度，以达到如图所示的效果。ROI略大于颗粒，所有颗粒均被包含在某个ROI内，且ROI之间可充分重叠，以便分离成簇的颗粒。<a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55471/55471fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="图4" src="/files/ftp_upload/55471/55471fig4.jpg" /> 
图4： 生成模板匹配种子。 “生成种子”对话框（1）用于设置需指定的参数。参考粒子序列（2）允许用户浏览参考通道中的粒子。当在参考粒子序列中查看某个粒子时，可在重新对齐粒子预览窗口（3）中查看所有通道的重新对齐后的粒子。<a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55471/55471fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="图5" src="/files/ftp_upload/55471/55471fig5.jpg" /> 
图5： 添加种子图像。 当向“要使用的帧”框中添加种子时，系统将显示所有种子的平均图像（4）以及所涉及的帧（5）。对话框中会推荐与当前平均种子相似的颗粒（6）。<a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55471/55471fig5large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="图6" src="/files/ftp_upload/55471/55471fig6.jpg" /> 
图6： “生成模型”对话框。 当选择“基于种子生成模型”时，将出现此对话框。应填入初始估计值以实现最优模型生成，并选择在计算过程中显示的模型生成步骤。随后可选择“显示预览”，以运行模型生成过程并对参数进行精细调整。<a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55471/55471fig6large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="图7" src="/files/ftp_upload/55471/55471fig7.jpg" /> 
图7： 使用VirusMapper生成的模型。 对L4核心蛋白标记mCherry、F17侧体蛋白标记EGFP的痘苗病毒颗粒，采用SIM成像，并按照本方案所述方法利用软件生成模型。两个方向（正面和矢状面）可通过侧体的形态加以区分。比例尺 = 100 nm。 <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55471/55471fig7large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

本手稿使用基于 Fiji 的开源软件包 VirusMapper，对超分辨率显微镜图像进行单颗粒分析，以生成纳米尺度结构的精确模型。

开源单颗粒分析软件VirusMapper用于超分辨率显微镜研究

超分辨率荧光显微镜技术目前正在彻底改变细胞生物学研究。其突破约300 nm分辨率极限的能力……

本实验的总体目标是通过对带有荧光标记组分的结构进行超分辨率成像，并应用单颗粒分析方法，获得病毒或大分子复合物的高精度分子模型。该方法能够解答病毒学领域中的关键问题，包括复杂病毒的蛋白质结构及其在感染过程中发生的变化。该技术的主要优势在于，通过采集同一结构的多幅图像，可以生成其组分的高精度定位图谱。尽管该方法可用于研究病毒的结构，但也适用于其他系统，例如其他病原体以及哺乳动物细胞内的大分子复合物。首先，使用超分辨率荧光显微镜对样品进行成像。获取多个视野的图像，每个视野应包含数百至数千个分离良好的颗粒，且无非特异性荧光结构。获取并处理图像后，将图像导入并拼接成一个通道交错的图像栈。如有必要，将拼接后的图像从超栈转换为普通图像栈。接下来，在 VirusMapper 子菜单中选择“提取病毒结构”，并设置提取出的病毒颗粒的文件路径。填写成像的荧光通道数量。将参考通道设置为颗粒形态最一致的荧光通道。如果这些颗粒缺乏中心极大值，可应用检测前高斯模糊以使其呈现出中心极大值。接下来，估算最大颗粒的直径（以像素为单位）。将感兴趣区域（ROI）的半径设置为略大于该值的一半。估算每帧所需的 ROI 数量。最初使用的 ROI 数量不要超过一百个。根据颗粒间距设置最大 ROI 重叠度。预览该帧的 ROI。调整半径、ROI 数量和最大重叠度，使帧中的每个颗粒都被单个 ROI 包围。确保 ROI 的宽度至少比最大的颗粒宽几个像素。然后，单击“确定”以运行分割。提取完成后，在 ROI 管理器中关闭样本图像。不要重命名提取出的粒子集。选择“生成种子”，然后打开包含提取粒子数据的文件夹。设置参考通道，并选择所有需要生成种子的通道。如有必要以匹配先前的模型，可将种子旋转九十度。对于颗粒缺乏中心最大值的通道，如前所述，增加预对齐的高斯模糊值。如果通道未紧密对齐，请为非参考通道启用偏移校正。在粒子序列中搜索持续出现的结构。确定一个代表性粒子，并在“要使用的帧”字段中输入相应的帧编号。检查获得的种子。种子筛选是该流程中的关键步骤。仔细查看原始数据，以确定一个或多个待建模的结构。模型质量在很大程度上取决于所选种子是否能准确反映这些结构。根据需要调整参考通道、高斯模糊半径和漂移校正，以优化识别出更多含有相似种子的图像帧。持续添加图像帧并调整生成参数，直至平均结构最能代表数据中观察到的结构。输入种子的文件夹名称和文件前缀。单击“确定”以保存种子图像，用于后续建模。选择“基于种子生成模型”，并打开已提取的粒子文件夹。加载每个通道的种子平均值。如果进行基于参考的结构发现，请选择一个参考通道用于比对。一个通道中已知的颗粒结构可作为参考，用于比对第二个未知通道。这有助于对未知结构进行无偏映射。需注意，通道间的色差必须预先校正。如果分析旨在寻找模型中的微小差异或细微特征，请在模板匹配时选择“方阵图像强度”。将最小相似度设置在百分之六十至百分之八十之间，迭代次数设置为一次。选择在计算过程中显示的模型和粒子，并生成预览模型。检查预览模型。提高最小相似度，以仅包含具有目标形态的颗粒。根据需要优化其他模型计算参数，并在模型生成过程中选择要显示的额外元素。当预览模型满意后，将迭代次数增加至十次。设置文件夹名称和文件前缀。单击“确定”以保存包含最终模型所有迭代的模型演化堆栈。一种重组痘苗病毒，其两种蛋白质分别标记有绿色和红色荧光蛋白，通过结构照明显微镜成像，并使用 VirusMapper 插件进行建模。分别针对冠状面和矢状面方向生成了种子模型，每个模型均基于五个代表性颗粒进行平均。根据病毒的方向不同，可区分出一个或两个侧向体。因此，可针对这两种方向分别生成独立的模型。在进行该实验流程时，需要牢记模型的质量在很大程度上取决于所获取原始数据的质量。尽管单颗粒分析可以提高分辨率，但它无法弥补图像质量低下的问题。完成本流程后，可对这些模型进一步进行定量分析或模型拟合。这有助于回答有关感染过程中病毒结构在纳米尺度上变化等特定问题。观看本视频后，您应能够充分理解如何使用单颗粒分析软件VirusMapper，从超分辨率图像中生成分子结构模型。

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科研

JoVE Journal

Biology

生物学

与VirusMapper超分辨率显微镜开源单粒子分析

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