与VirusMapper超分辨率显微镜开源单粒子分析

该程序的总体目标是通过将单颗粒分析应用于具有荧光标记成分的结构的超分辨率图像来生成病毒或大分子复合物的高精度分子模型。这种方法可以回答病毒学领域的关键问题，包括复杂病毒的蛋白质结构，以及它在感染过程中如何变化。这种技术的主要优点是，通过收集相同结构的多个图像，可以生成其组件的高精度图。

虽然这种方法可以提供对病毒结构的见解，但它也可以应用于其他系统，例如哺乳动物细胞内的其他病原体和大分子复合物。首先，使用超分辨率荧光显微镜对样品进行成像。采集多个视场的图像，其中包含数百到数千个分离良好的颗粒，没有不需要的荧光结构。

获取并处理图像后，将图像导入并连接到具有插层通道的堆栈中。如有必要，将串联图像从超堆栈转换为堆栈。接下来，在 VirusMapper 子菜单中选择 Extract Viral Structures（提取病毒结构），并设置提取的粒子的文件路径。

填写成像的荧光通道数。将参比通道设置为颗粒外观最一致的荧光通道。如果这些粒子缺少中心最大值，则应用预检测高斯模糊以诱导一个粒子的外观。

接下来，估计最大粒子的直径（以像素为单位）。将 ROI radius 设置为略高于该值的一半。估计每帧所需的 ROI 数量。

最初使用不超过 100 个 ROI。根据粒子分离设置最大 ROI 重叠。预览该帧的 ROI。

调整半径、ROI 数量和最大重叠度，以便帧中的每个粒子都包含在单个 ROI 中。确保 ROI 至少比最大的颗粒宽几个像素。然后，单击 OK"运行分段。

提取后，在 ROI 管理器中关闭示例图像。不要重命名提取的粒子集。选择 Generate Seeds"并打开包含提取的粒子数据的文件夹。

设置引用通道并选择应为其生成种子的所有通道。如果需要匹配以前的模型，请将种子旋转 90 度。对于粒子缺少中心最大值的通道，请像以前一样增加预对齐高斯模糊值。

如果通道未紧密对齐，请为非参考通道启用移位校正。在粒子序列中搜索一致出现的结构。确定代表性粒子，并在 Frames to use 字段中输入相应的帧编号。

查看生成的种子。种子选择是该程序的关键阶段。仔细查看原始数据，以确定要建模的一个或多个结构。

模型质量在很大程度上取决于选择准确反映这些结构的种子。根据需要调整参考通道、高斯模糊半径和偏移校正，以优化对具有相似种子的其他帧的识别。继续添加帧并调整生成参数，直到平均结构最能代表数据中观察到的结构。

输入种子的文件夹名称和文件前缀。单击"确定"保存种子图像以供以后建模。选择 Generate Models Based On Seeds"并打开提取的粒子文件夹。

加载每个通道的种子平均值。如果执行基于参考的结构发现，请选择一个参考通道进行对齐。一个通道中的已知粒子结构可以用作对齐第二个未知通道的参考。

这允许对未知结构进行无偏映射。请记住，必须事先校正通道之间的色移。如果分析在模型中查找微小的差异或细微特征，请选择 Square image intensity during template matching（在模板匹配期间方形图像强度）。

将最小相似度设置为介于 60% 和 80% 之间，并将迭代次数设置为 1。选择要在计算过程中显示的模型和粒子，并生成预览模型。检查预览模型。

增加最小相似度以仅包含具有所需形态的粒子。根据需要优化其他模型计算参数，并在模型生成过程中选择要显示的其他元素（如果需要）。预览模型令人满意后，将迭代次数增加到 10 次。

设置文件夹名称和文件前缀。单击 OK（确定）以保存包含最终模型的所有迭代的模型演变堆栈。通过结构照明显微镜对具有两种标记有绿色和红色荧光蛋白的蛋白质的重组牛痘病毒进行成像，并使用 VirusMapper 插件进行建模。

分别为正面和矢状方向生成种子，每个种子由五个代表性颗粒平均。根据病毒的方向，可以区分一个或两个侧体。因此，可以为两个方向生成单独的模型。

在尝试此过程时，请务必记住，模型的质量在很大程度上取决于所获取的原始数据的质量。虽然单颗粒分析可以提高精度，但它无法补偿低质量的图像。按照此过程，可以对这些模型进行进一步的量化或模型拟合。

这可以帮助回答其他问题，特别是围绕感染过程中病毒结构的纳米级变化。看完这个视频，你应该对如何使用单粒子分析软件 VirusMapper 从超分辨率图像生成分子结构模型有了很好的了解。